张文正[1]2004年在《拟南芥花粉管振荡生长观察及其调控机制的初步研究》文中指出极性生长的花粉管表现出振荡式生长的特性，但其机理还不清楚。本论文工作选用拟南芥花粉管为实验材料研究花粉管振荡生长的调控机制。由于拟南芥花粉管比较细小，生长速率较慢，本实验采用了自行设计的一种观察装置，可以方便、精确地观察拟南芥花粉管的生长行为。观察发现，体外生长的拟南芥花粉管存在两种振荡生长方式。一种与Parton(2003)报道的周期性振荡生长行为相似，每个振荡的周期与振幅基本相同，平均周期为24±1秒。此外，本实验还首次观察到一种新的振荡生长方式，命名为“双重振荡”。在花粉管生长速率呈现周期性变化的同时，生长振荡的振幅也表现出“小—大—小”的规律性变化。一般每5.6个生长振荡形成一组，称之为“组合振荡”。组合振荡的平均周期为113±4秒。这种振荡生长方式在其它种类花粉管中没有报道。 作为调控花粉管极性生长的重要因子，Ca~(2+)和微丝在调控花粉管极性生长过程中可能存在相互作用。伴随花粉管的振荡生长，花粉管顶端的Ca~(2+)浓度梯度和微丝的聚合—解聚状态会发生周期性变化。本研究以拟南芥花粉管为材料，通过转基因技术，将分别标记Ca~(2+)和微丝的两种荧光蛋白cameleon与GFP-mTalin在花粉管中同时表达，实现活体花粉管中Ca~(2+)与微丝的同时标记。该系统的完成为研究花粉管振荡生长过程中Ca~(2+)与微丝的相互关系做了材料上的准备。
廖宏泽[2]2017年在《拟南芥蛋白激酶PTI1-5在花粉管和根毛生长中的作用研究》文中提出花粉管和根毛都是呈顶端生长的植物细胞,分别在植物有性生殖和水分营养吸收方面起重要作用,与农业生产密切相关。在植物开花时,由雄蕊花药产生的花粉粒被释放出来并传递到雌蕊的柱头上,经水合后由其营养细胞萌发出花粉管。花粉管进行顶端生长,侵入柱头细胞后经花粉管通道最后把其携带的两个精细胞传递到胚囊中完成双受精。花粉管生长是植物有性生殖过程中的一个重要环节,花粉管生长缺陷会导致雄性不育。根毛是由根尖表皮的生毛细胞(trichoblasts)发育而来,根毛的形成显着地增加了根表皮细胞的表面积,有助于根对土壤水分营养的吸收和与土壤微生物的相互作用,促进植物生长发育和有效地应对环境胁迫。此外,花粉管和根毛也是良好的研究细胞极性生长的模式材料。研究花粉管和根毛生长的分子遗传机制不仅可以了解植物细胞生长发育的调控机制,也可为农作物栽培和育种提供遗传学方面的理论参考。研究表明,花粉管和根毛的生长受到Ca2+、小G蛋白、细胞骨架和蛋白激酶等诸多因素的调控,但目前对花粉管和根毛生长的分子遗传机制的了解还很有限,尤其是相关蛋白激酶在花粉管和根毛生长过程中的作用仍知之甚少。我所在的研究组长期致力于植物雄配子体(即花粉)发育的分子遗传学研究,在前期工作中分离到了一个Ds转座子插入引起的雄配子体缺陷突变体kd640,初步的分析结果显示,Ds插入到拟南芥Pto-interacting 1(PTI1)蛋白激酶家族成员PTI1-5(At2g41970)基因中,严重影响花粉管的生长,导致配子体型雄性不育。本论文是在原有研究基础上对pti1-5突变体进行详细地鉴定分析,并研究PTI1-5在花粉管生长发育中的作用。后来的研究结果显示,PTI1-5不但在花粉管中表达,而且也在根毛中有较高的表达。因此,又进一步分析了PTI1-5在根毛生长发育过程中的作用。pti1-5是一个从拟南芥基因陷阱(gene-trap)和增强自陷阱(enhancer-trap)Ds插入突变体库中筛选分离得到的雄配子体缺陷突变体。遗传分析表明,PTI1-5基因的突变导致雄配子体的传递完全丧失,不能产生纯合pti1-5突变体植株。表型分析发现,突变体花粉萌发后即发生爆裂,严重影响花粉管的正常生长,表明PTI1-5在花粉管生长中起重要作用。定量Real-time PCR和启动子分析结果显示,PTI1-5基因主要在花粉、花粉管、根和根毛中表达。利用花粉管特异启动子启动PTI1-5基因在pti1-5突变体花粉和花粉管中特异表达,能恢复突变体的雄配子体功能,并能获得纯合pti1-5突变体植株,结果发现Pti1-5的突变还会影响根毛的生长,表明PTI1-5不仅在花粉管生长发育中起重要作用,而且在根毛生长发育中发挥着重要的作用。PTI1-5 编码一个预测为胞质类受体蛋白激酶(receptor-like cytoplasmic protein kinase,RLCK)的蛋白质,是拟南芥PTI1激酶亚家族中的一个成员。