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寨卡病毒蛋白NS5甲基化酶 SUMO化修饰研究

2020-12-02阅读(808)

寨卡病毒蛋白NS5甲基化酶 SUMO化修饰研究

论文摘要

寨卡病毒(ZIKV)的爆发、传播及发病机制尚不完全清楚。将过去不同时间、地点来源的非洲和亚洲ZIKV毒株的序列进行比对,实验室之前的工作发现不同毒株上赖氨酸的分布存在差异。赖氨酸是翻译后修饰(post translational modification,PTM)的重要靶点,如泛素化、乙酰化或类泛素化修饰。最近,我们及其他一些学者阐明了某些病毒蛋白附着的类泛素化修饰(SUMO)在病毒周期的不同阶段发挥重要作用。为了找到潜在的SUMO化修饰,我们分别在293T细胞中表达了ZIKV的不同蛋白与标签标记的SUMO蛋白来检测这些病毒蛋白是否有SUMO化修饰。Anupriya的WB图表明ZIKV NS5可以被SUMO化,与近期发现的DENV NS5蛋白可以被SUMO化修饰相一致。NS5蛋白是ZIKV RNA复制的重要组成部分,其C端部分利用RNA依赖性RNA聚合酶实现复制功能,在N端部分利用甲基转移酶(MTase)实现病毒RNA的甲基化。通过序列比对和定点突变,实验室之前的工作在NS5蛋白氨基term鉴定出一个SUMO化作用位点(SUMO interacting motif,SIM),该位点在所有的虫媒病毒中都高度保守,在所有的非洲株和亚洲或美洲株中都可以和SUMO蛋白非共价结合。此外,通过对不同赖氨酸的定点突变,Anupriya鉴定出在NS5蛋白氨基端的一个赖氨酸可以被SUMO化。有趣的是,该位点在亚洲/美洲株上是赖氨酸(K101),但非洲株是(R101)。然而,实验结果显示非洲毒株也可以被SUMO化修饰,这就提示可能不同于亚洲株非洲株可能在其他位点上与SUMO蛋白共价结合。本研究分别在大肠杆菌中表达了野生型和MTase结构域突变型的亚洲株NS5蛋白。我采取了多种方法提升蛋白表达的产量、纯度以及蛋白的稳定性,用不同的纯化标签期望在体外表达纯化出具有正确结构和SUMO化活性的NS5MTase蛋白。在体外进行的SUMO化活性实验证明NS5 MTase可以被SUMO化。并揭示SIM位点残基和K101R位点突变的突变体可以抑制SUMO化反应。这里,我们首次报导了亚洲/美洲株的NS5 MTase中的赖氨酸(K101)可以被SUMO化。ZIKV NS5蛋白的SUMO化对于病毒的复制起着关键作用,并且对神经组织损伤等严重病毒损伤有着重要意义。由于不同的毒株会造成不同的疾病综合征,我们的研究可能只在一定程度上解释病理机制以及ZIKV基因组是如何通过进化逐渐适应从中间媒介到人类宿主。SUMO化的相关体外研究,为研发抗ZIKV的药物提供了可能的有效靶点。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第1章引言
  •   1.1 ZIKV的发现和爆发
  •   1.2 ZIKV的传播模式
  •   1.3 ZIKV的基因组及结构
  •   1.4 ZIKV的疾病分析
  •   1.5 ZIKV的细胞病理
  •     1.5.1 ZIKV NS5 的结构和功能
  •     1.5.2 SUMO化是病毒蛋白翻译后被修饰的一种形式
  •   1.6 病症推理假说和研究目的
  •     1.6.1 病症推理假说
  •     1.6.2 研究目的
  • 第2章实验材料和方法
  •   2.1 实验条件摸索
  •     2.1.1 全长NS5或NS5（Nterm）MTase在细菌中的表达
  •     2.1.2.利用Nt6x His和Ct6x His标签和Thrombin site位点克隆Zika NS5全长
  •     2.1.3.仅克隆NS5 MTase
  •     2.1.4.质粒NS5 Full Length和 NS5 MTase的蛋白表达简析
  •   2.2 优化NS5 MTase的表达和纯化
  •     2.2.1.用 TAA终止密码子构建Zika NS5 MTase
  •     2.2.2.用 TGATGA构建Zika NS5 MTase
  •     2.2.3.测试TAA和 TGA载体的蛋白表达情况
  •   2.3 体外SUMOylation测定和分析的改进
  •     2.3.1 测试NS5 MTase与不同试剂盒的适应性
  •     2.3.2 构建His标签纯化Flag标记的Zika NS5 MTase质粒
  •     2.3.3 构建用于Flag纯化的Zika NS5 MTase-flag质粒
  •     2.3.4 用pet28a-His-NS5 MTase-Flag-TGATGA测试SUMO化
  •     2.3.5 优化溶液有利于His-NS5 MTase-Flag稳定
  •   2.4 完善实验平台
  •   2.5 运用搭建平台测试SUMO化反应
  • 第3章实验结果
  •   3.1 Zika NS5 MTase蛋白存在体外SUMO化
  •   3.2 WSLV和 Zika NS5 MTase的 SUMO化比较
  •   3.3 ZIKV NS5 MTase突变体的SUMO化分析
  •     3.3.1 构建蛋白表达载体,产生NS5 MTase突变体
  •     3.3.2 用pet28a-His-NS5 MTase-Flag突变测试SUMO化
  • 第4章讨论
  • 第5章 总结
  • 附录:实验材料和实验方法
  •   附录 1. 如何构建pet28a蛋白表达质粒
  •   附录 2. 用于NS5 SIM基序和K101R突变反应的引物列表
  •   附录 3. Zika NS5 MTase蛋白的His纯化方案
  •   附录 4. Zika NS5 MTase的Flag纯化方案
  • 参考文献
  • 名词解释
  • 致谢
  • 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 黄鹂

    导师: Dimitri Lavillette

    关键词: 寨卡病毒,体外表达,甲基化,类泛素化

    来源: 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

    年度: 2019

    分类: 基础科学,医药卫生科技

    专业: 生物学,基础医学

    单位: 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

    基金: 国际合作研究项目

    分类号: R373

    DOI: 10.27915/d.cnki.gkbsd.2019.000017

    总页数: 90

    文件大小: 4371K

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