张长征[1]2004年在《抗除草剂草甘膦基因导入玉米自交系的研究》文中研究表明本研究以玉米优良自交系综31为受体材料，用PDS1000/He基因枪将抗除草剂草甘膦基因(EroA)导入其中，对玉米愈伤筛选不同次数的筛选效果和继代不同次数的愈伤在不同培养基上的分化做了初步的研究，并对T_0代和T_1代进行了分子鉴定，还对玉米田间自然状态杂草发生和自交系综31及杂草在田间水平上对草甘膦的耐受度进行了调查，确定了筛选时期和筛选浓度，并在此基础上对T_1代植株进行了除草剂田间抗性鉴定。主要结果如下： 采用五点取样法，在田间随机取样，每个样点0.2平方米，调查了玉米田间的杂草种类及其发生规律。调查结果显示，在科学园玉米田间，有11种杂草，涉及六个科属。 对玉米的生育期和杂草发生情况对比结果显示，在当年春季玉米叁四叶期时杂草发生达到峰值。草甘膦在玉米叁叶一心时对玉米和杂草的喷施效果表明，1.2g/l的浓度时对杂草的防治效果良好，对玉米接近致死浓度，所以确定筛选时期选择在玉米叁叶一心时期，浓度为1.2g/l。 将Ubiquitin启动子构建的抗草甘膦基因导入优良玉米自交系综31的愈伤，对愈伤筛选次数效果的研究结果表明，筛选两次与筛选多次没有差异，并且筛选两次愈伤组织在分化能力和幼苗的出苗率上都衰退的不是很严重，所以筛选两次效果较好。 不同时期的愈伤用11种不同的分化培养基进行分化，结果显示各个继代时间的愈伤都在F培养基上分化情况较好，但苗较弱。 将Ubiquitin启动子构建的抗草甘膦基因导入优良玉米自交系综31的幼胚或愈伤组织，得到456个结实的再生植株。PCR扩增结果显示其中153株扩增出特异目标条带，其中134株为结实植株。PCR-Southern检测结果与PER相同。部分样品Southern检测结果也说明外源基因已整合到玉米基因组中。部分样品的RT-PCR结果说明外源基因在转基因植株中能够转录。 将T_0代的12640多粒种子种植于国家玉米改良中心海南南繁基地，于五叶期叶面喷1.2g/l的草甘膦，结果剩下十株。其中八株死亡未散粉，两株回交结实。 实验室内盆育部分种子T_1小苗，进行分子检测，PCR，Sourthern结果显示部分外源基因已传到T1代中。
方芳[2]2012年在《农杆菌介导的抗草甘膦基因2mg2-epsps转化玉米自交系18-599R的研究》文中认为玉米是世界上主要的叁大粮食作物之一,同时也是重要的饲料作物。随着世界人口持续的增长以及畜牧业的稳步发展、生物能源的大规模推广,玉米的刚性需求不断加大。杂草危害是玉米减产的主要原因之一,化学除草在杂草防除种占主导地位。草甘膦是全世界使用量最大的除草剂品种,在农业生产上被广泛应用,然而草甘膦作为一种灭生性除草剂,对农作物同样有着杀死作用,这就限制了其使用范围和使用时间。利用基因工程技术培育抗草甘膦玉米将有效解决上述矛盾。本研究将抗草甘膦基因2Lng2-epsps连接到植物表达载体pCAMBIA3301中,利用农杆菌介导法侵染胚性愈伤组织,将该基因即作为筛选标记又作为目的基因导入西南地区玉米骨干自交系18-599R中,获得了抗性植株。通过对转基因后代的PCR、PCR产物测序、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(qRT、-PCR)检测鉴定,表明外源基因已整合到玉米基因组染色体中,在根茎叶等营养器官中稳定表达。对T2代转基因植株进行抗性鉴定,结果表明转基因后代具有一定的草甘膦抗性,能有效减轻草甘膦除草剂对植株的毒害作用。主要结果如下1.构建植物表达载体p3301-2mg2-epsps。