基于单抗捕获牛病毒性腹泻病毒抗原ELISA方法的建立及病原流行病学调查

论文摘要

牛病毒性腹泻-黏膜病（BVD-MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）引起的牛的一种临床上以高热、流涎、腹泻、粘膜充血、溃疡、生产性能下降、孕牛流产、犊牛呈现免疫耐受和持续性感染为特征的传染病。该病在世界上许多国家和地区广泛流行,严重影响养牛业的健康发展。BVDV除感染牛外,也可感染羊、鹿、猪及其他野生型动物。依据病毒能否引起细胞病变,BVDV可以分为致细胞病变（cytopathic,CP）和非致细胞病变（non-cytopathic,NCP）两种生物型。根据病毒基因组核苷酸序列的差异,BVDV又可分为I和II两种基因型,不同基因型又可进一步分为不同基因亚型。分子流行病学研究发现,国内目前流行的BVDV毒株主要以BVDV-Ib和Im两种基因亚型为主。近年来,BVDV感染一直是阻碍我国养牛业健康发展的重要传染病之一,因此,对BVDV的早期诊断与监控显得尤为重要。为建立一种特异、敏感、快速、简便且易于在基层推广应用的检测BVDV抗原的诊断方法,本研究基于BVDV CC13B毒株E2结构蛋白基因序列,应用分子生物学技术扩增及大肠杆菌原核表达系统表达了E2重组蛋白,并以此制备出了抗E2结构蛋白的单克隆抗体与多克隆抗体,建立了基于单抗捕获BVDV抗原的双抗体夹心ELISA方法。方阵滴定法试验确定出双抗体夹心ELISA方法所用的单克隆抗体的最佳包被量为200 ng/孔,酶标多克隆抗体的最佳稀释倍数为1 000倍稀释。对100份BVDV阴性的粪便样品进行了检测,以统计学方法确定出夹心ELISA检测BVDV抗原的判定标准,即待检样品OD490值≥x+3s=0.1567时,检测结果判定为阳性。特异性、敏感性及重复性试验结果表明本研究建立的检测BVDV抗原的方法具有特异、敏感、快速及重复性好等特点。以建立的夹心ELISA方法对山东、河南、吉林和宁夏四省部分地区不同牛场牛群BVDV感染情况进行了调查,发现牛场牛群BVDV感染率在028.30%之间,说明不同地区牛场牛群存在不同程度的BVDV感染。其中,对吉林省某牛场ELISA检测结果为BVDV阳性的粪便样品进行了病毒的分离与鉴定,获得3株BVDV毒株,分别命名为BVDV-JY1、BVDV-JY7以及BVDV-JY33。进化树分析发现,分离到的BVDV毒株的部分5’UTR基因序列与BVDV-Id亚型代表毒株的部分5’UTR基因序列有较高的同源性。综上所述,本研究基于CC13B毒株E2结构蛋白基因序列,制备出了抗E2结构蛋白的单克隆抗体与多克隆抗体,建立了一种特异、敏感、快速、易于在基层应用的双抗体夹心ELISA方法,为今后BVDV感染的早期诊断与监控提供了有效且可靠的技术手段。同时,本研究应用建立的双抗体夹心ELISA方法对部分地区BVDV病原进行了流行病学调查,为今后该病的防控提供了流行病学理论依据。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 胡俊英

导师: 王新平

关键词: 牛病毒性腹泻病毒,单克隆抗体,多克隆抗体,双抗体夹心,流行病学调查,病毒分离鉴定

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林大学

基金: “十三五”国家重点研发计划资助项目(2016YFD0500904,2017YFD0500104),国家自然科学基金资助项目(31572531)

分类号: S852.65

总页数: 81

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