邹冬辉[1]2004年在《重组人前列腺特异性抗原在毕赤酵母中的表达和活性测定》文中认为前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen）由KLK3基因编码，KLK3基因位于19q13.2-q13.4，基因全长6KB，含有5个外显子和4个内含子，转录后的mRNA全长1446 bp，转录受雄激素调节。目前发现PSA在多种组织和体液中表达，精浆中的浓度最丰富，浓度可达0.5－2mg/ml，因为PSA具有丝氨酸蛋白酶和类胰凝乳酶活性，特异性降解精浆中的丝氨酸蛋白酶样和糜蛋白酶的特异性底物—semenogelins和fibronectin，液化精浆凝块，增加精子的活动力,而且PSA通过其激肽释放酶作用使精液中缓激肽或缓激肽样代谢物增加，缓激肽或缓激肽样物质能诱导平滑肌收缩，使精子活力增加，有利于受精。自1979年Chu及其同事揭示PSA与前列腺癌有相关性以来，学者们一直着重于PSA在前列腺癌的诊断、监控和预后评价的研究，虽然PSA与精浆的液化有关，但PSA的浓度和形式是否影响精浆的液化，从而在男性不育发病起一定因素，尚无进一步的研究。本教研室的前期工作发现，在少-弱精，液化不良，高黏度和高白细胞精液时PSA在精浆总蛋白中比例显着低于正常精液，其水平仅相当于正常精液的50%左右。我们认为PSA的浓度
康雪燕[2]2010年在《猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及免疫原性分析》文中研究指明猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis, TGE)是一种急性、高度接触性传染病,以呕吐、严重腹泻、脱水为特征,各种年龄的猪只都可以发病,5周龄以下仔猪的病死率最高,给养猪业造成了较大的损失。TGE的病原体为猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV),该病毒是冠状病毒科冠状病毒属成员。在众多对TGEV研究的基础上,本研究就TGEV在猪睾丸细胞(ST)上的增殖特点的认识、花青素体外抗TGEV的试验研究、TGEV纤突糖蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及免疫原性分析叁个部分对TGEV展开研究。第一部分:猪传染性胃肠炎病毒的增殖特点的认识。本试验复苏和传代培养了TGEV宿主细胞-ST,测定TGEV的半数细胞培养物感染剂量(TCID50),以便于病毒感染毒性的定量,显微镜下观察TGEV吸附ST细胞后引起的细胞病变现象,免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)进一步认识TGEV的增殖规律。细胞病变观察结果显示,TGEV侵染ST细胞后可引起具有“种”的特异性的细胞病变,引起细胞核变形或碎裂,甚至导致细胞的完全破坏,IPMA证明TGEV蛋白质的合成在胞浆内。第二部分:花青素体外抗猪传染性胃肠炎病毒的试验研究。在已测定TGEV的TCID50的基础上,利用细胞形态学观察方法,具体研究了花青素对ST细胞的毒性及花青素对TGEV的直接灭活、治疗作用。结果表明:花青素在ST细胞上最大安全浓度为0.002g/ml(纯度5%),即1mg/ml为实际花青素的最大安全浓度;花青素在ST细胞上对抗TGEV的最佳用量为0.002g/ml 500μl;起到治疗作用的花青素用量为0.002g/ml 500μl、375μl,但是花青素只是在ST细胞感染TGEV一定时间内对该病毒起到了治疗作用,而且体外试验结果不能完全等同于体内的治疗效果,所以体内抗病毒效果有待于进一步试验加以验证。第叁部分:猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及免疫原性分析。