PTI1激酶属于类受体胞质激酶RLCK VIII亚家族,共有11个成员。PTI1-5蛋白主要定位于正在生长的花粉管和根毛的细胞质和顶端质膜上。酵母双杂交、荧光素酶互补成像实验和免疫共沉淀实验显示,PTI1-5能和Oxidative signal-inducible 1(OXI1)及与其同源关系最近的蛋白激酶AGC2-2相互作用。磷酸化实验表明PTI1-5在体外能被OXI1磷酸化。已有研究表明OXI1主要在根毛中表达,而且oxi1突变体主要是影响根毛的生长,不影响花粉管的生长。因此,PTI1-5可能是通过与OXI1互作参与相关的信号转导,从而调控根毛的生长发育。此外,点突变实验结果显示,预测的磷酸化位点T239和T244对花粉萌发和花粉管的生长是十分重要的,这两个位点突变会严重影响花粉管的萌发与生长。但这两个位点是否是真的磷酸化位点和是否与OXI1对PTI1-5的磷酸化作用相关还不清楚。总而言之,本论文的研究结果显示,PTI1激酶家族成员PTI1-5在花粉管和根毛的生长中起重要作用。在根毛的生长过程中,PTI1-5可能是通过与OXI1互作参与相关的信号传递,从而调控根毛的生长。这些研究结果可为更加深入地了解和研究PTI1家族成员在植物生长发育中的作用提供参考信息,也可为进一步研究花粉和根毛生长的分子机制提供新的线索和思路。
杨雪[3]2014年在《拟南芥CML24调控花粉萌发及花粉管生长的功能研究》文中研究说明花粉萌发以及花粉管的快速极性生长,是被子植物双受精的关键。除此之外,花粉管也是研究细胞信号转导、细胞生长调控和细胞极性生长的良好模式系统。花粉和花粉管细胞感知外部信号后,通过信号转导级联反应,控制花粉萌发及花粉管的生长方向,以引导花粉管顺利到达胚珠释放精细胞。花粉管细胞的内环境,包括合适的离子浓度、微丝骨架的动态变化、囊泡转运的动态平衡等,对于花粉管的正常顶端生长都至关重要。Ca2+是植物细胞普遍存在的重要第二信使,在花粉萌发和花粉管生长过程中起着重要的调控作用,而且Ca2+信号系统和其他调控花粉管生长的信号系统存在紧密的联系,这些系统调控作用的实现可能有赖于Ca2+对其作用的进一步传递,因此普遍认为Ca2+信号在调控花粉萌发和花粉管生长的过程中处于“中心”位置。因此,进一步揭示花粉萌发及花粉管生长过程中的Ca2+信号转导网络,对于了解花粉萌发及生长的调控机制至关重要。钙调素类似蛋白(Calmodulin Like Protein; CML)是近年新发现的一类植物细胞所特有的Ca2+响应蛋白家族,在拟南芥中有50个成员。CML具有Ca2+的结合区域—EF手型结构(EF-hand motif),这也是所有Ca2+感受器蛋白的基本特征。目前对CML功能的研究才刚刚起步,尤其在花粉管系统中的功能未见报道。本论文工作以拟南芥CML家族基因CML24为研究对象,利用CML24的两个突变体,T-DNA插入突变体cml24-T1和点突变体cml24-4,以及CML24功能恢复及过表达突变体,解析CML24在拟南芥花粉管极性生长中的作用。结果如下：1、CML24在花粉和花粉管中表达,并参与花粉萌发及花粉管生长的过程。半定量RT-PCR和荧光定量PCR结果显示,CML24在花粉和花粉管中大量表达,且突变体cml24-T1和cml24-4的表达量均较野生型显着降低。体外和体内花粉萌发结果表明,cml24-T1和cml24-4的花粉萌发率、花粉管生长速率及长度均明显低于野生型。突变体的性状被表达CML24所恢复,说明cml24-T1和cml24-4的花粉萌发及花粉管生长缺陷表型是由CML24的功能缺失引起的；2、CML24亚细胞定位于细胞质中。利用叶肉细胞瞬时表达CML24：GFP融合蛋白,激光共聚焦显微镜结果显示CML24为细胞质定位,预示CML24可能主要在胞质中发挥作用；3、CML24的功能缺失降低了花粉管生长过程中对胞外Ca2+及K+的响应。胞外Ca2+及K+参与了花粉萌发及花粉管调控的过程,分别在花粉管体外萌发培养基中添加不同浓度的Ca2+和K++时,发现突变体cml24-T1和cml24-4的花粉管生长对胞外Ca2+、K+浓度变化不敏感,预示着突变体在控制离子转运上发生了改变；4、CML24的功能缺失改变了胞内Ca2+浓度。使用Ca2+检测荧光探针Fluo-3AM标记花粉粒和花粉管胞内Ca2+,结果显示cml24-T1和cml24-4胞内Ca2+含量明显高于野生型。