功能化四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备及用于Hakai质粒DNA的分离纯化以及负载

论文摘要

磁性纳米颗粒（Magnetic nanoparticles,MNPs）作为一类新型功能材料,因其众多的优良性能被广泛应用于生物医学等领域。本文主要研究功能化的四氧化三铁MNPs在核酸分离纯化以及基因递送两方面的应用,具体内容分为三部分:（1）Hakai蛋白作为肺癌治疗新靶标的探索性研究。我们首次发现Hakai蛋白在非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）细胞系中高表达,且利用siRNA技术敲低Hakai的表达能显著抑制NSCLC细胞的增殖、迁移以及侵袭,提示Hakai蛋白在NSCLC发生以及发展中起到重要作用,可作为一个潜在的治疗新靶点。这部分结果为我们后续的功能化四氧化三铁磁性纳米材料对Hakai质粒DNA的分离纯化以及负载研究奠定了基础。（2）合成乙二胺修饰的酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒（EDASHT-MNPs）并深入研究其在核酸分离纯化中的应用。我们首先对经典的共沉淀法合成步骤加以修改并获得MNPs,进一步对该材料进行酒石酸氢钠包裹以及乙二胺修饰,获得EDA-SHT-MNPs,利用透射电子显微镜（TEM）、动态光散射仪（DLS）、X-射线光电子能谱分析（XPS）等对MNPs的微观形貌以及EDA-SHTMNPs的表面电位、表面修饰等进行表征。随后,我们一方面系统探究了EDASHT-MNPs对细菌的Hakai质粒DNA的提取情况以及提取产物的生物活性;另一方面,为了验证EDA-SHT-MNPs提取DNA是否具有广谱性,我们进一步检测其对哺乳动物细胞基因组DNA的提取效果。结果表明,本课题合成的EDASHT-MNPs能高效提取质粒DNA以及基因组DNA且不影响DNA的生物活性;此外,与商品化试剂盒相比,EDA-SHT-MNPs在DNA提取总量和纯度方面均具有优势,体现出较好的应用价值。（3）新型磁性纳米材料用于基因转染或基因治疗的初步研究。如上所述,在第一部分研究工作中,我们发现Hakai蛋白可作为一个潜在NSCLC治疗靶标。且在第二部分工作中,我们已证明表面功能化的磁性纳米材料具有较好的DNA结合能力。在这部分工作中,利用聚酰胺-胺树枝状大分子（Polyamidoamine dendrimer,PAMAM）具有良好的生物相容性特点,结合在第二部分中所获得的磁性纳米材料,重新设计并合成出一种新型磁性纳米材料,以Hakai基因为研究对象,探索该材料在基因转染或基因治疗中的应用。我们先以乙二胺为核心、丙烯酸甲酯为原料,通过迈克尔加成反应以及迭代法合成了三代聚酰胺-胺树枝状大分子（generation-3 polyamidoamine dendrimer,G3）,然后利用G3直接包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒或者修饰酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒,得到两种表面修饰阳离子聚合物的磁性纳米颗粒,分别命名为G3-MNPs以及G3-SHT-MNPs。通过TEM、DLS等方法,我们表征了该材料的微观形貌、表面电位以及尺寸大小。进而,利用体外核酸结合和细胞毒性实验,我们分别检测了两种材料与Hakai质粒DNA的结合情况以及对细胞的毒性作用。初步的研究结果显示,与G3-MNPs相比,G3-SHT-MNPs与质粒的体外结合效果较好,且毒性更低,体现出较好的生物相容性。以上结果表明,G3-SHT-MNPs可作为潜在的基因转染以及治疗载体,未来进一步的开发,有望用于基于Hakai或其它靶标的基因治疗研究。综上所述,本文首次证明Hakai蛋白可作为一个潜在的NSCLC治疗新靶标,以Hakai基因为研究对象,本文成功合成了EDA-SHT-MNPs以及G3-SHT-MNPs,并证明前者能高效的提取细菌中Hakai质粒DNA以及细胞基因组DNA,可用于后续的核酸提取应用研究等;后者体现出潜在的基因转染以及治疗功能,具有重要的应用前景。

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Abstract

第一章文献综述

1.1 MNPs

1.1.1 MNPs的分类

1.1.2 MNPs的合成方法

1.1.3 MNPs的优良性能

1.2 MNPs的应用

1.2.1 MNPs在核酸分离纯化中的应用

1.2.2 MNPs在基因递送中的应用

1.3 本课题的研究内容

第二章基于Hakai蛋白的非小细胞肺癌靶向治疗研究

2.1 实验材料

2.1.1 细胞株

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.2 实验方法及步骤

2.2.1 细胞培养

2.2.2 Hakai mRNA水平的表达分析

2.2.3 Hakai蛋白水平的表达分析

2.2.4 siRNA干扰实验

2.2.5 台盼蓝染色排除法

2.2.6 平板克隆形成实验

2.2.7 划痕修复实验

2.2.8 Transwell体外细胞侵袭实验

2.3 结果与讨论

2.3.1 Hakai在 NSCLC细胞系中的表达情况

2.3.2 siRNA干扰的效果分析

2.3.3 敲低Hakai对 NSCLC细胞增殖情况的影响

2.3.4 敲低Hakai对 NSCLC细胞迁移能力的影响

2.3.5 敲低Hakai对 NSCLC细胞侵袭能力的影响

2.3.6 Hakai与上皮-间质转化的联系

2.4 结论

第三章新型氨基磁性纳米材料在Hakai质粒DNA分离纯化中的应用研究

3.1 实验材料

3.1.1 实验试剂

3.1.2 实验仪器

3.2 实验方法及步骤

3.2.1 MNPs的合成

3.2.2 酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒（SHT-MNPs）的制备

3.2.3 乙二胺修饰酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒（EDA-SHT-MNPs）的制备

3.2.4 材料的表征

3.2.5 分离纯化细菌Hakai质粒DNA

3.2.6 对分离纯化的细菌Hakai质粒DNA进行生物活性检测

3.2.7 分离纯化哺乳动物基因组DNA

3.3 结果与讨论

3.3.1 材料的表征结果

3.3.2 EDA-SHT-MNPs分离纯化细菌Hakai质粒DNA及其生物活性检测

3.3.3 EDA-SHT-MNPs分离纯化哺乳动物基因组DNA

3.4 结论

第四章聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性纳米材料在基因递送中的初步研究

4.1 实验材料

4.1.1 实验试剂

4.1.2 实验仪器

4.2 实验方法及步骤

3.0 G PAMAM的合成'> 4.2.1 0.5 G³.0 G PAMAM的合成

4.2.2 三代聚酰胺-胺包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒（G3-MNPs）的制备

4.2.3 三代聚酰胺-胺修饰的酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒（G3-SHT-MNPs）的制备

4.2.4 材料的表征

4.2.5 DNA体外结合实验

4.2.6 材料的细胞毒性检测

4.3 结果与讨论

4.3.1 材料的表征结果

4.3.2 体外DNA结合分析

4.3.3 细胞毒性分析

4.4 结论

第五章总结与展望

参考文献

在校研究成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吴雨晴

导师: 刘姿,马亮

关键词: 磁性纳米颗粒,核酸分离纯化,基因递送

来源: 安徽工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,材料科学

单位: 安徽工业大学

分类号: Q523;TB383.1

DOI: 10.27790/d.cnki.gahgy.2019.000454

总页数: 69

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功能化四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备及用于Hakai质粒DNA的分离纯化以及负载

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