根据GenBank上猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白S全基因序列设计一对引物,并在5’引物和3’引物中引入EcoR I、Not I酶切位点,经PCR扩增出长2.2kb的目的基因S(其中包含A、B、C、D四个主要抗原位点),克隆于pBS-T载体,克隆载体TS经EcoR I、Not I双酶切,S基因与pPIC9k载体连接,测序验证阳性克隆,Sal I线性化重组穿梭质粒pPIC9k-S,电转化GS115感受态,G418筛选和PCR鉴定得到阳性重组子,1%甲醇诱导表达,诱导后上清经SDS-PAGE电泳、免疫印迹和薄层凝胶扫描分析,并利用离子交换技术和膜超滤方法纯化目的蛋白,将纯化后的蛋白免疫两周龄BALB/c小鼠。SDS-PAGE电泳表明,S蛋白以可溶性形式分泌表达于胞外,且表达产物的分子量约为82 000,与理论推测的分子量一致。免疫印迹结果证明,S蛋白可被TGEV猪阳性血清识别,且具有良好的免疫原性。纯化蛋白免疫小鼠后,获得了抗S蛋白的特异性血清抗体,ELISA效价最高可达1:100。
米东[3]2010年在《PTHrP和BMP-6在乳腺癌中的表达机制研究》文中提出第一部分：PTHrP和BMP-6在乳腺癌中的表达机制研究乳腺癌是一种常发性恶性肿瘤,是导致全世界女性死亡的主要因素。研究表明,在世界范围内,每年约有50万人死于乳腺癌。乳腺癌的一个突出的生物学特征是易发生转移。乳腺癌在发生初期,往往表现出过度增殖和凋亡减少,导致肿瘤细胞快速增殖。在晚期阶段,乳腺癌的转移成为导致病人死亡的一个重要因素,最常见的转移器官为骨,死于乳腺癌的患者中有80%都发生了骨转移。乳腺癌的发生和转移是一个多因素参与并通过多步骤完成的复杂过程。涉及正常乳腺上皮细胞转变成为多潜能分化的间充质细胞,并失控增殖生成原位癌；原位癌细胞的脱离和外侵；乳腺癌细胞的定向转移；乳腺癌细胞在靶器官的黏附和增殖。但其生物学过程和分子机制尚未明确,这严重影响了乳腺癌的治疗。PTHrP是从高钙血症相关的恶性肿瘤组织中分离出的一种蛋白质分子,由于其基因序列和结构与甲状旁腺激素(PTH)相类似而得名。PTHrP常常在骨转移肿瘤中检测到,PTHrP的过表达与肿瘤骨转移和预后有关。骨形态发生蛋白-6(Bone morphogenetic protein-6, BMP-6)是转化生长因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的成员,其作用方式主要是通过与细胞膜上的BMP I型和Ⅱ型受体结合,并依靠Smad通路传递信号来调节细胞的生长和分化。除了在诱导成骨方面发挥重要作用外,BMP-6还是调控骨生长和器官发育的重要功能因子。近年来越来越多的研究表明BMP-6的异常表达与肿瘤的发生和转移密切相关。在乳腺癌细胞系和乳腺癌患者肿瘤标本中均发现BMP-6基因的异常表达。本研究通过定量PCR检测了35个乳腺癌标本中的PTHrP和BMP-6 mRNA的表达水平,结果发现在17个高表达PTHrP的标本中有12个低表达BMP-6,在18个低表达PTHrP的标本中有17个高表达BMP-6,表明PTHrP和BMP-6 mRNA的表达呈现负相关,这就提示我们PTHrP和BMP-6之间可能存在负调控关系。为阐明PTHrP抑制乳腺癌中BMP-6基因表达的分子机制,本文构建了人全长PTHrP cDNA表达载体,用不同浓度的PTHrP质粒转染MCF-7细胞,通过半定量和定量PCR检测发现PTHrP可剂量依赖性地抑制MCF-7中BMP-6 mRNA的表达,通过Western-blot检测发现PTHrP可剂量依赖性地抑制MCF-7中BMP-6的蛋白水平。用定量PCR检测发现外源转染的PTHrP可时间依赖性地抑制MCF-7中BMP-6 mRNA的表达。