将植物表达载休pCAMBIA3301中的Gus报告基因置换为抗草甘膦基因2mg2-epsps,改造后的植物物表达载体p3301-2mg2-epsps以2mg2-epsps基因作为遗传转化的筛选标记基因及目的基因,办保留多克隆酶切位点,方便在以后实验中插入其他目的基因,构建多价植物表达载体。2.利用农杆菌介导法转化玉米自交系18-599R的胚性愈伤组织,经2-3轮草甘膦梯度筛选,淘汰褐化愈伤组织,将得到的抗性愈伤再分化、生根、壮苗、移栽,共获得抗性植株139株,对T0代转基因植株进行PCR检测,结果表明其中4株为阳性植株。测序结果显示从玉米阳性转基因植株中增的目的基因序列与2mg2-epsps基因序列完全匹配。3.确定了草甘膦除草剂对自交系18-599R胚性愈伤组织的筛选浓度。确定了梯度筛选的筛选浓度分别为1mmol/L、1.5mmol/L,为以抗草甘膦基因因2mg2-epsps为筛选标记基因、18-599R胚性愈伤组织为转化受体的遗传转化系统提供了有效、安全的筛选体系。4.对T1代146株植株进行PCR检测,其中62株呈阳性,阳性率为42.7%。对部分T2代转基因植株进行PCR鉴定,56株转基因后代有33株呈阳性,阳性率为58.9%，表明外源外源目的基因已经整合到转基因-玉米基因组中,并稳定遗传。对T2代PCR检测为阳性的植株提取叶片、茎、根部总RNA,以反转录后的cDNA第一链为模板进行RT-PCR检测,所有阳性植株根、茎、叶均扩增出750bp的特异条带,结果表明抗草甘膦基因在mRNA水平上得到了有效转录。对转基因植株的根、茎、叶的实时荧光定量结果显示,2mg2-epsps抗草甘膦基因在上述部位稳定表达。5.对T2代转基因植株及离体叶片进行抗性鉴定,结果表明叁叶一心期的转2mg2-epsps基因植株对1.5g/L的草甘膦溶液具有较好的耐受能力,离体叶片能在5mmol/l筛选培养基上保持颜色不变。
王蕾[3]2012年在《转EPSPS基因水稻的研究》文中研究指明在水稻生长过程中,杂草与水稻争夺良好的生长环境,严重制约水稻的产量,同时也不同程度的影响着水稻的品质,增加了病虫害的传播.随着除草剂的广泛应用,快速有效的除草剂能够抑制杂草对水稻的影响,但同时除草剂的残留对水稻造成了严重的负面影响。导致水稻不同程度的减产,产量降低,品质变劣。常规的育种方法育种周期长,育种率较低,品种抗性资源缺乏,品种抗性持久性差,难以满足人们的需求。采用高效快速的生物技术与常规育种相结合的技术手段为培育水稻抗性新品种及丰富水稻种质资源开辟了新途径。近年来,转基因技术被广泛应用于作物抗性。育种中,在众多抗除草剂基因中,抗除草剂草甘膦EPSPS基因越来越受到人们的青睐。EPSPS基因是草甘膦唯一的作用靶点,同时草甘膦是一种广谱性的除草剂,在灭杀杂草的同时对农作物表现出非选择的灭杀性。EPSPS的高度表达对草甘膦具有很强的耐受性。随着生物技术的发展,应用基因工程技术生产的抗除草剂草甘膦EPSPS基因,对提高水稻品质和产量有着重要意义。本实验研究,应用农杆菌介导法将以色列二叶短柄草中的EPSPS基因导入水稻品种吉农大838中,获得了具有抗除草剂草甘膦的水稻植株,分子检测验证了外源基因的存在并转录成功。通过PCR方法成功扩增了材料基因组中的EPSPS基因,并添加了适当的酶切位点。将EPSPS基因替代了植物表达载体pCAMBIA3301中的bar基因,构建了植物表达重组载体pCAMBIA33E1。通过农杆菌介导方法,将目的基因转化到水稻中,通过抗生素筛选获得了抗性植株,应用PCR分子检测可证实外源基因EPSPS已被整合到水稻基因组中,对其进行的RT-PCR检测出目的基因在水稻中已经成功转录。通过叶面涂抹草甘膦证明了转基因水稻植株具有草甘膦抗性。
