卡特利链霉菌中巨型线性质粒消除方法的研究

论文摘要

与其他原核生物相比,链霉菌具有特殊的基因组结构,表现为基因组较大、GC含量高,且是细菌中罕见的含有线性染色体及线性质粒的种属。卡特利链霉菌（Streptomyces cattleya）是自然界中极少数能够合成含氟化合物的微生物。课题组李鹏博士之前对一株卡特利链霉菌S.cattleya DSM 46488进行了全基因组测序,测序结果与脉冲场凝胶电泳结果一致,发现此菌株基因组中含有两个线性复制子,分别是6.3 Mb的染色体和1.8 Mb的巨型质粒。对此1.8 Mb的线性质粒分析发现,其中并不含有编码任何与主代谢相关的rRNA或tRNA基因,且不包含其他已测序链霉菌染色体的保守基因。并且在parAB基因附近存在一段大小为2 kb且能赋予质粒进行环状复制的复制起始区。链霉菌中质粒的拷贝数较低,且通常为线性状态,因此相对环形质粒较为稳定。但目前已有报道通过化学诱变法、分子遗传法敲除必需基因等方法消除了链霉菌中的线性质粒。因S.cattleya DSM46488的巨型线性质粒中并不含有必需基因,且不包含其他已测序链霉菌的保守基因,故本论文通过尝试不同消除方法来探究此巨型质粒能否被消除。首先本论文尝试用SDS高温化学诱变法消除质粒,通过用终浓度为0.02g/L的SDS处理孢子悬浮液,但经过数轮无SDS松弛传代培养后,并未在后代中挑选到丢失巨型质粒的突变株。之后我们用同源重组双交换法敲除了巨型质粒中的parAB基因,此基因在遗传物质由父代向子代分配过程中发挥重要作用。经过数轮无抗生素松弛培养后,发现parAB基因的敲除并没有引起巨型质粒的消除。故我们又对赋予巨型质粒进行环形复制的最小复制区域及其上下游大小共8 kb的片段（此8 kb片段包含parAB基因）进行了敲除,但数轮无抗生素松弛培养后发现敲除了8 kb片段的巨型质粒仍未丢失。因利用外源CRISPR/Cas9系统编辑基因时不会引入外源抗性基因,在质粒消除方面有一定优势,故本论文尝试利用孙宇辉等人构建的经密码子优化后适用于链霉菌基因编辑的外源CRISPR/Cas9-CodA（sm）系统[1],对pSCATT中的8 kb片段进行敲除。在待敲除8kb片段中设计符合要求的gRNA及其上下游同源片段,插入pWHU2653中,但实验结果表明,构建好的质粒一直无法转入卡特利链霉菌中,导致无法对质粒的基因进行编辑。因此我们猜想,是否是卡特利链霉菌自身含有的内源性CRISPR系统影响了外源CRISPR/Cas9系统的进入。因而本文探究了卡特利链霉菌自身内源性CRISPR系统的分布、特征,本论文对46株链霉菌中的182个CRISPR基因簇进行了识别、分析,包括重复序列DRs、间隔序列spacers的序列比对及相似性分析;cas基因簇的预测及分类。其中卡特利链霉菌S.cattleya DSM 46488中预测到2个CRISPR基因簇,CRISPRID分别为NC0161111、NC0175861,分别含有3个spacer,但这两个基因簇附近均未预测到有cas基因簇的存在。总之,本论文通过不同方法对巨型线性质粒尝试消除,但均未得到质粒丢失的突变株,从而确定了卡特利S.cattleya DSM 46488中占基因组比例较大的1.8 Mb巨型线性质粒是非常稳定的。同时,对46株链霉菌中182个内源性CRISPR基因簇的分析将对于日后利用其编辑卡特利线性质粒的基因、开展链霉菌的基因组进化研究提供帮助。