鉴于PTHrP在生物体内以多种多肽形式存在,为了进一步探讨PTHrP抑制BMP-6基因表达的分子机制,我们用氨基端多肽PTHrP (1-40)和羧基端多肽PTHrP (107-139)处理MCF-7细胞,结果发现仅PTHrP (1-40)剂量依赖性地抑制MCF-7中BMP-6的mRNA和蛋白表达水平,而PTHrP (107-139)没有任何作用。接着,我们构建了长度为1.2kb的BMP-6基因启动子驱动的荧光素酶表达质粒,通过荧光素酶活性分析该启动子对PTHrP(1-40)或PTHrP (107-139)刺激的应答活性,发现在剂量为10nM的PTHrP (1-40)的刺激下,BMP-6基因启动子驱动的荧光素酶活性下调40%,剂量为100nM时活性下调73%,而PTHrP(107-139)对BMP-6基因启动子驱动的荧光素酶活性没有作用。为了研究PTHrP (1-40)调控BMP-6基因表达的信号途径,我们采用了PKA、PKC、p38MAPK和MEK途径抑制剂,结果发现仅PKA信号途径抑制剂可以消除PTHrP (1-40)对BMP-6基因表达的抑制作用,此外发现PKA信号途径激活剂发挥与PTHrP (1-40)相似的抑制BMP-6基因启动子活性效果。此外,我们通过BMP-6基因沉默和过表达证实,PTHrP (1-40)通过下调BMP-6基因的表达抑制乳腺癌的增殖和细胞周期进程。综上所述,本部分实验证实PTHrP是BMP-6的上游分子,通过PKA信号途径抑制BMP-6基因的表达,进而通过下调BMP-6基因的表达抑制乳腺癌细胞的增殖。第二部分：人骨形态发生蛋白6在毕赤酵母中的分泌表达毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来快速发展起来的一种真核表达体系,和其它表达系统相比,有着无法比拟的优势,它既操作简单,易于扩大培养,适于工业化生产,又具有真核细胞翻译后修饰加工的特点。毕赤酵母表达系统已被越来越广泛地应用于外源重组蛋白的表达,到2005年为止,超过500种外源重组蛋白已经在毕赤酵母表达系统中成功表达。骨形态发生蛋白属于转化生长因子β(transforming growth factorβ, TGF-β)超基因家族,是一种多功能的细胞调节因子,它不仅能够促进新骨的形成,还在细胞生长、分化、迁移、凋亡以及胚胎和器官发生中发挥重要作用。人骨形态发生蛋白6(BMP-6)参与调控机体泌尿和神经等系统的发育,影响细胞的增殖和凋亡,是细胞正常生长和发育的重要调节因子。BMP-6在体内先以前体蛋白(包括信号肽、前肽和成熟肽)合成,然后再经过翻译后修饰加工形成同源或异源二聚体来发挥其生物学功能。目前国内外重组骨形态发生蛋白的生产多见于真核哺乳动物和昆虫细胞,虽然活性较高,但是产量少而且成本高。而原核表达系统虽也能表达出有活性的骨形态发生蛋白,但由于缺乏蛋白质翻译后修饰加工机制,通常活性较低。本实验旨在利用毕赤酵母表达系统分泌表达hBMP-6蛋白。本实验首先以重组质粒pcDNA6A-BMP-6为模板通过PCR扩增hBMP-6成熟肽cDNA编码序列,将该序列克隆到酵母分泌表达载体pPIC9K中。重组质粒pPIC9K-hBMP-6经Sac I酶切线性化,电击转化毕赤酵母GS115, PCR法筛选阳性转化子,利用梯度浓度G418筛选到七株高拷贝整合的阳性转化子。用甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE及Western-blot检测结果表明获得的hBMP-6成熟肽以分子量约为34 kD和18kD两种不同糖基化修饰的单体形式存在,具有良好的免疫原性。
