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光合细菌膜蛋白表达载体构建的研究

2020-12-09阅读(980)

光合细菌膜蛋白表达载体构建的研究

论文摘要

蛋白是机体细胞结构,信号转导和分子运输的主要组成成分,是现代生命科学领域的重要研究内容之一。大肠杆菌和酵母是最常用最经典的表达系统,进行外源蛋白的表达时,特别是表达膜蛋白时,蛋白往往不能正确折叠,易形成包涵体,缺乏生物活性。而且,目前使用的大部分表达系统进行蛋白表达时,往往不能对重组蛋白进行实时定量的检测。光合细菌是最为古老的细菌,安全无毒,可以作为一种新型的表达系统。Rhodospirillum（R.）rubrum是紫色非硫化兼性细菌,在无氧光照的情况下,会合成带有光合装置的胞质内膜（ICM）,可将蛋白带到细胞膜上,形成膜蛋白,解决膜蛋白表达困难的问题。Thermochromatium（Tch.）tepidum作为耐高温紫色硫化细菌,具有独特的捕光色素蛋白LHI,吸收峰位于915 nm,可作为报告基因。本研究以R.rubrumH2作为膜蛋白表达宿主,以Tch.tepidum pufBA编码的LHI作为报告基因,并通过D-氨基酰化酶（D-aminoacylase DAA）验证了此表达系统。首先利用基因重组技术将pufBA与可在光合细菌中表达的pPUCTerm载体重组,通过E.coli WM3064结合转化至R.rubrumH2,经光谱与电镜检测,发现pufBA在R.rubrumH2中正常表达,并以膜蛋白的形式存在,在915 nm处出现吸收峰。随后将DAA与含报告基因pufBA的pPUCTerm载体重组,转化至R.rubrumH2,检测发现puf BA与DAA成功表达并形成融合蛋白,吸收峰位置不变,仍在915 nm处,吸收峰与蛋白表达量呈正相关,并且表达产物具有活性。本研究成功构建了含报告基因pufBA的R.rubrumH2膜蛋白表达系统,为蛋白的实时检测提供了新思路,在蛋白的表达与实时检测方面具有较好的价值。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第1章 绪论
  •   1.1 课题研究背景及意义
  •     1.1.1 课题研究背景
  •     1.1.2 蛋白表达系统
  •   1.2 光合细菌
  •     1.2.1 光合细菌的应用
  •     1.2.2 光合细菌捕光系统
  •     1.2.3 Thermochromatium（Tch.）tepidum光合菌
  •     1.2.4 Rhodospirillum（R.）rubrum光合菌
  •   1.3 报告基因
  •     1.3.1 β-半乳糖苷酶基因
  •     1.3.2 氯霉素乙酰转移酶基因
  •     1.3.3 荧光素酶基因
  •     1.3.4 荧光蛋白基因
  •   1.4 本文研究的目的及研究内容
  •     1.4.1 研究目的
  •     1.4.2 研究内容及路线
  •   1.5 本文创新点
  • 第2章 表达载体pPUCTerm-120的构建
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 实验菌株
  •     2.1.2 实验仪器
  •     2.1.3 实验试剂
  •     2.1.4 培养基及溶液
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 目的基因120的获取
  •     2.2.2 目的基因pUC57-120与表达载体pPUCTerm的质粒提取
  •     2.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测pUC57-120与pPUCTerm质粒
  •     2.2.4 目的基因120与表达载体pPUCTerm重组
  •     2.2.5 构建携带重组质粒pPUCTerm-120的E.coli WM3064重组菌
  •   2.3 实验结果
  •     2.3.1 目的基因pUC57-120与表达载体pPUCTerm的质粒提取结果
  •     2.3.2 重组质粒pPUCTerm-120构建结果
  •     2.3.3 重组质粒pPUCTerm-120测序结果
  •   2.4 本章小结
  • 第3章 报告基因载体pPUCTerm-120-pufBA的构建及表达
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 实验菌株
  •     3.1.2 实验仪器
  •     3.1.3 实验试剂
  •     3.1.4 培养基及溶液
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 光合菌种的恢复与鉴定