论文目录

摘要

ABSTRACT

符号说明

第一章绪论

1.1 卡特利链霉菌的巨型线性质粒

1.1.1 卡特利链霉菌特殊的基因组结构

1.1.2 链霉菌中的质粒类型

1.1.3 链霉菌中巨型线性质粒的分布情况

1.2 卡特利链霉菌线性质粒的复制机制

1.2.1 链霉菌中质粒的复制机制

1.2.2 卡特利链霉菌DSM46488 线性质粒的复制机制

1.3 卡特利链霉菌中质粒的消除方法的研究进展

1.3.1 链霉菌中质粒的消除方法

1.3.2 利用外源CRISPR/Cas9 系统编辑基因以消除质粒

1.3.3 利用内源CRISPR系统进行基因编辑的进展

1.4 本论文的立题依据及主要研究内容

第二章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 质粒

2.1.3 PCR引物

2.1.4 培养基及化学试剂

2.2 实验方法

2.2.1 大肠杆菌的培养和保藏

2.2.2 链霉菌的培养和保藏

2.2.3 大肠杆菌质粒DNA提取（碱裂解法）

2.2.4 大肠杆菌质粒DNA的提取（天根公司少量质粒试剂盒提取）

2.2.5 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取与检测（快检）

2.2.6 链霉菌总DNA少量提取

2.2.7 常规PCR扩增

2.2.8 重叠延伸PCR扩增（Splicing by Overlapping PCR,SOE-PCR）

2.2.9 DNA片段的酶切、回收及连接

2.2.10 NEB公司Gibson Aseembly Master Mix试剂的使用方法

2.2.11 载体的去磷酸化处理

2.2.12 大肠杆菌钙转感受态细胞的制备及转化

2.2.13 质粒DNA通过结合转移从大肠杆菌转至链霉菌

2.2.14 同源重组双交换法敲除链霉菌基因组基因

2.2.15 利用CRISPR/Cas9-codA（sm）系统敲除链霉菌基因组基因

2.2.16 SDS高温化学法诱变S.cattleya DSM46488 孢子悬浮液

2.2.17 高压脉冲场凝胶电泳（PFGE）

2.2.18 链霉菌中内源CRISPR基因簇的识别及分析

第三章 S.cattleya DSM46488 中巨型线性质粒pSCATT的消除

3.1 SDS高温化学法消除巨型线性质粒pSCATT

3.1.1 SDS浓度的确定

3.1.2 SDS高温化学法处理卡特利链霉菌DSM46488 孢子培养液

3.1.3 亚甲基蓝筛选及PCR检测

3.2 同源重组双交换法敲除pSCATT中的parAB基因

3.2.1 parAB基因敲除载体的构建

3.2.2 pSCATT中 parAB的缺失

3.2.3 pSCATT中 parAB缺失突变株的松弛培养

3.3 同源重组双交换敲除pSCATT中 parAB及其上下游共8 kb片段

3.3.1 8 kb片段基因敲除载体的构建

3.3.2 pSCATT中8 kb片段的缺失

3.3.3 pSCATT中8 kb片段缺失突变株的松弛培养

3.4 小结

第四章利用CRISPR/Cas系统编辑pSCATT中的基因

4.1 利用外源CRISPR/Cas9-CodA（sm）系统敲除pSCATT中8 kb片段

4.2 利用外源CRISPR/Cas9-CodA（sm）系统编辑pSCATT中三个位点

4.3 链霉菌中内源CRISPR基因簇的识别及分析

4.3.1 46 株链霉菌中CRISPR基因簇的识别

4.3.2 CRISPR基因簇中重复序列DRs的比较分析

4.3.3 CRISPR基因簇中间隔序列的同源性分析

4.3.4 CRISPR基因簇附近cas基因簇的识别

4.4 小结

第五章总结与展望

5.1 总结

5.2 创新点

5.3 展望

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间已发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张锦琦

导师: 欧竑宇

关键词: 卡特利链霉菌,巨型线性质粒,同源重组双交换,基因簇

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 上海交通大学

分类号: Q78

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.002906

总页数: 83

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