论文摘要
线粒体是真核生物体内产生ATP的主要场所,其基因组（mtDNA）编码的蛋白是构成线粒体呼吸链复合体的重要亚基。PPR蛋白是指含有两个及以上串联重复的类PPR模体的蛋白质,而类PPR模体则是由35个氨基酸残基组成的结构域。粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中Ppr10蛋白对线粒体的翻译至关重要。前期的研究表明在含有线粒体内含子的背景下（yHL6381）,ppr10基因（Δppr10）的缺失影响了线粒体基因组编码的RNA水平,而且在不同程度上影响了线粒体基因组编码的蛋白的合成。因此,本文主要探究Ppr10蛋白是如何参与线粒体基因组翻译的。P3是不含线粒体内含子的菌株,其mtDNA编码的mRNAs不需要内含子的剪接。这更能帮助我们诠释Ppr10蛋白在线粒体中发挥的功能。粟酒裂殖酵母的mtDNA仅包含三个内含子,cox1中有2个I型内含子分别是cox1 I 1b和cox1 I 2b,cob1中有1个II型内含子为cob1 I 1。cox1 I 1b编码DNA核酸内切酶以及成熟酶,cox1 I 2b编码DNA核酸内切酶;cob1 I 1编码的蛋白具有逆转录酶活性和成熟酶活性并参与自身剪接。在本文中,我们构建Δppr10/P3菌株。通过点圈实验,我们发现Δppr10/P3菌株在非发酵型培养基中的生长受到影响,表明在不含线粒体内含子的遗传背景下（P3）Ppr10仍然与线粒体的功能密切相关。qRT-PCR和Northern blot结果表明,相对于不含线粒体内含子的P3菌株,Δppr10/P3菌株中cox1和cob1的mRNAs水平没有受到影响。而RT-PCR的结果表明,相比于P3菌株,在含有线粒体内含子的背景下ppr10的缺失影响了cox1、cob1的mRNAs的剪切。体内同位素标记mtDNA编码的蛋白质的实验表明,ppr10基因的缺失影响了线粒体基因组编码的蛋白合成。Western blotting实验结果表明,ppr10基因缺失导致Cob1、Cox1、Cox2、Cox3、Atp6这五个蛋白的稳态水平强烈降低,几乎检测不到,Cox4蛋白稳态水平也显著性的降低。综上所述,ppr10的缺失影响了线粒体呼吸链复合体亚基的合成,使得线粒体功能受损。Ppr10蛋白是整个线粒体蛋白翻译机制的激活因子,ppr10基因的缺失影响线粒体蛋白的翻译因此不能正常编码线粒体mRNAs剪接所需要的成熟酶。也进一步验证了Ppr10在线粒体翻译中的功能。
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摘要Abstract第一章 绪论 1.1 线粒体的简介 1.1.1 线粒体结构与功能 1.1.2 线粒体基因组 1.1.3 线粒体基因组编码的内含子剪接 1.1.4 线粒体基因组编码的mRNAs的翻译 1.2 PPR蛋白的介绍 1.2.1 PPR蛋白的定义及其分布 1.2.2 PPR蛋白的功能 1.3 模式生物—粟酒裂殖酵母 1.4 本课题的研究内容和方法 1.4.1 本课题的研究内容 1.4.2 本课题的研究方法第二章 在P3 菌株中Ppr10 蛋白缺失后表型的研究 2.1 实验材料 2.1.1 所用菌株 2.1.2 实验试剂与材料 2.1.3 培养基及试剂配制 2.1.4 所用引物 2.2 实验方法 2.2.1 构建Δppr10/P3 菌株 2.2.2 P3 菌株和Δppr10/P3 菌株的点圈实验 2.3 实验结果 2.3.1 Δppr10/P3 菌株的构建 2.3.2 ppr10 缺失菌的表现研究 2.4 讨论第三章 粟酒裂殖酵母中ppr10 基因的缺失对线粒体基因组编码的cox1和cob1 的内含子剪接的影响 3.1 实验材料 3.1.1 所用菌株 3.1.2 实验试剂与材料 3.1.3 培养基及试剂配制 3.1.4 所用引物 3.2 实验方法 3.2.1 试剂盒提取总RNA 3.2.2 RNA的完整性检测 3.2.3 cDNA模板的获得 3.2.4 PCR扩增及检测 3.3 实验结果 3.3.1 RNA的完整性检测 3.3.2 Ppr10 蛋白影响cox1和cob1 的内含子剪接 3.4 讨论第四章 在P3 菌株中ppr10 基因的缺失不影响cox1和cob1的mRNAs水平 4.1 实验材料 4.1.1 所用菌株 4.1.2 实验试剂与材料 4.1.3 培养基及试剂配制 4.1.4 所用引物 4.2 实验方法 4.2.1 qRT-PCR检测线粒体基因组的转录水平 4.2.2 Northern blot检测线粒体基因组编码的cox1和cob1 mRNAs累积水平 4.3 实验结果 4.3.1 RNA的完整性检测 4.3.2 在不含线粒体内含子的遗传背景下,ppr10 的缺失不影响cox1和cob1的mRNAs的水平 4.4 讨论第五章 在P3 菌株中ppr10 基因的缺失对线粒体蛋白翻译的影响 5.1 实验材料 5.1.1 所用菌株 5.1.2 实验试剂与材料 5.1.3 培养基及试剂配制 5.2 实验方法35S]-Protein Labeling检测线粒体蛋白合成水平'> 5.2.1 体内[35S]-Protein Labeling检测线粒体蛋白合成水平 5.3 实验结果 5.3.1 Ppr10 蛋白影响了线粒体蛋白合成水平 5.4 讨论第六章 在P3 菌株中ppr10 基因的缺失对线粒体蛋白稳态水平的影响 6.1 实验材料 6.1.1 所用菌株 6.1.2 实验试剂与材料 6.1.3 培养基及试剂配制 6.2 实验方法 6.2.1 粟酒裂殖酵母线粒体粗提取 6.2.2 BCA法测定线粒体蛋白浓度 6.2.3 线粒体样品处理方法 6.2.4 免疫印迹分析实验 6.3 实验结果 6.3.1 粟酒裂殖酵母细胞壁酶解图 6.3.2 粟酒裂殖酵母线粒体蛋白浓度测定 6.3.3 ppr10 的缺失导致线粒体蛋白的表达量下降 6.4 讨论全文讨论与总结参考文献附录一 菌种与质粒附录二 实验仪器在读期间发表的论文致谢
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 谢婉秋
导师: 黄鹰
关键词: 粟酒裂殖酵母,线粒体,内含子剪接
来源: 南京师范大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 南京师范大学
分类号: Q78
DOI: 10.27245/d.cnki.gnjsu.2019.001042
总页数: 68
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标签：粟酒裂殖酵母论文; 线粒体论文; 内含子剪接论文;
粟酒裂殖酵母Ppr10蛋白对mtDNA编码的蛋白翻译影响的研究
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