李志勤[1]2004年在《重症乙型肝炎HBV DNA CP 区及前S区基因变异与河南地区HBV DNA 基因型的研究》文中提出乙型肝炎病毒(HBV)是一种DNA病毒，人类感染HBV后可以表现为不同的临床类型：无症状感染者、急性、慢性、重症乙型肝炎等。其中重症乙型肝炎患者病情凶险，是HBV感染后的重要转归之一，其病死率高，发病机制尚未清楚。现代研究认为重症乙型肝炎的发生，除了和宿主因素有关外，病原学因素是重要影响因素之一。HBV在感染过程中常发生基因变异，由此可导致感染的慢性化和重症化。此外，研究表明：病毒基因型反映了HBV自然感染史发生的变异特点，HBV的基因型可能与感染途径、疾病的进展等有一定的相关性。 目的 本文分两部分①以HBV DNA C基因启动子(CP)区及前S区为研究对象，研究重症乙型肝炎患者HBV DNA发生基因变异时有无位点特异性，探索HBV基因变异在重症乙型肝炎发病中所起的作用 ②应用巢式PCR技术，研究河南地区重症乙型肝炎和慢性乙型肝炎患者中HBV DNA基因型及各型比例，不同基因型与乙型肝炎重症化的相关性，进一步分析HBV DNA基因型、HBV基因变异与乙型肝炎重症化之间的相互关系。 方法 (1)自16例重症乙型肝炎患者的血清提取HBV DNA，聚合酶链反应(PCR)扩增，PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳。随机选取可能存在变异的3份PCR扩增产物，郑州大学医学花忆硕士毕业论文(2004)提纯后核昔酸序列测定，计算机软件分析基因序列的同源性、分析由基因序列推测的氨基酸序列的同源性。 (2)自同一批16例重症乙型肝炎患者及50例慢性乙型肝炎患者血清提取HBVDNA，应用特异性引物，巢式PCR扩增目的片段，琼脂糖电泳，分析不同组乙型肝炎患者的HBV DNA基因型。 结果 (1)16份重症乙型肝炎患者的血清标本的HBV DNA CP区，各条带大小一致，未发现基因缺失变异;前S区PCR扩增产物聚丙烯酞胺凝胶电泳，存在多个水平大小不一的片段，选取3份标本进行同源性分析，其同源性>80%。由基因序列推测的氨基酸序列的同源性为75.4%，未发现特殊突变位点和聚集性突变。 (2)重症乙型肝炎患者的血清标本中HBV均为B基因型，占100%，50例慢性乙型肝炎患者有7例为B型，占14%(7/50)，其余为B、C混合型占86%(4 3/50) 结论 (l)基因变异在重症乙型肝炎患者的HBV DNA的前S区随机出现，主要集中在前S;区下半段、前52区，但不具位点特异性和聚集性突变，而1侣V DNA CP区未发现明显缺失突变，但在HBV DNA其他区域是否存在特征性变异不详。 (2)河南地区重症乙型肝炎患者HBV DNA以B基因型为主，而慢性乙型肝炎患者以B、C混合型为主，HBV DNAB基因型和重症乙型肝炎关系密切。 (3)重症乙型肝炎患者所感染B基因型的HBV基因中，CP区和前S区基因变异无位点特异性和聚集性突变。重症乙型肝炎患者感染的其他基因型别的HBv基因变异是否具有相似突变特征和相关性，有待于进一步探索。
陈宗艳[2]2008年在《DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用》文中进行了进一步梳理鸭乙型肝炎病毒(Duck Hepatitis B Virus,DHBV)与乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus,HBV)同属嗜肝DNA病毒科,这类病毒的特征是有强的嗜肝细胞特性,在病毒形态、基因组结构、复制过程等生物学特性相似。DHBV感染鸭模型是研究HBV的生物学特性、致病机制和抗HBV药物的实验动物模型。本文通过调查四川地区麻鸭自然携带DHBV的情况,分离DHBV毒株,以此毒株为模板,扩增主要抗原基因preS。通过构建DHBV-preS原核表达质粒并诱导表达,从而对表达蛋白免疫原性、表达蛋白抗体介导的免疫组化检测人工感染DHBV后在体内的蛋白定位分析与侵染规律,以期系统地了解的入侵方式和复制机理,为阐明DHBV的发病机制提供关键的实验数据。