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超嗜热古菌PINA蛋白的生化性质和功能及其甲基化修饰研究

2020-12-09阅读(218)

超嗜热古菌PINA蛋白的生化性质和功能及其甲基化修饰研究

论文摘要

实验室前期从冰岛硫化叶菌（Sulfolobus islandicus REY115A）中发现并鉴定了一种新型ATP酶,命名为SisPINA,它能够在体外驱动Holliday junction DNA（HJ）迁移,与HJ特异性核酸内切酶Hjc具有物理上和功能上的相互作用,并协调HJ加工。结构分析表明ATP的结合和水解会引起SisPINA构象发生变化,促进HJ分支迁移（branch migration）。然而,SisPINA在HJ加工和处理中如何与其它蛋白协同发挥作用以及它参与古菌同源重组修复的具体过程还不太清楚,因此,我们需要更多的生物化学、结构和功能研究来充分了解该蛋白质的性质,并揭示古菌中同源重组修复的机制。为了进一步拓展SisPINA的功能,我们首先通过Pull-down分析和分子筛验证发现SisPINA和SisHjm具有很强的物理相互作用。实验结果还显示SisPINA羧基端II-KH结构域是与其它蛋白相互作用的重要部位,而SisHjm的第五个结构域不是它与SisPINA相互作用的部位。目前已有很多关于古菌蛋白甲基化修饰的报道,其中赖氨酸的甲基化修饰方面的研究较多,如嗜酸热S.acidocaldarius中的铁氧还原蛋白,硫磺矿S.solfataricus中的谷氨酸脱氢酶、β-糖苷酶、核糖体蛋白L11、天冬氨酸转氨酶、Sso7d2和RFC大、小亚基,冰岛硫化叶菌S.islandicus中的Cren7和Sso7d等都发生不同程度的甲基化修饰。甲基化修饰在古菌中广泛存在,暗示甲基化修饰在古菌中具有重要生理作用。我们尝试鉴定SisPINA在细胞内的翻译后修饰。冰岛硫化叶菌本底水平表达的SisPINA的质谱验证结果显示,在正常生理条件下SisPINA在细胞内发生磷酸化和甲基化修饰,甲基化修饰主要发生在羧基端的赖氨酸（K474、K479、K498和K500）。前期证明羧基端参与蛋白间的相互作用,我们验证该区域的修饰是否调控与其它蛋白的相互作用或具有其他功能。过表达赖氨酸位点突变PINA（K474A/K479A/K498A/K500A）菌株生长曲线表明甲基化修饰不影响蛋白的生长速率。差式量热分析（DSC）实验发现SisPINA蛋白甲基化修饰不影响蛋白的热稳定性。通过等温滴定量热法（ITC）定量测定模拟甲基化修饰的SisPINA蛋白（K474M/K479M/K498M/K500M）与其他蛋白结合力时发现滴定曲线很平缓,有可能是蛋白浓度过低导致,但当我们提高蛋白浓度时,发现蛋白会发生沉淀,因此我们需要其他方法来定量测定蛋白间的结合力。体外甲基化反应后质谱鉴定发现,甲基化转移酶aKMT蛋白可以甲基化SisPINA蛋白,但在体外用Pull-down和分子筛分析两者相互作用时,发现两者并没有相互作用,可能是两者在体内只发生功能性的结合。我们利用Pull-down实验来检测SisPINA野生型蛋白和甲基化模拟蛋白与Hjm、RFCs的相互作用时发现,与野生型SisPINA蛋白相比,SisPINA甲基化模拟蛋白失去了与RFCs和Hjm的相互作用,可能初步说明甲基化修饰会抑制蛋白间的相互作用。接着我们将这四个赖氨酸位点突变为丙氨酸,Pull-down实验表明,SisPINA（K474A/K479A/K498A/K500A）和 Hjm（RFCs）也没有相互作用,说明这四个赖氨酸位点是蛋白间相互作用的重要部位,之后为了进一步确定准确的相互作用部位,我们分别纯化了赖氨酸单突变体蛋白,利用Pull-down实验验证单个位点突变对蛋白间相互作用的影响,发现单突变体不影响蛋白间的相互作用,说明四个赖氨酸位点协同影响蛋白间的相互作用。甲基化修饰是否是SisPINA在细胞内行使功能必需的,甲基化修饰对SisPINA细胞内功能的影响还需要进一步的研究。我们分析了广古菌Thermococcus kodakaraensis KOD1基因组编码SisPINA的同源物序列,发现T.kodakaraensis中编码PINA蛋白的序列位于CRISPR序列附近,且CRISPR序列潜在可以形成HJ结构,猜测TkoPINA（Tko 0953）可能参与CRISPR相关功能。虽然实验发现TkoPINA与CRISPR序列具有很强的结合活性,但与其它单链DNA、双链DNA和HJ也有很强的结合活性。接下来我们利用Pull-down检测了 TkoPINA蛋白与邻近蛋白的相互作用,发现TkoPINA蛋白与GTP酶（Tko 0951）具有很强的结合能力,而与膜位点决定蛋白MinD（Tko 0952）、膜形成抑制蛋白Maf（Tko 0954）（两者与细胞分裂有关）无明显相互作用。体外生化实验发现MinD具有内切酶活性,且TkoPINA可以抑制MinD的内切酶活性,但两者在体内的作用机制还不太清楚。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词表