王玲玲[4]2014年在《耐草甘膦基因2mg2-epsps转化筛选体系的优化》文中进行了进一步梳理草甘膦是一种莽草酸途径中5'-烯醇式丙酮酸莽草酸-3'磷酸合酶(EPSPS)活性的竞争性抑制剂,属于非选择性的除草剂。1976年美国孟山都公司的开发了草甘膦类除草剂—农达(Roundup),并得到广泛应用,作物抗草甘膦转基因研究相继成为抗除草剂基因工程研究的热点。目前推广的抗草甘膦作物品种几乎都是由孟山都研发,抗草甘膦转基因作物种子和农药农达捆绑式销售,使得孟山都公司多年独霸抗草甘膦作物种子和草甘膦农药市场。因而,培育出具有中国产权的抗草甘膦除草剂的玉米,也是我国抗除草剂转基因研究的关键。本实验主要是在前人研究的基础上,以自交系18-599R为遗传转化受体材料,对耐草甘膦基因2mg2-epsps转化筛选体系进行优化。通过农杆菌介导法进行介导转化,对愈伤筛选过程中的草甘膦浓度及分化过程中的光照强度进行了优化,提高转化效率,扩大转基因事件发生的基数,为研究新型高抗草甘膦转基因玉米新品种提供基础材料。对比草丁膦与草甘膦筛选,研究了不同筛选剂对抗性愈伤分化的影响。对转基因株系进行抗性筛选、PCR检测及测序验证,表明目的基因已经整合到玉米基因组中；通过TAIL-PCR法找到了1号转基因株系(T3代)T-DNA的在玉米基因组的整合位点。主要结果如下：1.抗性愈伤筛选过程中草甘膦浓度的确定使用不同浓度的草甘膦对侵染后的幼胚及未侵染的幼胚进行筛选,统计愈伤成活率及愈伤平均质量增加百分比,确定第一次筛选比较理想的草甘膦除草剂使用浓度应为0.5-0.6mmol/L,为愈伤的生长提供一个缓适期,第二次筛选比较理想的草甘膦除草剂使用浓度应为1.5mmol/L。2.草甘膦对分化的影响为研究草甘膦对分化的影响,将相同大小的幼胚侵染后分别接种到草甘膦、草丁膦筛选培养基上培养,然后接种在不含矮壮素的分化培养基上分化,草甘膦筛选的抗性愈伤分化出的幼苗节间比较短,株高比较矮,草丁膦筛选的抗性愈伤分化出的幼苗节间比较长,株高比较高,因而草甘膦对愈伤的分化有一定的滞后效应。3.光照强度对愈伤分化的影响本实验主要通过对比抗性愈伤在1600-20001x的弱光下与55001x-60001x的强光下的分化,光照3d,抗性愈伤均出现绿点,两种光照处理无大差异；最终,16001x-20001x弱光下有19%抗性愈伤分化小苗,5500-60001x强光下有2.5%抗性愈伤分化出小苗,大部分愈伤绿色加重,或呈现白色硬壳；因而,相比较而言16001x-20001x弱光有利于抗性愈伤的分化。4.T-DNA侧翼序列的扩增田间使用草甘膦农药筛选转基因玉米材料,筛选成活植株,经PCR检测并测序验证,2mg2-epsps基因已经整合到玉米基因组中。通过TAIL-PCR法,1号转基因株系扩增出了T-DNA左侧侧翼序列;设计引物进行PCR验证,验证结果表明,扩增出的侧翼序列为特异性序列。T-DNA侧翼序列比对上了玉米基因组的多个位点。