推测CML24可能是通过调控胞内的Ca2+信号,进而调节花粉萌发和花粉管生长。也进一步明确了CML24可能作为Ca2+下游响应元件,参与花粉萌发及花粉管生长调控；5、CML24的功能缺失改变了花粉管微丝骨架的结构,并可能由此影响花粉管的生长过程。细胞骨架特别是微丝骨架的动态变化及结构排布,在调控花粉萌发和花粉管生长中发挥着非常重要的作用。利用Alexa-488phalloidin与F-actin特异性结合后,激光共聚焦显微镜观察,发现与Co1-0相比,cml24-T1和ml24-4突变体花粉管F-actin大部分呈现一种紊乱的状态。有的缺失亚顶端的致密结构,有的缺失纵向排布的微丝束。Col-0具有正常肌动蛋白结构的花粉管约占总检测花粉管的91.25%,而突变体这一比例仅为12.38%。胞外添加不同浓度的肌动蛋白抑制剂LatB时,与野生型相比,突变体的花粉萌发和花粉管生长对胞外LatB的浓度变化都是不敏感的。这些结果表明,微丝骨架在突变体中的结构变化可能是影响其萌发和花粉管生长的重要原因；6、体内和体外研究结果均表明,突变体cml24-4的花粉管转向异常。在向胚珠生长时,很多花粉管不能正确进入珠孔完成双受精,影响了种子的形成,导致cml24-4果荚结实率比野生型低。NO可能在花粉管的导向生长中发挥重要的作用。当NO浓度升高时,花粉管生长速率降低,生长方向随之改变。使用DAF-FMDA检测花粉管胞内NO含量,结果显示cml24-4花粉管NO含量明显高于Col-0。因此我们初步推断,cml24-4突变体花粉管胞内NO的升高导致花粉管向胚珠转向异常,改变了花粉管的生长方向,导致其不能正确的进入胚珠完成双受精,影响了果荚的结实率。但是以上结论的最终确定,还需要后续更多实验数据的支持。本论文的研究结果表明,CML24主要分布在胞质中,可能作为Ca2+信号的下游感受器正向调控拟南芥花粉管极性生长。CML24突变体Ca2+下游调控通路被阻断,同时下游信号途径引发反馈调控,导致胞内Ca2+浓度增加,也同时造成花粉管生长对胞外Ca2+浓度变化不敏感。突变体胞质Ca2+浓度的升高,引起花粉管细胞骨架结构紊乱,进而影响花粉管的生长速率。而CML24突变体花粉管的转向异常现象,可能是由于胞内NO浓度升高所致,并最终造成了突变体结实率的降低。本论文以Ca2+信号感受器CML24作为研究对象,采用分子生物学和细胞生物学等方法,探讨了CML24在调控花粉管极性生长中的功能,推测CML24参与了Ca2+信号、微丝骨架排布,以及NO信号,并进而影响花粉萌发及花粉管的生长及转向,为进一步研究花粉管信号转导网络及调控机制奠定了基础。
康二芳[4]2017年在《拟南芥MAP18通过调控ROP2活性调节根毛顶端生长的分子机制研究》文中研究指明根毛是植物根表皮细胞向外突起伸长形成的管状结构,在植物吸收水分、营养物质及与外界环境相互作用的过程中发挥重要功能。此外,作为典型的进行顶端生长的植物细胞,根毛是真核细胞中研究细胞极性建立、维持以及形态发生的模式系统之一,对根毛顶端生长调控机制的研究具有重要的生物学意义。研究表明,根毛细胞的顶端生长受Ca2+、囊泡运输、细胞骨架、小G蛋白、活性氧等多种因素调控。ROP GTPases是一类植物中特有的小G蛋白,参与调控植物生长发育的众多生理过程。ROP GTPases作为细胞中重要的分子开关,其活性的精密调控对于发挥功能至关重要。研究表明ROPs参与调控拟南芥根毛的生长发育。其中ROP2定位于根毛的起始部位以及生长根毛的顶端质膜(Plasma membrane,PM)上,调控根毛的起始以及极性生长。本实验室之前报道MAP18(Microtubule-associated protein 18)是既能结合微管又能结合微丝的蛋白,在进行极性扩张性生长的叶片铺板细胞和下胚轴表皮细胞中作为微管的去稳定因子调控周质微管的组织动态,进而调节细胞的极性生长;而在进行顶端生长的花粉管中,MAP18通过其钙依赖的切割微丝活性调控微丝的组织动态,调节花粉管的生长方向。MAP18在根毛中有很高的表达水平,暗示了 MAP18很可能在根毛中发挥重要生理功能。本论文通过观察MAP18与ROP2单突变体、双突变体及过量表达植株的根毛表型发现MAP18有可能参与ROP2信号途径对根毛顶端生长的调控。此外,体内与体外的生化实验证据表明MAP18可以与ROP2直接结合,并且更倾向结合无活性形式的ROP2(包括与GDP结合的ROP2和负显性突变的DN-ROP2)。