  • 第一章 绪论
  •   1.1 古菌概述
  •     1.1.1 古菌概述
  •     1.1.2 硫化叶菌概述
  •     1.1.3 热球菌概述
  •   1.2 DNA双链断裂修复
  •     1.2.1 非同源末端连接
  •     1.2.2 同源重组修复
  •     1.2.3 古菌中同源重组修复研究进展
  •   1.3 复制叉停滞及修复
  •   1.4 蛋白翻译后修饰
  •     1.4.1 蛋白翻译后修饰概述
  •     1.4.2 蛋白翻译后甲基化修饰
  •     1.4.3 古菌中蛋白翻译后甲基化修饰研究进展
  •   1.5 ATP酶PINA介绍
  •     1.5.1 PINA的发现及分布
  •     1.5.2 SisPINA研究进展
  •     1.5.3 KH结构域
  •   1.6 本课题的研究目的和意义
  • 第二章 冰岛硫化叶菌中PINA和Hjm的相互作用分析
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株和质粒
  •     2.1.2 培养基和试剂
  •     2.1.3 缓冲溶液
  •     2.1.4 主要药品和仪器
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 SisPINA野生型以及突变体蛋白表达载体的构建
  •     2.2.2 SisHjm野生型以及缺失突变体表达载体的构建
  •     2.2.3 SisPINA以及突变体蛋白的表达与纯化
  •     2.2.4 SisHjm以及突变体蛋白的表达与纯化
  •     2.2.5 Pull-down实验验证Hjm与SisPINA（野生型与突变体）蛋白间的相互作用
  •     2.2.6 利用分子筛验证Hjm与SisPINA（野生型与突变体）蛋白间的相互作用
  •   2.3 实验结果
  •     2.3.1 SisPINA以及突变体表达载体的构建
  •     2.3.2 SisHjm野生型以及缺失突变体表达载体的构建
  •     2.3.3 SisPINA以及突变体蛋白的表达纯化
  •     2.3.4 SisHjm以及突变体蛋白表达纯化
  •     2.3.5 SisPINA和SisHjm的相互作用验证
  •   2.4 本章小结与讨论
  • 第三章 SisPINA翻译后甲基化修饰功能研究
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 菌株及质粒
  •     3.1.2 实验所需培养基及试剂
  •     3.1.3 aKMT蛋白纯化缓冲液
  •     3.1.4 实验药品和仪器
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 菌株构建及SisPINA氨基端6×组氨酸标签蛋白的纯化
  •     3.2.2 SDS-PAGE和Western-Blot分析SisPINA氨基端6×组氨酸标签蛋白
  •     3.2.3 载体构建
  •     3.2.4 pSeSD-SisPINA-K474AK479AK498AK500A电转入E233S细胞
  •     3.2.5 质谱鉴定SisPINA蛋白甲基化和磷酸化修饰位点
  •     3.2.6 冰岛硫化叶菌中过表达SisPINA和SisPINA-K474AK479AK498AK500A及生长曲线测定
  •     3.2.7 aKMT、SisPINA以及SisPINA突变体蛋白的表达纯化
  •     3.2.8 aKMT和SisPINA体外甲基化反应
  •     3.2.9 差式量热分析（DSC）验证甲基化修饰对SisPINA蛋白热稳定性的影响
  •   3.3 实验结果及分析
  •     3.3.1 载体构建
  •     3.3.2 硫化叶菌SisPINA氨基端6×组氨酸标签蛋白的纯化及Western-blot验证
  •     3.3.3 SisPINA的磷酸化修饰和甲基化修饰鉴定
  •     3.3.4 SisPINA及其同源蛋白羧基端的氨基酸序列分析
  •     3.3.5 aKMT蛋白表达与纯化
  •     3.3.6 SisPINA-N-his蛋白表达与纯化
  •     3.3.7 SisPINA模拟甲基化蛋白及单突变体蛋白的表达与纯化