戴寿沣[4]2008年在《人白介素-1受体拮抗剂融合蛋白的构建、表达及生物学活性鉴定》文中进行了进一步梳理IL1ra是生物体内的一种天然的蛋白质分子,与IL-1α、IL-1β同为IL-1家族的成员,其本身无任何激动剂的作用,但能特异性地与IL-1受体结合,从而拮抗IL-1的各种生物学效应。一系列的证据证明IL-1在RA发病的慢性炎症过程中具有重要的作用,IL1ra由于可以特异性地抑制IL-1的生物学功能,因此在RA的治疗中备受重视。2001年,由Amgen公司生产的重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhlL1ra,药品名称Kineret)被美国食品与药品管理局(FDA)和欧洲EMEA批准上市,用于治疗类风湿关节炎(RA)。但是,由于ILlra相对分子质量较小,半衰期短,使用过程中患者皮下注射rhlL1ra时,要达到需要的血药浓度和治疗效果需要反复给药,一般每天注射一次,一个疗程为半年,频繁用药加重了患者的身体、心理和经济负担,因此临床上急需研发长效的重组rhIL1rao本研究旨在采用蛋白融合技术延长IL1ra在体内作用的半衰期,设计了以人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)为载体蛋白融合IL1ra的融合蛋白。作为血浆的重要成分之一,HSA是许多内源因子和外源药物的载体,正常情况下不易透过肾小球。在血浆中的半衰期长达2周,体内分布极广而且没有酶学和免疫学活性,因而是一种理想的生物活性蛋白载体。通过基因工程技术将HSA基因与IL1ra基因融合,以期获得既不丧失IL1ra生物活性,且能显着地延长其在血浆中半衰期的融合蛋白。这样的融合蛋白能够降低给药频率,发挥与IL1ra相似或更好的治疗作用。1.融合基因的构建及鉴定用PCR法从人胎肝cDNA文库获得成熟态血清白蛋白基因,长度大约为1.8kb,再将PCR产物克隆入pGEM-T载体中。再经PCR获得不同修饰的HSA、IL1ra基因,构建HSA与IL1ra的融合基因,并克隆至pPIC9载体中。用PstI、XhoI、EcoRI酶切鉴定重组质粒,再经测序证明已成功构建。2.毕赤酵母转化及PCR法鉴定制作毕赤酵母GS115(SMD1168)感受态细胞,将用SalI线性化的重组表达载体转化至毕赤酵母GS115(SMD1168)中。转化后铺于不含组氨酸的RDB平板,30℃培养3天后长出一批毕赤酵母转化子。以重组酵母的基因组为模板,用5'-AOX1和3'-AOX1为引物进行PCR检测,电泳在2.2kb处有一明显条带。结果显示HSA/IL1ra融合基因表达盒已经成功的整合至酵母基因组中。3.毕赤酵母转化子摇瓶诱导表达及鉴定随机挑选的多个毕赤酵母转化子,经摇瓶培养,诱导表达72h,电泳鉴定在84kD处出现目标条带的转化子并保存。选取表达量最高的转化子进行发酵培养,取诱导表达12h、24h、48h、72h的发酵液,离心取上清进行SDS-PAGE分析。电泳鉴定发现随着诱导时间的延长,培养基中的分泌蛋白的量增多,在诱导72h时表达量最高,发酵液中HSA-G-IL1ra融合蛋白的浓度约为200mg/L。4.融合蛋白的纯化离心收集发酵诱导表达72h的发酵液上清,硫酸铵沉淀,重溶脱盐处理后,经亲和柱、离子交换柱、凝胶柱纯化后得到较纯的融合蛋白。经反相HPLC检测其纯度大于90%。5. Western Blotting免疫印迹分析免疫印迹结果分析显示凝胶电泳中的84kD条带既能与兔抗HSA抗血清发生特异性结合,也能与鼠抗人IL1ra单克隆抗体之间发生特异性结合。说明融合蛋白同时具有HSA和IL1ra抗原性。免疫印迹的结果验证了融合蛋白中存在HSA和IL1ra两个结构域。6.融合蛋白的生物学活性测定按中国药检所推荐方法用细胞株A375.S2来测定rhIL1ra的生物效价。生物学活性测定结果表明本研究构建表达的HSA/IL1ra融合蛋白具有与ILlra相似的活性,能拮抗IL-1对A375.S2细胞的杀伤作用,并且保护作用呈剂量依赖性。7.融合蛋白的药代动力学对小鼠进行皮下注射HSA-G-IL1ra融合蛋白,在不同时间点取血,用ELISA方法对血样进行检测,通过统计学方法得到融合蛋白的药代动力学参数：半衰期为8.125h、是rhIL1ra的17.6倍。