体外效应子结合实验和体内GFP-ROP2定位的观察及量化分析表明,MAP18能够正调控根毛顶端ROP2的活性。进一步的研究显示MAP18是通过与AtRhoGDI1/SCN1(RhoGTPase GDP dissociation inhibitor 1/Supercentipede 1)竞争结合无活性的 ROP2,从而有利于根毛顶端ROP2的激活,调控根毛的生长发育。随后又对MAP18氨基酸序列进行比对分析,并构建了MAP18截断突变体蛋白进行功能结构域的研究,发现MAP18蛋白N端的23个氨基酸(N23)是MAP18与ROP2作用的关键片段,截除N23片段后的MAP18△N23蛋白不能与ROP2结合,也不能与AtRhoGDI1/SCN1竞争结合无活性的ROP2。同时利用MAP18的VEEKK基序点突变蛋白进行研究发现,丧失MAP18切割微丝的活性并不会影响其与无活性的ROP2的结合,结合药理学实验,本研究认为MAP18对根毛中ROP2活性的调控独立于MAP18与微丝和微管的相互作用。此外,本论文还发现MAP18在根毛顶端也能切割微丝调控微丝的组织动态,影响根毛中细胞核的正确定位。综上所述,本论文发现MAP18在根毛中既能作用于微丝骨架调控细胞核的正确定位,也参与ROP2信号途径调控根毛的顶端生长。MAP18通过与ROP2活性的负调控因子AtRhoGDI1/SCN1之间的竞争作用,调节根毛顶端ROP2活性,以及根毛的顶端生长。本研究阐述了 MAP18参与ROP2信号途径调控根毛生长的机制,也揭示了植物细胞极性生长调控中,对于ROPs活性调控的新机制,有助于深入理解植物细胞极性生长和形态建成的调控机理以及真核细胞中Rho GTPases的信号转导机制,具有重要的科学理论意义。
赵亮涛[5]2012年在《拟南芥花粉管生长缺陷突变体fpg1的表型分析及功能初探》文中研究指明花粉管的萌发和生长是有花植物成功完成双受精过程的必要条件,大量研究表明,有许多分子机制参与并调控这一过程的发生。本文以模式植物拟南芥为研究材料,通过观察分析了约3500株左右订购的拟南芥纯合T-DNA插入突变体的花粉管萌发及生长情况,筛选分离到一株花粉管萌发加快的突变体fast of pollen germination1(fpgl),并对该突变体的表型及基因功能进行了相关的研究和分析,主要的研究结果如下：(1)在体外培养条件下,fpg1花粉萌发及花粉管生长速率比野生型迅速。与野生型相比,突变体的莲座叶叶片小、叶柄短,且花柱较野生型长,使其不能被正常授粉,呈现育性下降的表型。(2)通过Realtime-PCR的方法检测FPG1基因的表达发现FPG1为生殖器官特异性表达基因,在花柱及成熟花粉中的表达量高,同时还证明了突变体中FPG1基因位点的T-DNA插入影响了该基因在花粉中的表达。而且突变体花粉管的萌发和生长加快可能与细胞极性生长调控基因的上调存在相关性。(3)回交实验证明fpg1为隐性单基因突变体。通过功能互补分析发现外源FPG1基因的插入恢复了突变体植株的发育及花粉管的正常萌发和生长,证明了突变体的发育缺陷是由于FPG1基因功能的丧失引起的。(4)通过分析突变体花粉在含Latrunculin B的培养基上的生长发现,突变体花粉管萌发和生长不受Latrunculin B的影响,说明微丝的动态发育不影响FPGl参与花粉管的萌发及生长。
李素娟[6]2007年在《细胞质膜质子泵在拟南芥花粉萌发过程中的作用》文中进行了进一步梳理花粉萌发和花粉管生长的调控是植物发育生物学中的关键问题之一。花粉细胞质膜上存在质子泵,由其活化导致的H+外流可以影响细胞膜电位,引发一系列信号转导过程。为了探索花粉细胞质膜质子泵在花粉萌发和花粉管生长过程中的作用及其可能的作用机理,本文以拟南芥花粉为材料,采用常规植物生理学方法和数字荧光比率测定技术,利用细胞质膜质子泵特异性激活剂壳梭孢菌素和抑制剂钒酸钠对花粉细胞进行处理,对质子泵活性调节剂在花粉萌发、花粉管生长及细胞内钙离子浓度等方面的影响进行了研究。实验结果表明,质膜质子泵特异性激活剂壳梭孢菌素处理后,花粉的萌发率升高,花粉管长度也有明显增加,而其抑制剂钒酸钠处理后,花粉萌发率降低,花粉管长度较对照减小。壳梭孢菌素处理后花粉细胞内钙离子浓度总体呈现上升趋势,钒酸钠处理后细胞内钙离子浓度总体呈现下降趋势。