  •     3.2.2 目的基因pufBA的获取
  •     3.2.3 目的基因pufBA与载体pUCm-T重组
  •     3.2.4 构建携带重组质粒pUCm-T-pufBA的E.coli HB 101重组菌
  •     3.2.5 重组质粒pUCm-T-pufBA的提取与鉴定
  •     3.2.6 目的基因pufBA与表达载体pPUCTerm-120重组及转化
  •     3.2.7 重组质粒pPUCTerm-120-pufBA与R.rubrumH2结合转化
  •     3.2.8 重组菌光谱检测
  •   3.3 实验结果
  •     3.3.1 Tch. Tepidum光合菌鉴定结果
  •     3.3.2 R.rubrumH2光合菌鉴定结果
  •     3.3.3 目的基因pufBA PCR产物的鉴定结果
  •     3.3.4 重组质粒pUCm-T-pufBA构建结果
  •     3.3.5 重组质粒pUCm-T-pufBA测序结果
  •     3.3.6 重组质粒pPUCTerm-120-pufBA构建结果
  •     3.3.7 重组质粒pPUCTerm-120-pufBA测序结果
  •     3.3.8 重组菌R.rubrumH2-pPUCTerm-120-pufBA PCR鉴定结果
  •     3.3.9 重组菌光谱检测结果
  •   3.4 本章小结
  • 第4章 重组质粒pPUCTerm-120-pufBA-DAA的构建及表达
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 实验菌株
  •     4.1.2 实验仪器
  •     4.1.3 实验试剂
  •     4.1.4 培养基及溶液
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 目的基因DAA的获取
  •     4.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物
  •     4.2.3 目的基因DAA与载体pEASY-T1重组
  •     4.2.4 构建携带重组质粒pEASY-T1-DAA的Trans1-T1重组菌
  •     4.2.5 重组质粒pEASY-T1-DAA的提取与鉴定
  •     4.2.6 目的基因DAA与表达载体pPUCTerm-120-pufBA重组及转化
  •     4.2.7 重组质粒pPUCTerm-120-pufBA-DAA与R.rubrumH2结合转化
  •     4.2.8 重组菌蛋白表达鉴定
  •     4.2.9 重组菌蛋白纯化鉴定
  •     4.2.10 重组菌光谱检测
  •     4.2.11 重组菌电镜检测
  •     4.2.12 DAO法测定重组菌中D-氨基酰化酶活性
  •   4.3 实验结果
  •     4.3.1 目的基因DAAPCR产物的鉴定结果
  •     4.3.2 重组质粒pEASY-T1-DAA构建结果
  •     4.3.3 重组质粒pEASY-T1-DAA测序结果
  •     4.3.4 重组质粒pPUCTerm-120-pufBA-DAA构建结果
  •     4.3.5 重组质粒pPUCTerm-120-pufBA-DAA测序结果
  •     4.3.6 重组菌PCR鉴定结果
  •     4.3.7 重组菌蛋白表达鉴定结果
  •     4.3.8 重组菌蛋白纯化鉴定结果
  •     4.3.9 重组菌光谱检测结果
  •     4.3.10 重组菌电镜检测结果
  •     4.3.11 DAO法测定重组菌中D-氨基酰化酶活性结果
  •   4.4 本章小结
  • 总结
  • 参考文献
  • 附录A 重组载体pPUCTerm-120测序结果
  • 附录B 重组载体pUCm-T-pufBA测序结果
  • 附录C 重组载体pPUCTerm-120-pufBA测序结果
  • 附录D 重组载体pEASY-T1-DAA测序结果
  • 附录E 重组载体pPUCTerm-120-pufBA-DAA测序结果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 陈丹阳

    导师: 李明堂

    关键词: 膜蛋白,表达系统,报告基因

    来源: 长春理工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 长春理工大学

    分类号: Q78

    总页数: 84

    文件大小: 3264K

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