清除率为0.182 L/h/kg,是rhIL1ra的0.18倍。证实HSA-G-IL1ra融合蛋白具有长效性。8.融合蛋白的结构鉴定通过Western Blotting、N-端氨基酸测序及圆二色谱分析,证实HSA-G-IL1ra融合蛋白具有正确的HSA和ILlra氨基酸序列及结构特征。综上所述：本研究成功构建了HSA与ILlra的融合基因,并在毕赤酵母表达体系中获得成功表达；经SDS-PAGE、Western Blotting、N端氨基酸测序及圆二色谱分析等方法证实毕赤酵母表达的HSA/IL1ra融合蛋白具有正确的HSA和ILlra序列及结构；A375.S2细胞IL1杀伤抑制实验证明HSA-G-IL1ra融合蛋白具有与ILlra相同的生物学活性；小鼠的药代动力学实验显示HSA-G-IL1ra融合蛋白比ILlra具有更长的体内的半衰期,降低了清除率,从而证实HSA-G-IL1ra融合蛋白具有长效性。
许天敏[5]2007年在《rhuPA_a-melittin在毕赤酵母中的表达及其对卵巢癌靶向治疗的研究》文中提出本研究利用基因重组技术构建了rhuPA_a-melittin-pPICZαC真核表达载体以及可任意替换uPA B链的rhuPA_a-X-pPICZαC真核表达载体。利用80L发酵罐，进行了rhuPA_a-melittin表达条件的优化，并建立一种适合于大规模发酵及纯化的新方法，获得高产量、高纯度、高活性的rhuPA_a-melittin。利用光镜、电镜、细胞免疫荧光、DNA电泳、流式细胞仪和酶联免疫检测仪、细胞免疫化学染色等实验方法和技术，观察rhuPA_a-melittin对人卵巢癌细胞SKOV3的细胞形态、生长曲线、细胞增殖周期、细胞基因组DNA、凋亡、凋亡相关蛋白等指标的作用情况。旨在比较全面、系统的研究rhuPA_a-melittin体外抗人卵巢癌的治疗作用并初步探讨其作用机制。本研究的创新之处在于：①首次构建了rhuPA_a-melittin-pPICZαC真核表达载体，为研究以uPA为靶点的卵巢癌靶向治疗奠定了基础；②首次在毕赤酵母中高效表达rhuPA_a-melittin；③首次建立了大规模发酵和纯化rhuPA_a-melittin的新方法；④首次应用rhuPA_a-melittin在体外研究其抗卵巢癌作用并初步探讨其作用机制。
杨健[6]2003年在《重组人纤溶酶原K5在毕赤酵母中的表达、纯化及其抗肿瘤新生血管生成基因治疗》文中指出肿瘤新生血管生成(tumor angiogenesis)是肿瘤的标志之一，在肿瘤的生长、转移等生物学过程中有重要作用。抗肿瘤新生血管生成的药物和基因治疗正在进行实验和临床研究，初步结果表明该疗法能有效地抑制肿瘤生长、转移，具有广阔的应用前景。已发现多种内源性的新生血管生成抑制因子如Angiostatin、Endostatin等，能特异地抑制内皮细胞增殖、迁移和新生血管生成，并显示较强的抗肿瘤生长和转移作用。Angiostatin是纤溶酶原的降解片段，主要结构为纤溶酶原分子的4个K(kringle, K)结构域，是抑制新生血管生成的关键性结构。纤溶酶原K1-3结构域，K5结构域等均能抑制新生血管生成，K5结构域具有很强的抑制内皮细胞增殖、迁移和新生血管生成等作用。为深入研究人纤溶酶原K5结构域(K5)的抗新生血管生成作用，我们利用重组DNA技术，在毕赤酵母表达系统中表达K5 cDNA克隆，鉴定其生物学活性；同时构建了含K5 cDNA基因的真核表达质粒pcDNA3K5和重组复制缺陷性腺病毒(Ad-K5)重组病毒颗粒，研究其对内皮细胞增殖、管腔形成的抑制作用，并用于实验性抗肿瘤新生血管生成基因治疗，取得了令人鼓舞的结果。