实验结果说明,花粉细胞质膜质子泵在花粉萌发和花粉管生长过程中发挥重要的正向调控作用,这一作用有可能是通过促进细胞内钙离子浓度升高和钙信号的产生实现的。异叁聚体G蛋白在跨膜信号转导过程中发挥重要的调控作用,为探究花粉萌发和花粉管生长调控过程中是否通过异叁聚体G蛋白将胞外信号转换为胞内信号,花粉细胞质膜质子泵和异叁聚体G蛋白的关系,本实验采用野生型拟南芥、G蛋白缺失突变体和超表达株系为材料,对不同基因型花粉在质子泵激活剂和抑制剂处理后花粉萌发、花粉管生长和细胞内钙离子变化的差异进行了检测和比较。实验结果表明,野生型、缺失突变体和超表达株系在质子泵激活剂、抑制剂处理后花粉萌发、花粉管生长和钙离子浓度变化上没有明显差别。推测异叁聚体G蛋白在花粉细胞信号转导过程中可能存在于质子泵的上游,也可能与质子泵没有直接关系。
王双双[7]2015年在《拟南芥CML25调控花粉萌发及花粉管生长的机理研究》文中进行了进一步梳理花粉正常萌发和花粉管快速极性生长是保证被子植物顺利进行双受精并完成其生活史的关键,但其中具体的分子调节机制并不完全清楚。已有研究表明,Ca2+作为植物细胞普遍存在的第二信使,也同样是花粉萌发和花粉管生长必须的调控因子,这预示着Ca2+信号相关的信号通路对于花粉萌发和花粉管生长至关重要,但是Ca2+下游参与调控这些生理过程的具体分子机制和信号转导途径,到目前仍所知甚少。Ca2+作为胞内第二信使,可以被具有EF-手型结构(EF-hand motif) Ca2+结合区域的钙感受蛋白结合,后者在结合Ca2+后蛋白构象发生改变,进而将Ca2+信号传递下去,钙调素类似蛋白(Calmodulin Like Protein; CML)家族即是钙感受蛋白的重要组成成员。CML是植物细胞中特有的钙感受蛋白,在拟南芥中有50个成员,与钙调素蛋白有一定序列相似性,但家族中绝大多数成员的生理功能未知。通过对基因芯片数据进行分析,发现CML25在拟南芥花粉及花粉管中大量且特异的表达,预示着该基因在调控花粉萌发及花粉管生长过程中可能起着重要作用。因此,本论文以拟南芥Ca2+结合蛋白CML25作为研究对象,详细探讨其调控花粉萌发和花粉管生长的功能和作用机制,发现CML25作为一个新的钙信号下游响应元件,参与了Ca2+调控花粉萌发及花粉管生长的信号转导途径。为明确CML25的生化特性及生理功能,本论文首先对CML25的Ca2+结合特性检验、组织定位和在花粉萌发及花粉管生长过程中的作用进行了分析。得到高纯度的CML25蛋白后进行Ca2+结合实验,结果表明CML25与钙结合后其蛋白电泳迁移率发生改变,证明其具有Ca2+结合能力,并在结合Ca2+后发生了蛋白构象变化。通过qPCR和CML25 promoter连接GUS进行该基因组织表达分析,结果显示CML25在花粉和花粉管中大量表达,与芯片数据一致,预示着CML25可能与雄配子体的正常生理功能相关。为了研究CML25的生理功能,筛选获得CML25两个T-DNA有效插入突变体cml25-1和cml25-2,利用体外和体内花粉萌发和花粉管生长表型检测体系发现,突变体花粉萌发率降低,花粉管生长速率及最终长度降低,并导致了种子结实率下降,而且这些性状可以被重新表达的CML25恢复。以上结果显示,CML25是在花粉和花粉管大量表达的钙结合蛋白,并作为正调控元件参与了花粉萌发及花粉管生长的生理过程。为进一步明确CML25参与花粉萌发及花粉管生长调控的作用机理,对其亚细胞定位、功能缺失突变体对胞外离子浓度变化的反应差异及可能参与的胞内信号途径进行了系统分析。利用CML25::GFP进行亚细胞定位分析,结果显示CML25是胞质定位蛋白,可能参与介导胞质Ca2+信号；通过分析梯度胞外Ca2+和K+浓度对花粉萌发和花粉管生长的影响,发现cml25突变体对胞外Ca2+和K+浓度变化的响应敏感性降低：利用Ca2+结合荧光染料Fluo-3标记发现,cml25突变体花粉细胞中胞内Ca2+浓度增加,且花粉管顶端Ca2+正常的浓度梯度也受到了破坏,说明胞内Ca2+信号发生了改变；利用花粉及花粉管原生质体电生理膜片钳技术,研究全细胞K+内向电流对胞质Ca2+浓度变化的响应,结果表明cml25突变体中胞内高浓度的Ca2+对花粉和花粉管原生质体质膜内向K+电流的抑制作用不敏感。以上结果显示,CML25可能在胞内介导了Ca2+信号对成熟花粉和花粉管K+的吸收过程,进而参与Ca2+调控的花粉萌发及花粉管生长。