论文摘要
米曲霉因其在发酵过程中可分泌大量水解酶类,被作为传统酿造食品的常用菌株。其分泌的水解酶主要包括蛋白水解酶和糖类水解酶。这两类酶分解底物产生的氨基酸、多肽、寡糖、单糖等小分子物质,是传统发酵食品风味的主要来源。具有优良产酶性能的米曲霉菌株对发酵工业有重大意义。近年来,米曲霉由于其强大的表达外源蛋白的能力越来越被重视。与毕赤酵母和大肠杆菌相比,米曲霉具备更强大的翻译后修饰的功能;与植物及昆虫相比,米曲霉对生长环境的要求更低,生长周期更短,是表达外源蛋白的理想宿主。本文对本实验室现有的米曲霉菌株进行了对比研究,主要研究内容如下:1.不同米曲霉菌株培养特性对比分析通过平板培养对八株米曲霉菌株进行了产孢量的比较,接种量为105个孢子时,每株菌每个平板都能收集到107数量级的孢子。其中,H4的产孢量最高,平均可达7.9×107个孢每平板,是产孢量最少的B菌株均值的4.72倍。在液态发酵条件下（接种量105个/mL,28℃180 rpm摇床培养）,几株米曲霉的发酵液pH值都呈现先下降后上升的趋势;发酵初期菌丝体湿重呈上升趋势,在第三d后基本保持稳定,部分菌株在第五d以后又呈现上升趋势,最终重量集中分布在3.5 g左右。通过对液态发酵产酶情况的简单分析发现,AS11有最高的糖化酶活力（13.04 U/mL）。米曲霉H4和H5的α-淀粉酶活力最高,分别为19.02 U/mL和15.70 U/mL,最大糖化酶活力仅次于AS11,为8.5 U/mL左右。米曲霉B有最低的蛋白酶活力,整个发酵过程中基本稳定在0.1 U/mL,但其糖化酶（7.0 U/mL）及α-淀粉酶（8.5 U/mL）活力在八株菌中均处于中等水平。2.pUC18-hygB-LIP重组表达载体的构建为了比较几株米曲霉表达异源蛋白的能力,以pUC18-LIP为出发载体,构建重组表达载体。在选择抗性标记时,探究菌株对多种抗生素的敏感度。结果表明0.1μg/mL吡啶硫胺素、2μg/mL苯菌灵和0.1 mM氯丙嗪+150μg/mL潮霉素B在平板培养时都可分别完全抑制米曲霉菌株的生长,即ptrA、benA、hygB基因都可用作构建表达载体的筛选标记。综合各种因素,最终选择hygB基因为抗性标记并成功构建载体pUC18-hygB-LIP,用于下一步异源蛋白的表达。3.不同米曲霉菌株表达外源蛋白能力的比较分析对原生质体制备条件进行探究,发现接种新鲜孢子时,培养时间控制在14h左右即可;当接种的孢子为甘油冻存的状态时,培养时间可适当延长至16 h左右;米曲霉AS11、A、H4的最佳酶解时间均为3.5 h,再生率分别为34%、28%、33%;菌株B、C、H1最佳酶解时间为3 h,再生率分别为30%、27%、26%;菌株H5、H6的最佳酶解时间为2.5 h,再生率分别为28%和26%。通过PEG-CaCl2介导的原生质体转化将华根霉的脂肪酶基因转入至米曲霉中进行表达,以脂肪酶的表达量为指标比较几株米曲霉做宿主在液态发酵条件下表达外源的能力。通过结果发现,在几株米曲霉中,H4具有最佳表达能力,脂肪酶活力与宿主菌相比高出10.16 U/mL;其余菌株转化前后酶活力的最大差异由大到小分别为:A（8.21 U/mL）,H6（8.17 U/mL）,B（7.88 U/mL）,H1（6.27 U/mL）,H5（5.75 U/mL）,C（4.44 U/mL）。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 李童
导师: 李燕萍
关键词: 米曲霉,液态发酵,异源表达,脂肪酶
来源: 南昌大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,轻工业手工业
单位: 南昌大学
分类号: TS201.3
DOI: 10.27232/d.cnki.gnchu.2019.000841
总页数: 67
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