孙越, 刘秀霞, 李丽莉, 官赟赟, 张举仁[5]2015年在《抗亚洲玉米螟、抗草甘膦转基因玉米的培育》文中研究指明5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,epsps)是一个高抗草甘膦的基因,苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫蛋白基因(Bt基因)cry1Ac M是一个能在单子叶植物中高效表达的抗亚洲玉米螟基因。为了获得具有抗虫、抗除草剂优良复合性状的转基因玉米,本研究构建出质粒p CAMBIA1302-P35S::epsps-Tnos-Pubi::cry1Ac M-Tnos,通过农杆菌(Agrobacterium tumefacien)介导的玉米(Zea mays)茎尖遗传转化法将目标基因转入玉米。通过分子检测、草甘膦抗性筛选和田间接种亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis(Guenée))试验筛选出转基因株系,在此基础上进行了转基因植株室内抗亚洲玉米螟试验和田间草甘膦抗性分析,并采用RT-PCR检测和Western blot方法确定了抗虫蛋白在转基因植株中稳定表达。从大量转基因株系中优选出6个遗传稳定且抗亚洲玉米螟、抗除草剂草甘膦的转基因玉米株系,这些株系的抗亚洲玉米螟、抗草甘膦特性完全满足大田应用的需求。综上所述,将改造后的Bt抗虫基因cry1Ac M和抗草甘膦基因epsps一同转入玉米,赋予两种玉米骨干自交系植株抗玉米螟、抗草甘膦特性,为我国抗亚洲玉米螟抗草甘膦转基因玉米的大面积推广培育出了优良自交系。
张玲[6]2016年在《抗草甘膦转基因玉米的抗性鉴定、遗传分析及回交转育》文中提出玉米作为世界上仅次于水稻和小麦的第叁大粮食作物,是非常重要的饲料、工业原料及生物能源。田间的杂草与玉米植株争夺空间、阳光、水分和养分等,并能传播一些病虫害,杂草的危害能使玉米大幅度地减产,严重影响玉米产业的发展。通过转基因方式获得抗除草剂的玉米,可以实现防治杂草的同时,不对农作物造成伤害。但受基因型限制,适合于遗传转化的受体材料有限,转化周期长、转化率低,且通过遗传转化获得的自交系植株的综合性状通常不优良,往往难以直接应用于生产。因此,通过回交的方法将目标基因导入到综合农艺性状优良的背景材料中,获得既具有优良的外源目标基因性状,又综合性状优良的品种是非常必要和重要的。本研究以转入具有自主知识产权的抗草甘膦基因2mg2-epsps的高抗玉米自交系18-599R的T_3代玉米材料为供体,与目前大面积推广或具有应用前景的农艺性状优良的玉米杂交品种亲本SH008、Mo17、R08、R18、RP125和RP128杂交和连续回交。期望获得能稳定遗传的综合性状优良的转基因抗草甘膦玉米,以应用于实际生产中。对F1、BC_1和BC_2代玉米材料(叁叶期),田间喷施草甘膦进行表型鉴定,并在BC_1和BC_2代材料喷施草甘膦后,田间统计成活植株数目和枯死植株数目,分析其抗性分离比,对外源基因进行遗传分析。此外,通过PCR.RT-PCR和试纸条检测,分别从DNA水平、转录水平和蛋白质水平对回交后代材料进行分子鉴定。本研究的主要结果如下：1.田间表型鉴定和统计：6个轮回亲本的BC_1和BC_2代材料喷施草甘膦后,抗性分离明显,统计分析结果表明BC_1代材料中SH008不符合1:1的分离比,BC_2代中RP125材料不符合1:1的分离比,其余材料都符合一对显性等位基因控制的孟德尔遗传规律。2.PCR检测结果：BC_1和BC_2代部分材料通过PCR鉴定,均检测到了目的条带。表明通过回交,目的基因导入了受体亲本材料。3.RT-PCR检测及测序结果：对任意选择的叁种背景的材料,即SH008、RP125和RP128的BC_1和BC_2代材料PCR检测,并将目的条带回收测序,测序结果与2mG2-epsps基因序列进行比对。结果表明SH008和RP125的BC_1和BC_2代材料PCR扩增的目的序列与2mG2-epsps基因序列一致性为100%,RP128回交后代材料PCR扩增目的序列与2mG2-epsps基因序列一致性为99%。