为深入研究CML25参与介导的钙信号调控跨膜离子转运的下游分子机制和信号网络,本论文进行了CML25互作蛋白的筛选。利用酵母双杂交系统筛选拟南芥cDNA文库,获得了CML25可能的相互作用蛋白CIP1 (CML25 Interacting Protein 1),并进一步利用酵母、BiFC技术结合叶肉原生质体瞬时转化方法及亚细胞定位等方法,证明CML25与CIP1存在互作,且发生互作的位置在细胞质中。利用CIP1的过表达株系(CIP1-OE5, CIP1-OE6)和沉默株系(CDP1-R1,CIP1-R2)进行花粉萌发及花粉管生长实验,发现CIP1是花粉管生长的负调控因子。综上所述,本论文研究发现,在花粉和花粉管中高效表达的钙调素类似蛋白CML25,可以为Ca2+结合调控,并在胞质内作为正调控因子,介导Ca2+调控的质膜K+内流,调控拟南芥花粉萌发和花粉管生长。
张伟[8]2005年在《蚕豆保卫细胞质膜钙通透性通道渗透调节机制研究及拟南芥TPC1基因的克隆与鉴定》文中认为胞质自由Ca~(2+)是植物细胞普遍存在的第二信使,介导植物对体内外多种刺激产生相应反应。细胞质膜钙通道介导的Ca~(2+)向胞质的转运对于胞质钙信号产生至关重要,因此,对植物细胞质膜钙通道进行研究并了解其调控机制,对于植物细胞信号转导网络研究具有重要意义。 本论文第一部分工作以蚕豆保卫细胞为实验材料,利用膜片钳等技术手段,对保卫细胞质膜钙通道进行记录、鉴定并对其调控因素进行研究,提出了渗透势在调控气孔运动过程中可能的作用机制。利用Ba~(2+)作为通透性离子在全细胞水平记录到内向电流,逆转电位及抑制剂实验分析表明,该电流为Ba~(2+)通过质膜钙通道内流形成。渗透势和微丝参与了全细胞钙通道电流的调控,胞外低渗和微丝解聚剂可以激活通道电流,且渗透势的作用是通过改变微丝结构进而调控通道的活性。单通道水平在蚕豆保卫细胞质膜上记录到张力激活型和电压依赖型两类钙通透性通道,其中张力激活型钙通道的激活依赖于质膜所受的张力,开放几率与张力大小成正比,张力激活型钙通道的开放还受跨膜电位调控,通道电流幅度与质膜超极化程度成正比,本实验条件下记录到的张力激活型钙通道电导为19.7 pS;蚕豆保卫细胞质膜上还存在有电压依赖型钙通道,其激活依赖于质膜超极化,单通道电导为14.3 pS。对这两类通道电流分别进行逆转电位分析、抑制剂鉴定、跨膜Ba~(2+)浓度依赖性及Ca~(2+)通透性等特性鉴定,表明实验中所记录的电流信号为跨质膜钙通透性通道的内向电流。同时发现,微丝参与了对张力激活型及电压依赖型钙通道的调控,微丝解聚后激活通道。进一步实验结果表明,渗透势对全细胞水平通道的激活作用至少部分通过张力激活型钙通透性通道来介导。利用激光共聚焦显微技术,测定渗透势、微丝解聚剂等因素对蚕豆保卫细胞原生质体胞质自由Ca~(2+)浓度的影响,结果表明:胞外低渗、微丝解聚均可引起胞内自由Ca~(2+)浓度的升高,且微丝解聚剂可在高渗下引起胞质Ca~(2+)浓度升高,这些因素引起的Ca~(2+)升高可以被胞外添加Ca~(2+)通道抑制剂所抑制,说明胞内Ca~(2+)浓度升高依赖于胞外Ca~(2+)的流入。在胞内外都以Ca~(2+)为通透离子的情况下,发现蚕豆保卫细胞质膜电压依赖型钙通道可以介导胞内K~+外流,这在气孔保卫细胞对内外界刺激迅速作出反应中有重要意义。实验过程中在蚕豆保卫细胞质膜上还记录到一类高电导的钙通透性通道,单通道电导为正常通道电导的5倍,推测这类高电导通道的存在可能使某些保卫细胞对逆境信号作出更加快速的反应。 本论文另一部分工作对拟南芥可能钙通道基因进行克隆及功能鉴定。克隆到的拟南芥AtTPC1基因可以互补酵母电压门控钙通道CCH1的功能并恢复Ca~(2+)吸收缺陷型cch1的性状。利用Promoter+GUS手段对AtTPC1基因进行了幼苗到开花期植株的组织表达定位,结果显示该基因在植株整体表达,但在各组织部位的表达强度不同。利用AtTPC1-GFP策略对瞬时表达的基因产物进行亚细胞定位,基因枪转化的洋葱表皮细胞显示,GFP荧光出现在膜结构区域。利用电压钳系统对体外转录后的AtTPC1基因cRNA产物进行电压钳记录,没有记录到电流,同时转录表达的KAT1基因cRNA产物作为对照可以记录到内向电流。利用AtTPC1基因功能缺失突变体及过表达突变体进行性状筛选,所选用的指标为高盐,低钾,高、低钙,高渗透势及干旱胁迫,但未发现与野生型植株间有明显差异。