同时建立基于定量检测DHBV的FQ-PCR方法,用于DHBV疾病模型研究,并结合体外模型HepG2.2.15细胞研究抗乙型肝炎新药,结果如下:DHBV毒株的分离及分子特征解析结果表明:四川麻鸭自然携带DHBV 4%,证实四川麻鸭是研究实验性DHBV感染动物模型的良好鸭种;对分离到的其中3株DHBV阳性血清全基因克隆、测序并进行生物信息学分析,发现全基因组均含3006个核苷酸(GenBank登录号EU429324,EU429325,EU429326),具有X-like开放阅读框特征;进一步研究ORF-S还表明该基因编码33个氨基酸,有四个疏水区,无N-糖基化位点,也无豆蔻酰化位点,在1～30aa内有一个明显的信号肽,在19～20aa处有断点,跨膜螺旋预测为外膜蛋白,抗原位点主要分布于preS区氨基酸序列中。根据DHBV-preS序列,设计一对特异性引物,以分离的DHBV毒株为模板扩增目标基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将DHBV-preS基因正向插入原核表达载体pET-32a(+)的ApaI和NcoI位点间,成功构建了重组表达质粒pET32a(+)/DHBV-preS。重组表达质粒pET32a(+)/DHBV-preS转化表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导,能表达出了大小约为37kD的preS重组蛋白,与预期表达蛋白分子量大小相符;经对不同诱导时间及诱导剂IPTG浓度等条件进行优化,确定重组质粒pET32a(+)/DHBV-preS的最佳诱导条件为0.8mmol/LIPTG、37℃条件下诱导4h。表达产物用镍柱亲和层析纯化后,将得到的preS重组蛋白做梯度稀释,初步建立ELISA检测DHBsAb的方法(间接法);同时将纯化的重组蛋白与等量弗氏佐剂混合制备preS重组蛋白免疫原,四次免疫家兔,获得的兔抗DHBV-preS高免血清经辛酸-硫酸铵粗提后,阴离子交换柱层析纯化抗体IgG。建立DHBV-preS基因表达蛋白抗体介导的免疫组化方法;针对DHBV的保守序列设计并合成引物及荧光标记探针,建立实时荧光定量聚合酶链反应(fluorsescencequantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)检测方法。建立的标准曲线循环阈值(cycle threshold,Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.993,将其检测极限的Ct值通过标准曲线换算成拷贝数约为5copies/L,未检测到鸭病毒性肝炎、鸭瘟病毒、鸭源致病性大肠埃希氏菌、鸭源致病性沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌,表明FQ-PCR检测DHBV方法灵敏、特异性强。采用鸭乙型肝炎病毒人工方法感染1日龄四川麻鸭,攻毒后于不同时间采血分离血清,采集肝脏、胰腺、肾脏、脾脏等组织或器官,经建立的DHBV-preS基因表达蛋白抗体免疫组化方法和FQ-PCR方法检测DHBV在感染鸭体内侵染过程与定位分布,并结合组织学和血液生化指标对DHBV在感染鸭体模型侵染规律进行系统观察。结果显示:感染后2d可在血清和肝组织中检测出DHBV DNA,血清中DHBV DNA从感染后第10d～30d DHBV DNA的拷贝数保持在1.00E+09以上,肝组织中DHBVDNA的含量从感染后第5d～52d保持在5.00E+09以上;肝脏DHBV DNA第14d达到最高水平,而血清中DHBV DNA第22d达到最高水平。