提取序列比对结果一致植株的RNA,进行RT-PCR检测,均检测出目的条带,表明目的基因在回交后代材料中正常转录。4.试纸条检测蛋白结果：试纸条检测6个轮回亲本的部分BC_1和BC_2代材料,首先进行PCR检测,均扩增出目的条带。试纸条检测发现SH008的BC_1、RP128的BC_1和RP128的BC_2代材料未检测到目的蛋白。其它材料均检测到了目的蛋白。未检测到目的蛋白的原因可能是这叁个样品中蛋白含量较少,不满足试纸条检测的灵敏度。在后续的实验中,有必要再通过其它方法进行蛋白质水平的鉴定。
刘雪梅[7]2013年在《农杆菌介导的抗草甘膦基因对玉米自交系18-599幼胚的遗传转化》文中认为玉米作为叁大粮食作物之一,在饲料生产中扮演重要的角色,也为生物能源制造提供良好原材料；伴随人口的增长、人民生活水平的提高,以及畜牧业的极速发展,对玉米需求量显着增加。田间的杂草与玉米竞争阳光和肥料,形成草害,引起减产,严重制约了玉米产量的增加。人工拨草和机械除草费时费力且效果不理想；化学除草方便、经济有效,业已成为现代农业技术重要组成部分。目前,全世界农业生产中使用量最大最广泛的除草剂是草甘膦。由于草甘膦杀草谱比较宽,对玉米也具有灭生性作用,这就使在玉米生产中使用草甘膦受到限制。因此,培育出具有自主知识产权的抗草甘膦的玉米新品种,进行试验、示范、推广,能降低除草成本和劳动强度、提高工作效率、增强我国玉米的国际市场竞争力。本研究主要是将抗草甘膦的抗性基因2mg2-epsps插入到植物表达载体pCAMBIA3301中,以农杆菌菌株EHA105携带含有目的基因的表达载体进行介导转化,遗传转化受体材料为自交系18-599R的幼胚；实验首先探讨了热激与离心对幼胚浸染的影响,并对农杆菌转化玉米幼胚过程中幼胚大小、筛选剂浓度,头孢霉素浓度等因素进行优化,为建立良好的玉米幼胚转化体系奠定基础；获得抗草甘膦转基因玉米植株,并进行的PCR检测与产物测序,结果表明目的基因已整合到玉米基因组中；对阳性植株进行叶面喷施草甘膦,结果表明转基因玉米后代具有草甘膦抗性。主要研究结果如下：1目的基因的获得。以表达载体P35S-2301-EPSPS为模板,用高保真酶扩增获得目的基因片段并测序,利用NCBI的在线软件Blast、ORF Finder分析,结果表明,扩增的序列全长为1563bp,编码464个氨基酸；与原始载体基因碱基序列同源性为99%,氨基酸序列匹配度为100%。2表达载体构建。将构建好pMD19T-2mg2-epsps载体和pCAMBIA3301表达载体同时进行双酶切,回收目的片段并进行连接转化；经酶切、测序验证结果表明所连接确实为目的片段,没有发生突变。3玉米幼胚遗传转化系统的优化。首先探讨了热激与离心对幼胚浸染的影响,并对农杆菌转化玉米幼胚过程中幼胚大小、头孢霉素浓度、筛选剂浓度等因素设置不同水平处理,结果表明：最适合的处理条件为热激40℃,3min,冷处理25℃,2min,不离心,此处理得到最高的抗性愈伤得率为52%；浸染的幼胚大小为0.8-1.3mm时,可以得到质地较好的愈伤组织；头孢霉素为400mg/L的浓度的不仅可以抑制农杆菌生长,还可以保持幼胚良好的生长状态；利用不同浓度的草甘膦对浸染的幼胚进行筛选,比较理想的筛选浓度为1.5-2.0mmol/L。4转基因苗的PCR鉴定。对96株To代再生植株进行多次重复的PCR鉴定,15株再生植株的基因组DNA扩增出与阳性对照大小一致的的片段,表明目的基因已经成功转入玉米基因组中；T1代株系进行PCR检测,获得四株转基因株系,这些阳性的株系经RT-PCR检测,表明抗草甘膦基因在mRNA水平上得到了有效转录；对阳性植株进行叶面喷施草甘膦,结果表明转基因玉米后代具有草甘膦抗性。。