  •     3.3.8 Pull-down实验证明aKMT蛋白和SisPINA蛋白的相互作用结果及分析
  •     3.3.9 SisPINA的体外甲基化及其质谱鉴定
  •     3.3.10 赖氨酸位点突变体过表达菌株生长曲线的测定
  •     3.3.11 Western-blot验证SisPINA蛋白表达情况
  •     3.3.12 差式量热分析（DSC）验证甲基化修饰对SisPINA蛋白热稳定性的影响
  •     3.3.13 Pull-down实验验证甲基化修饰的SisPINA对其相互作用的影响
  •     3.3.14 Pull-down实验验证SisPINA四突变体与Hjm和RFCs的相互作用
  •     3.3.15 Pull-down实验验证SisPINA单突变体与Hjm和RFCs的相互作用
  •   3.4 本章小结与讨论
  • 第四章 热球菌KOD1中TkoPINA的功能以及与邻近蛋白相互作用分析
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 菌株及质粒
  •     4.1.2 培养基
  •     4.1.3 缓冲液
  •     4.1.4 实验试剂和仪器
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 载体构建
  • 0951、Tko0952、Tko0954的表达纯化'>    4.2.2 TkoPINA以及其上游三个邻近蛋白Tko0951、Tko0952、Tko0954的表达纯化
  •     4.2.3 DNA底物准备
  •     4.2.4 ATPase活性的检测
  •     4.2.5 凝胶阻滞（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）实验
  •     4.2.6 Pull-down验证蛋白间的相互作用
  •     4.2.7 TkoPINA及邻近蛋白核酸酶活性检测
  •   4.3 实验结果及分析
  •     4.3.1 载体构建
  • 0951蛋白表达与纯化'>    4.3.2 Tko0951蛋白表达与纯化
  • 0952蛋白表达与纯化'>    4.3.3 Tko0952蛋白表达与纯化
  •     4.3.4 TkoPINA蛋白表达与纯化
  • 0954蛋白表达与纯化'>    4.3.5 Tko0954蛋白表达与纯化
  • 0951和TkoPINA的相互作用'>    4.3.6 Pull-down实验验证Tko0951和TkoPINA的相互作用
  • 0952和TkoPINA的相互作用'>    4.3.7 Pull-down实验验证Tko0952和TkoPINA的相互作用
  • 0954和TkoPINA的相互作用'>    4.3.8 Pull-down实验验证Tko0954和TkoPINA的相互作用
  • 0951和TkoPINA的相互作用'>    4.3.9 分子筛分析验证Tko0951和TkoPINA的相互作用
  •     4.3.10 TkoPINA的ATP酶活性检测
  •     4.3.11 TkoPINA及邻近蛋白与CRISPR序列的结合活性检测
  •     4.3.12 TkoPINA及邻近蛋白外切酶活性检测
  •     4.3.13 蛋白与HJ的结合活性检测
  •   4.4 本章小结与讨论
  • 第五章 全文总结与展望
  •   5.1 全文总结
  •   5.2 展望
  • 附录
  •   附录一 本文所用PCR引物
  •   附录二 硫化叶菌基础盐溶液
  •   附录三 硫化叶菌维生素混合液
  •   附录四 本实验所需药品与试剂
  •   附录五 实验主要仪器
  •   附录六 实验试剂
  •   附录七 冰岛硫化叶菌E233S电转方法
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • 学位论文评阅及答辩情况表

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 韩小云

    导师: 申玉龙

    关键词: 冰岛硫化叶菌,小笠原岛热球菌,同源重组修复,蛋白翻译后修饰

    来源: 山东大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 山东大学

    分类号: Q936

    总页数: 105

    文件大小: 8529K

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