一、 人纤溶酶原K5结构域cDNA基因在毕赤酵母中的表达、纯化应用PCR方法，扩增人纤溶酶原K5 cDNA基因，与分泌型酵母表达载体pPIC9K5重组后，转化甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris)，筛选获得的重组转化子，甲醇诱导表达，表达产物经纯化后，用内皮细胞增殖抑制实验，证实其生物学活性。本实验构建的含K5 cDNA基因的重组分泌型酵母表达质粒pPIC9KK5在α-factor信号肽序列中仅保留了一个Kex2蛋白酶水解位点，以获得N端均一的重组K5蛋白(rh-K5)，重组质粒转化酵母后，得到的转化子经甲醇诱导表达后，表达产物经SDS-PAGE和Wester Blot证实含有目的蛋白rh-K5，经纯化后，得到的rh-K5对牛毛细血管内皮(bovine capillary endothelial, BCE)细胞增殖有抑制作用，促进内皮细胞凋亡，但对细胞周期无明显影响。
杨珺[7]2005年在《重组人白细胞介素24的表达及其生物学活性鉴定》文中进行了进一步梳理1995年P．B．Fisher用差减杂交技术发现一个新的与人黑色素瘤分化相关基因，当时称为mda-7(melanoma differentiation-associated gene 7)，并发现随着黑色素瘤细胞生长、发展和转移，mda-7的表达逐渐减少至最终消失，证实了其表达产物MDA-7具有抑制黑色素瘤细胞增生、促进黑色素瘤细胞终末分化的能力。随后，MDA-7一直作为肿瘤抑制物被研究。直到2002年，Caudell等研究证实了MDA-7的细胞因子属性，重新命名为人白细胞介素24(Human interleukin-24，hIL-24)。迄今为止，已有大量实验证明hIL-24具有显着的选择性抑制多种肿瘤生长、诱导肿瘤细胞凋亡的能力，这种抑制作用不依赖p53、Rb和p16等抑癌基因的状态，且对正常细胞没有影响。hIL-24作为细胞因子，不仅在激活免疫细胞、调节整个抗癌免疫反应和造血系统中起重要作用，还具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡和直接抑制肿瘤细胞的增殖、转移作用，其显着的抗肿瘤特性使之成为肿瘤治疗研究的新热点。2004年，Introgen公司研制的基因治疗制剂Ad．IL-24，即重组复制缺陷型腺病毒-IL-24，商品名为INGN 241，获美国FDA批准进入Ⅱ期临床试验，体内外试验和临床实验均证实了hIL-24显着的抗肿瘤效果。随着对hIL-24作用机制和基因治疗方面深入的研究，一方面肯定了hIL-24生物学功能和治疗效果，另一方面表现出对hIL-24的大量需求，所以，通过基因工程手段大规模生产高纯度有活性的重组hIL-24成为必然。本研究分别采用大肠杆菌(原核)表达系统制备了融合蛋白Trx-IL-24，并用肠激酶酶切Trx-IL-24得到重组蛋白IL-24，以及采用毕赤酵母(真核)表达系统分泌表达了重组糖蛋白rIL-24，分析鉴定了叁种重组蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性，为深入研究其诱导肿瘤细胞凋亡机制和肿瘤治疗应用奠定基础。 研究目的：构建hIL-24的大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统，获得叁种重组蛋白Trx-IL-24、IL-24和rIL-24。建立Trx-IL-24和IL-24的制备、纯化及复性的中试生产工艺。筛选高效分泌表达rIL-24的重组毕赤酵母工程菌。鉴定叁种重组蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性。 研究方法： 1) 人白细胞介素24基因的克隆 采用RT-PCR和nested-PCR方法，从ConA刺激培养的人外周血单个核细胞中，克隆带信号肽的hIL-24编码序列(hmIL-24)和不带信号肽的hIL-24编码序列(hIL-24)。 2) 人白细胞介素24基因在大肠杆菌中的表达与纯化 为避免引入多余的氨基酸，利用载体pET32a(+)上的肠激酶识别位点编码碱基之前的Kpn I位点，及多克