王玉娇[9]2014年在《拟南芥AtHMGB15基因在花粉管萌发生长过程中的功能研究》文中进行了进一步梳理显花植物拟南芥的雄配子(精细胞)形成于雄配子体(花粉粒)中,花粉粒是一个由一个营养细胞包含两个精细胞组成的叁细胞生命单元。在开花时,花粉粒被传递到雌蕊的柱头上,通过互相识别,花粉粒水合萌发出花粉管,花粉管在雌蕊的花粉管通道中进行极性伸长生长并将精细胞输送到雌配子体(胚囊)中完成双受精。因此,花粉萌发和花粉管生长对植物的有性生殖十分重要,但目前对这一过程中的基因表达调控机制还缺乏了解。在前期的研究中,我们研究组利用Ac/Ds基因陷阱和增强子陷阱技术鉴定出转录因子基因AtHMGB15在花粉萌发和花粉管生长中起重要作用。初步的研究结果显示该基因在花粉和花粉管中特异表达,AtHMGB15蛋白定位在花粉的营养核中athmgb15-1突变体花粉在体外培养条件下萌发率降低,遗传传递率显着下降。为了进一步了解AtHMGB15基因在花粉萌发和花粉管生长过程的作用和调控机制,本研究刘athmgb15-1突变体的表型、遗传特性、AtHMGB15的表达模式和AtHMGB15蛋白的功能进行了更为深入和细致的分析研究。结果显示,与野生型相比athmgb15-1突变体的自交结实率显着地降低,角果短小。人工授粉试验显示,athmgb15-1突变体花粉可以在柱头上萌发,但大部分花粉管的生长受到了严重的影响,长度较短,无法把精细胞送入胚囊中进行受精。AtHMGB15编码一个属于植物特有的ARID-HMG蛋白家族的蛋白质,其氨基酸序列与ARID-HMG1、ARID-HMG2和AtHMGB11的具有很高的相似性。遗传分析表明,ARID-HMG1、 ARID-HMG2和AtHMGB11基因的单突变体均不影响雄配子体功能,athmgb15-1athmgb11双突变体的表型则比athmgb15-1突变体的表型明显地增强,说明AtHMGB15和AtHMGB11基因可能具有功能冗余性。AtHMGB15蛋白与ARID-HMG蛋白家族其它成员一样,也具有ARID和HMG-box结构域,能在体外结合具有某种特殊结构的DNA,并能自己形成同源聚合体或与同族的其它成员形成异源聚合体。基因芯片分析比较athmgb15-1突变体与野生型成熟花粉转录组结果显示,1686个基因在athmgb15-1突变体中的表达量发生了明显的变化,其中585个基因的表达量下调两倍以上,1101个基因的表达量上调两倍以上。这些基因包括与细胞壁合成和修饰、信号转导、囊泡运输和转录翻译调控等相关的基因,其中的许多基因已被证实是对花粉发育及花粉管萌发生长非常重要的基因。荧光素酶互补和双分子荧光互补试验显示,AtHMGB15可与花粉转录因子AGL66或AGL104结合。比较athmgb15-1和gl66ag1104-2双突变体的花粉转录谱显示它们可能共同调控花粉中许多基因的转录。遗传分析结果显示athmgb15-1ag166ag1104-2元突变体的表型比athmgb15-1和ag166ag1104-2的表型都有所增强。这些结果表明AtHMGB15是与AGL66和AGL104在同一条调控通路上发挥作用。此外,AtHMGB15还可以与通用转录因子AtTFIIB1和MADS转录因子AGL18相互作用。总而言之,AtHMGB15蛋白可能以同源聚合体的形式,通过与AGL66、AGL104、AGL18和AtTFIIB1等其它转录因子互作调控下游基因的表达,从而调控花粉萌发和花粉管生长。
杜长青[10]2016年在《拟南芥类受体激酶RIPK与FERONIA共响应RALF信号的遗传与生化分析》文中提出植物细胞的生长发育受到多种信号因子的调控,其分子机制的揭示和阐明有助于深化对细胞信号转导领域的理解,也将极大克服制约我国农业、林业等应用领域发展的一些亟需解决的技术瓶颈。细胞快速碱化因子(Rapidalkalinizationfactor,RALF)作为一类植物界保守的多肽激素,因其能快速抑制质膜氢泵(PM-H+ATPase)活性导致细胞壁碱化从而抑制细胞伸长而得名。近来研究表明拟南芥中的蛋白激酶FERONIA(FER)作为RALF1多肽信号的受体可通过胞外域与RALF1直接结合来感受RALF1信号刺激并将该信号传递至细胞内,最终调控质膜的氢泵活性(PM-H+ATPase,e.g.AHA2)来控制细胞伸长,但响应RALF1配体信号的早期精细分子机制并不十分清楚。