赵锦慧[8]2005年在《玉米抗草甘膦突变体的筛选及成熟胚培养的初步研究》文中进行了进一步梳理杂草是玉米生育早期的主要危害,而草甘膦是一种广泛应用的高效低毒芽后灭生性除草剂,筛选抗草甘膦突变体及选育抗草甘膦品系具有重要的意义。本试验通过理化诱变筛选与体细胞筛选相结合的方法进行玉米抗草甘膦突变体的筛选工作。 理化诱变筛选结果表明:经诱变处理的自交系112当代出现多种变异,物理诱变能明显降低株高和穗位,900ppm的草甘膦溶液是筛选突变体和防除杂草较为理想的喷洒浓度,通过筛选得到了抗草甘膦突变植株,但没有得到种子。 在体细胞筛选中,首先诱导幼胚产生愈伤组织,然后把经过扩繁的愈伤组织放入含有草甘膦的N6培养基中继代培养叁次,筛选出抗性愈伤组织后再转入不含草甘膦的培养基中恢复培养叁次,而后抗性愈伤组织分化成苗。体细胞筛选采用了等浓度筛选法和梯度筛选法。根据不同草甘膦浓度下愈伤组织的死亡率及Ⅱ型愈伤组织所占比例确定了筛选的起始浓度和最高浓度。等浓度筛选法设定的草甘膦筛选浓度为300ppm-300ppm-300ppm、400ppm-400ppm-400ppm、500ppm-500ppm-500ppm,梯度筛选法为150ppm-200ppm-300ppm、200ppm-300ppm-400ppm、300ppm-400ppm-400ppm。两种方法相比,梯度筛选法更有利于保持愈伤组织的胚性和幼苗分化。 将经过筛选并恢复培养叁次得到的抗性愈伤组织和对照放于含有草甘膦的培养基上,初步确认了得到的愈伤组织对草甘膦具有一定抗性。对抗性愈伤组织和对照的再生苗进行田间喷洒草甘膦鉴定,对照再生苗全部死亡,抗性愈伤组织的再生苗3棵存活,其余死亡,存活的再生苗即是抗草甘膦突变体。 在成熟胚愈伤组织的诱导与继代试验中,以28个基因型的玉米成熟胚为试验材料,初步研究了培养基种类、基因型、消毒时间、切胚方式、变温处理、蔗糖质量浓度、酸水解酪蛋白质量浓度、2,4-D质量浓度等因素对愈伤组织诱导与继代的影响,结果表明:N6和MN两种培养基对愈伤组织的诱导无显着差异,但对愈伤组织的继代培养有较大影响,其余7个因素对愈伤组织的诱导与继代都有明显影响。最终选出了3个高培养力材料,确定了比较适合成熟胚愈伤组织诱导与继代的培养基。
宋红霞[9]2016年在《抗草甘膦转基因玉米的研究》文中提出玉米(Zea mays L.)作为世界叁大粮食作物之一,是重要的粮食作物、饲料以及工业加工原料。而杂草是玉米减产的主要危害之一,在玉米生长过程中会争夺水分,养分和阳光,并且引起病虫害的发生。因而研究如何有效经济的控制玉米田间杂草具有重要意义。随着生物技术的发展,利用基因工程的手段获得抗草甘膦作物新品种已成为最理想的手段。自1998年,抗草甘膦转基因玉米品种GA21获得批准商业化种植以来,各种抗草甘膦、抗虫、抗病等优良性状的转基因玉米品种相继推出,转基因玉米是世界上种植面积最广的转基因粮食作物。本研究中利用超声波辅助花粉介导转化法和超声波辅助农杆菌介导萌发种子转化法两种方法将携带目的基因——抗草甘膦基因CP4-EPSPS的载体转入到玉米自交系昌7-2中。其中pM3301UbiSpCP4载体选用了组成型强启动子——玉米泛素启动子pZmUbi-1启动表达,同时该载体携带了叶绿体信号肽(Signal Peptide),有助于目的基因成功定位到叶绿体内,使得CP4基因在玉米叶绿体中更好的表达。