袁力勇[8]2001年在《人纤溶酶原K5在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达、纯化与生物学活性研究》文中研究表明利用血管生成抑制来治疗肿瘤是目前研究的热点之一。纤溶酶原K5(Plasminogen K5，Pgn K5)是一种新发现的血管生成抑制蛋白，具有明显的血管生成抑制作用，但Pgn K5的抗肿瘤活性尚待确定，此外，选择何种表达系统制备足够的量进行体内抗肿瘤活性研究还需要进一步探索。本论文就Pgn K5在原核和真核系统的表达、纯化及生物学活性的测定等进行了系统详细的研究。 首先，按照酵母细胞遗传密码偏爱性设计并人工合成hK5(人Pgn K5)的全基因，插入大肠杆菌表达载体pThioHisA，以硫氧还蛋白融合蛋白的形式实现高效表达。经肠激酶切割和纯化，获得了与天然蛋白N-末端相同的hK5重组蛋白。 另外，将hK5基因插入毕赤酵母整合型表达质粒p819的醇脱氢酶(AOX)启动子下游，构建携带8拷贝hK5表达盒的重组载体，经电转化GS115菌株和G418筛选，得到了高效分泌表达hK5的毕赤酵母菌株，表达量超过150mg／L，通过DEAE-Sepharose离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤纯化，使重组蛋白达到很高的纯度。 最后，对大肠杆菌和毕赤酵母表达的hK5的活性进行鉴定。Ecv304细胞(人脐静脉内皮细胞来源的细胞系)生长抑制实验表明，hK5以剂量依赖的方式特异性地抑制血管内皮细胞的生长。鸡胚尿囊膜实验中，hK5可显着抑制新生血管的形成。T739小鼠肿瘤模型实验表明，重组hK5可显着降低小鼠肿瘤的生长速度。 本研究首次报道了重组hK5在大肠杆菌和毕赤酵母系统中的表达以及体内抗肿瘤活性测定，为hK5的活性机理研究和新型抗血管生成药物开发奠定了基础。
陈伟莉[9]2007年在《重组人TRAIL的制备和抗肿瘤作用的研究》文中研究表明本研究利用基因重组技术构建了完整人TRAIL真核表达载体pPICZα/TRAIL,电转化毕赤酵母X-33后,筛选出稳定分泌表达的rhTRAIL工程菌株。经SDS-PAGE,Western blot,亲和层析和离子交换层析纯化证明rhTRAIL与天然hTRAIL具有相同的理化性质。利用80 L发酵罐优化发酵条件,采用甲醇诱导批式发酵,大量制备和纯化rhTRAIL用于生物活性的研究。细胞实验以人乳腺癌SKBr-3和黑色素瘤A-375细胞株为模型。经MTT比色实验、细胞凋亡检测(TUNEL法)和流式细胞术(FACS)检测细胞凋亡率,发现了rhTRAIL能迅速诱导肿瘤细胞发生凋亡。设计并建立了BALB/c小鼠乳腺癌模型,设低、中、高剂量组和对照组,每天给药一次,共给药15天。发现了BALB/c小鼠经腹腔注射rhTRAIL蛋白后,能引起肿瘤细胞的凋亡和坏死,有效抑制乳腺癌细胞D2F2在小鼠体内的生长。本研究为细胞凋亡及人类乳腺癌治疗的研究提供了理论和实验依据。通过研究取得了以下实验结果:①构建完整人TRAIL真核表达载体pPICZα/TRAIL并转化毕赤酵母,筛选稳定分泌表达rhTRAIL工程菌株;②在80 L发酵罐规模下建立了rhTRAIL大量制备和纯化工艺;③在细胞水平上研究rhTRAIL能迅速诱导肿瘤细胞发生凋亡;④在整体水平上研究rhTRAIL对小鼠乳腺癌的抑制作用。其创新性成果是:证实了完整人TRAIL在整体水平上诱导小鼠乳腺癌细胞凋亡并有大量的乳腺癌细胞坏死。