例如蛋白激酶FER受体接受RALF1信号刺激后,如何将RALF1信号传递至细胞内?是否存在一些下游成员,如胞质类受体激酶(RLCK)参与了该信号通路?如果存在,这些胞内的下游成员又以何种方式参与了该信号通路呢?因此深入研究能够与蛋白激酶FER直接相互作用的下游分子如胞质类受体激酶RLCK,并阐明其信号传导的分子机制将有助于我们揭示受体蛋白激酶FER接受、传递RALF1小肽信号并最终调控细胞生长的早期精细分子机制。本论文依据此研究思路开展了一系列的生化与遗传学实验,论文的具体研究结果如下:(1)利用质谱,酵母双杂交(Y2H),双荧光互补(BiFC),GST-pull down及Co-IP等多种分析蛋白相互作用的技术手段证明了 一个拟南芥的胞质类受体激酶(RLCK-RIPK)能够与FER受体蛋白激酶特异性的相互作用,且相互作用的强弱依赖于彼此的激酶活性。(2)遗传学表型分析表明RIPK突变后表现出与FER突变类似的遗传学表型,如根毛变短,根基酸化速率增强,植株形态及叶片变小,对生长素NAA不敏感而对ABA敏感等。表型回复实验表明将RIPK过表达入FER突变体fer-4植株中能够部分恢复FER的功能,证明FER与RIPK存在遗传上的上下游关系。(3)利用大肠杆菌原核表达系统高效表达了融合GST标签的RIPK重组蛋白GST-RIPK,利用纯化的GST-RIPK重组蛋白作为抗原免疫小白鼠制备了特异性较好的RIPK多克隆抗体。以野生型Col.0和ripk突变体为材料,利用Western blot技术结合碱性磷酸酶(Calf intestinal alkaline phosphatase;CIP)处理,证明了胞质类受体激酶RIPK在拟南芥体内存在两种形式,分子量介于70 kDa和55 kDa之间。一种为非磷酸化的形式,我们命名为RIPK;另一种为磷酸化的形式,我们命名为P-RIPK。(4)通过分析野生型Co1.0与ripk突变体中FER的磷酸化水平变化及野生型Co1.0与fer-4突变体中RIPK的磷酸化水平变化并结合FER激酶和RIPK激酶相互磷酸化的体外实验证明了 FER与RIPK的相互作用依赖促进彼此的磷酸化水平变化。(5)分析了 RIPK磷酸化水平的变化对RALF1小肽时间及浓度梯度的依赖性,结合RIPK突变体对RALF1小肽的响应情况证明了 RIPK直接响应RALF1小肽,且磷酸化水平受到RALF1小肽的调控。RIPK突变后降低了对RALF1小肽的敏感程度。(6)通过添加外源RALF1小肽诱导与否,利用双荧光互补(BiFC)及Co-IP等技术进一步证明了 FER与RIPK在细胞膜上的相互作用受RALF1小肽增强。此外我们利用酵母双杂交技术在单子叶模式植物水稻中也证明了 FER的同源蛋白OsFLR2与RIPK的同源蛋白OsRIPK-A存在相互作用。生物信息学及Q-PCR分析进一步证明了 RALF1,FER与RIPK在植物界比较保守且存在表达模式上的重迭,因此RALF1-FER-RIPK可能代表了植物界一种普遍的RALF1小肽信号传递模式。综上所述,本研究结果将极大丰富对RALF1-FER信号网络调节细胞伸长分子机制的理解。
参考文献：
[1]. 拟南芥花粉管振荡生长观察及其调控机制的初步研究[D]. 张文正. 中国农业大学. 2004
[2]. 拟南芥蛋白激酶PTI1-5在花粉管和根毛生长中的作用研究[D]. 廖宏泽. 中国农业大学. 2017
[3]. 拟南芥CML24调控花粉萌发及花粉管生长的功能研究[D]. 杨雪. 山东大学. 2014
[4]. 拟南芥MAP18通过调控ROP2活性调节根毛顶端生长的分子机制研究[D]. 康二芳. 中国农业大学. 2017
[5]. 拟南芥花粉管生长缺陷突变体fpg1的表型分析及功能初探[D]. 赵亮涛. 兰州大学. 2012
[6]. 细胞质膜质子泵在拟南芥花粉萌发过程中的作用[D]. 李素娟. 河北师范大学. 2007
[7]. 拟南芥CML25调控花粉萌发及花粉管生长的机理研究[D]. 王双双. 山东大学. 2015
[8]. 蚕豆保卫细胞质膜钙通透性通道渗透调节机制研究及拟南芥TPC1基因的克隆与鉴定[D]. 张伟. 中国农业大学. 2005
[9]. 拟南芥AtHMGB15基因在花粉管萌发生长过程中的功能研究[D]. 王玉娇. 中国农业大学. 2014
[10]. 拟南芥类受体激酶RIPK与FERONIA共响应RALF信号的遗传与生化分析[D]. 杜长青. 湖南大学. 2016