另外这两种新型的转基因方法是以花粉和萌发的种子作为受体,避开了组织培养再生植株的过程,且无基因型依赖性,为广大育种工作者提供了简便经济且易于操作的两种种质创新途径。另外玉米自交系昌7-2作为目前生产中广泛使用的优良自交系,农艺性状良好,获得转基因株系后能最快应用于生产。主要研究结果如下:将构建好的载体pM3301UbiSpCP4利用超声波辅助花粉介导的转基因方法对1552株(T0代)玉米进行遗传转化,成功获得了943粒结实种子。对T1代出苗的648个转化株涂抹2%浓度的草甘膦进行田间鉴定筛选,有29株长势健康,表现出抗草甘膦的性状,通过PCR对这些株系进行目的基因检测,其中有16个株系扩增出阳性条带,RT-PCR显示16个阳性株系中外源基因CP4-EPSPS正常转录。同时进行了PCR-Southern blot检测,进一步证明了外源基因CP4-EPSPS稳定遗传到了T1代。T1代的16个株系自交后收获种子(T2代),对T2代部分转基因株系涂抹2%浓度的草甘膦,筛选出了5个抗性良好的转基因株系Anti-3,11,12,23,29。经PCR、Southern、ELISA检测结合田间抗草甘膦筛选试验,最终获得了3个高抗草甘膦、单拷贝且抗除草剂蛋白表达量较高的转基因玉米株系Anti-3,23,29。本研究为抗除草剂转基因玉米的研究奠定了基础,并为育种工作提供有价值的新种质。
靳传娣[10]2016年在《可变盐单胞菌EPSPS基因的突变和抗草甘膦玉米的培育》文中认为草甘膦因为其高效性、广谱性、内吸传导型、低毒等特点,是当今农业生产中使用面积最广、生产销量最大、最具商业价值的的一种除草剂。其作用的机制是通过竞争性的抑制植物莽草酸途径的关键酶5-烯醇丙酮莽草酸-3磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,简称EPSP合成酶)的催化作用阻断植物芳香族氨基酸的合成,进而导致植物失绿死亡。此外,由于草甘膦具有非选择性,在杀灭杂草的同时会对田间作物也造成伤害,所以通过分子育种途径培育抗草甘膦作物是杂草防治的重要手段之一。通过将抗草甘膦的EPSPS基因导入作物,可获得具有草甘膦抗性的转基因品种。玉米(Zea mays.L)作为全球产量最大的的粮食作物,同时又是重要的饲料、经济和能源作物,在全世界广泛种植。随着抗性杂草的不断产生,原有的除草剂使用效果欠佳,草害对玉米产量的影响愈发明显,培育抗草甘膦玉米对于提高玉米产量和品质有着重要的现实意义。本实验所用的抗草甘膦基因EPSPS来源于可变盐单胞菌(Halomonas varabilis)(简称H Var-EPSPS)。为了提高转基因玉米的的草甘膦抗性,首先对H.Var-EPSPS基因序列依据玉米密码子偏倚性进行优化,然后利用重迭延伸法对优化后的cDNA序列进行定点突变获得了两个修饰的H.Var-EPSPS基因序列,即EPSPSM1和EPSPSM2。EPSPSM1是将第295位碱基由胸腺嘧啶(T)突变为鸟嘌呤(G),第299位碱基由鸟嘌呤(G)突变为胞嘧啶(C),使其编码的氨基酸序列发生变化。即第99位丝氨酸(Ser)突变为丙氨酸(Ala),100位甘氨酸(Gly)突变为丙氨酸(Ala)。EPSPSM2是在EPSPSMl的基础上再将第292位碱基由鸟嘌呤(A)突变为胸腺嘧啶(T),即将第98位天冬酰胺(Ash)突变为酪氨酸(Tyr)。通过叁维结构预测发现,EPSPSM1和EPSPSM2在与底物结合的位点处构象发生了变化。