孙勇[10]2006年在《人肠叁叶因子在大肠杆菌和酵母中的表达、纯化及其在受损胃肠粘膜屏障重建中的作用》文中研究指明背景： 肠叁叶因子(intestinal trefoil factor，ITF)是由肠道杯状细胞特异分泌的包含59个氨基酸的小分子多肽，ITF氨基酸序列中有一段特殊的核心序列，其间的6个半胱氨酸按1-5，2-4和3-6的顺序，依次以二硫键两两相接，形成3个环状结构，形如叁片叶子，故名肠叁叶因子。ITF除具有一般生长因子的共性外，还因其具有特殊的空间结构能同粘蛋白(Mucin)的糖链结合，形成稳定的凝胶复合物，维护胃肠粘液层。因此，ITF可减轻多种致伤因子造成的胃肠道损害，在消化道的自我保护机制中占据重要地位。作为一个具有广泛应用前景的药物前体ITF已受到国内外学者的广泛关注，ITF特异的空间结构既是其生物活性的结构基础，也是人工合成的难点所在。目前人工获取ITF一般有叁种途径：化学合成、组织提取和基因重组表达。化学合成较为昂贵、烦琐，且无法获得正确的空间结构；组织提取原料来源有限，阻碍了其广泛应用；基因重组技术无疑是获得ITF的最佳选择，但目前原核系统表达ITF产量低，仅为3-4mg／L。采用第一代酿酒酵母表达系统，尽管实验室表达量已达100mg／L，但因其不具备高密度发酵的特性，无法进行大规模表达，工业化生产受限。第二代毕赤酵母是一种新型表达系统，除保留第一代酿酒酵母的一些优点外，还增加了高密度发酵的特点，能大规模表达目的蛋白，适用于工业化生产，目前已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋白质，如破伤风毒素片段C、肠激酶、乙肝表面抗原、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、白介素11等。 目的： 筛选并构建rhITF理想的表达系统，优化表达条件，提高表达产量，获得高纯度的重组蛋白；对重组表达的rhITF的理化性质进行系统研究；探讨rhITF在受损胃肠粘膜屏障重建中的作用。 方法： 1．rhITF在大肠杆菌中的表达和纯化：通过RT-PCR获得rhITF成熟肽全长基因序列，克隆至质粒pET32a获得重组载体；双酶切和测序后转化至Origami B(DE3)进行诱导表达，优化表达条件获得最大表达产量；Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白，
参考文献：
[1]. 重组人前列腺特异性抗原在毕赤酵母中的表达和活性测定[D]. 邹冬辉. 吉林大学. 2004
[2]. 猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及免疫原性分析[D]. 康雪燕. 山东农业大学. 2010
[3]. PTHrP和BMP-6在乳腺癌中的表达机制研究[D]. 米东. 南开大学. 2010
[4]. 人白介素-1受体拮抗剂融合蛋白的构建、表达及生物学活性鉴定[D]. 戴寿沣. 浙江大学. 2008
[5]. rhuPA_a-melittin在毕赤酵母中的表达及其对卵巢癌靶向治疗的研究[D]. 许天敏. 吉林大学. 2007
[6]. 重组人纤溶酶原K5在毕赤酵母中的表达、纯化及其抗肿瘤新生血管生成基因治疗[D]. 杨健. 复旦大学. 2003
[7]. 重组人白细胞介素24的表达及其生物学活性鉴定[D]. 杨珺. 重庆大学. 2005
[8]. 人纤溶酶原K5在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达、纯化与生物学活性研究[D]. 袁力勇. 中国协和医科大学. 2001
[9]. 重组人TRAIL的制备和抗肿瘤作用的研究[D]. 陈伟莉. 吉林大学. 2007
[10]. 人肠叁叶因子在大肠杆菌和酵母中的表达、纯化及其在受损胃肠粘膜屏障重建中的作用[D]. 孙勇. 第叁军医大学. 2006
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