为了验证突变后的H.Var-EPSPS是否能提高转基因玉米草甘膦抗性,分别将EPSPSM1和EPSPSM2基因插入以玉米ubiquitin启动子启动、水稻GluB5基因的3’UTR为终止子的表达插盒中,并将该插盒重组到以bar基因作为筛选标记的植物表达载体中。其中bar为依据玉米密码子偏倚性进行过优化的基因,由增强型CaMV35S启动子启动,以水稻GluB5基因的3’UTR终止。通过农杆菌介导的玉米无菌幼苗茎尖转化法,将两个带有目的基因的植物表达载体分别转化入玉米骨干自交系昌7-2中,获得了具有双重除草剂抗性的转基因玉米植株。转基因玉米的分子生物学验证首先利用PCR的方法检测转基因玉米的bar基因和EPSPSM1或EPSPSM2基因,确定它们已整合到了玉米基因组。在T1代抗性植株检测中,C72-M1的76株TO植株的自交后代中,有32个株系检测到bar基因和EPSPSM1基因,阳性率为42.1%；在C72-M2的70株T0植株自交后代中,有29个株系检测到bar基因和EPSPSM2基因,阳性率为41.4%。对T1代转基因阳性植株自交结籽,通过逐代的除草剂筛选和PCR检测获得了转基因纯合的T3代植株。然后通过Western Blot的方法检测转基因编码产物EPSPSM1和PSPSM2在T3代转基因植株中组成型表达。转基因玉米的除草剂抗性鉴定在转基因玉米除草剂抗性鉴定中,将本课题中产生的转基因玉米和未优化的H. Var-EPSPS转基因玉米、进行过玉米密码子偏倚性修饰的H.Var-EPSPS转基因玉米同时进行草甘膦处理,以确定基因突变的效果。在玉米植株4叶期时喷施有效成分为2.52 kg ae ha-1草甘膦,即田间标准使用剂量的3倍,观测植株生长状况及成活率。结果表明本实验培育的转基因植株仍能保持良好的生长状态,即突变过的EPSPSM1或EPSPSM2确实提高了转基因植株的草甘膦抗性。同时转基因植株还具有良好的草丁膦抗性,3叶期可耐0.412kg ae ha-1的草丁膦处理。我们获得了兼抗两种不同作用机制除草剂的转基因玉米纯合系。在玉米田间杂草防治中,可以选择性地喷施一种或两种除草剂或喷洒混合除草剂溶液来控制杂草,不仅能高效控制草害,而且可有效推迟抗性杂草的进化。本实验获得的具有双重除草剂抗性的的转基因玉米,为培育我国具有自主知识产权的抗除草剂玉米品种奠定了基础。
参考文献：
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[2]. 农杆菌介导的抗草甘膦基因2mg2-epsps转化玉米自交系18-599R的研究[D]. 方芳. 四川农业大学. 2012
[3]. 转EPSPS基因水稻的研究[D]. 王蕾. 吉林农业大学. 2012
[4]. 耐草甘膦基因2mg2-epsps转化筛选体系的优化[D]. 王玲玲. 四川农业大学. 2014
[5]. 抗亚洲玉米螟、抗草甘膦转基因玉米的培育[J]. 孙越, 刘秀霞, 李丽莉, 官赟赟, 张举仁. 农业生物技术学报. 2015
[6]. 抗草甘膦转基因玉米的抗性鉴定、遗传分析及回交转育[D]. 张玲. 四川农业大学. 2016
[7]. 农杆菌介导的抗草甘膦基因对玉米自交系18-599幼胚的遗传转化[D]. 刘雪梅. 四川农业大学. 2013
[8]. 玉米抗草甘膦突变体的筛选及成熟胚培养的初步研究[D]. 赵锦慧. 河南农业大学. 2005
[9]. 抗草甘膦转基因玉米的研究[D]. 宋红霞. 山西大学. 2016
[10]. 可变盐单胞菌EPSPS基因的突变和抗草甘膦玉米的培育[D]. 靳传娣. 山东大学. 2016
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