肝脏、胰腺、肾脏、脾脏的损伤程度与DHBV DNA水平成正相关;在感染后3～52d内的不同时间点从肝脏、胰腺、肾脏、脾脏及大脑六种组织器官中检测出DHBsAg,DHBsAg主要分布在细胞浆,少部分分布于细胞核,未能从食道、腺胃、肺、心脏、生殖器和肌肉中检测到DHBsAg,表明DHBV嗜肝的同时具有泛嗜性,且在靶器官的侵染与分布具有一定选择性;在感染后1～3d、52d以后各组织相继不能检出DHBsAg,感染后12～31d病毒在机体内各组织的分布最为广泛,感染后4d肝脏开始出现DHBsAg阳性细胞,感染后6d肾脏、胰腺、脾脏相继开始出现DHBsAg阳性细胞,而脑组织在感染后10d出现阳性细胞;肝脏的检出率最高,持续至52d,大脑的检出率最低,分析表明该蛋白可能是膜蛋白,具有运输核浆与引导病毒组分进入核内参与病毒复制的功能。DHBV感染后第4d,总蛋白和白蛋白含量开始降低,谷丙、谷草转氨酶活性升高(P＜0.01),乳酸脱氢酶活性升高(P＜0.01),肌酐和尿素有变化但无规律,表现为升高趋势,感染后44d开始,各项血液生化指标逐渐趋于正常值,表明DHBV引起肝脏损伤的同时累及肾脏。在建立的抗人类乙型肝炎新药体内药效评价的技术平台和体外模型HepG2.2.15上评价抗乙型肝炎新研制药物-核苷类似物(代号PNA)的作用。在HepG2.2.15细胞系中,PNA有明确的抑制HBV DNA复制作用,抑制HBsAg和HBeAg,在7.8～62.5μg/mL剂量范围内有剂量—时间依赖关系,未见到明显细胞学毒性;在鸭乙肝动物模型中,PNA对DHBV DNA抑制率达50%的最低用药剂量为口服20mg/kg,口服40mg/kg、80mg/kg PNA对DHBV的抑制率与拉米夫定口服组(50mg/kg)基本一致,可以减轻鸭脏炎症,抑制DHBsAg在肝脏中的表达。
曹峻[3]2010年在《真菌松茸提取物在HBV转基因小鼠癌变中化学预防作用的初步评价》文中研究表明目的：在建立稳定的HBV转基因小鼠模型的基础上,应用真菌植物松茸提取物、α-干扰素化学性预防治疗HBV转基因小鼠,初步评价真菌植物松茸提取物与α-干扰素预防HBV转基因小鼠肝脏癌变作用的效果,研究真菌植物松茸提取物等药物可能的对HBV转基因小鼠组织、生化、免疫等方面的影响,进一步说明上述药物抑制HBV转基因小鼠肝脏癌变的作用机制。方法：按照标准随机选择56只HBV转基因小鼠C57BL/6J-TgN,随机分为真菌松茸提取物(AMH)组、α-干扰素(INF-α)组、α-干扰素联合AMH组、阴性对照组。每组14只,根据不同的给药方式预防性治疗12个月,其中,第11月经眼球内眦静脉取血1次,测血清AST。第12月末,每只小鼠称取体重,经摘眼球取血处死动物,待测血清标本。采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA法)测定血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-10(IL-10)；切除小鼠肝脏,称取肝脏的重量,观察肝脏的形态及有无异常结节性改变,并观察肺、脾、肾和淋巴结有无肿瘤及转移灶,一部分肝脏组织保存于10%福尔马林溶液中,另一部分肝脏组织立即放入冻存管中保存于液态氮中存储。制作标本蜡块和病理切片,光镜下观察不同组肝组织结构变化,包括非癌变组织和癌变组织的变化。确定每组小鼠中发生肝组织癌变的具体数量,计算不同组中转基因小鼠肝组织癌变的百分数。肝组织做成切片进行免疫组化检查,显微镜下观察乙肝表面抗原(HBsAg)、转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β1受体Ⅱ(TβRⅡ)、磷酸化Smad2/3 (P-Smad2/3)、Smad4、Smad7在肝脏组织中的表达。以出现棕黄色为阳性,进行结果分析。选取液态氮中存储的肝脏组织,行实时荧光定量PCR检测(Real-time fluorescent quantitative PCR, RT-PCR)结果：1)肝脏组织形态改变：大体形态肝脏增大、肿胀,肝脏肿瘤结节为灰白色的单个或多个结节。光镜下可见：肝细胞弥漫性肿胀,细胞胞质伊红均染(毛玻璃样变),核内可见嗜酸性小体,肝细胞坏死,伴淋巴细胞浸润,散在单个肝细胞质固缩深染伴核固缩深染。肿瘤内可见明显异常核分裂像,癌细胞向肝组织周围浸润。AMH组预防性用药后,上述表现程度上稍轻,癌变发生的百分数稍低,但不能完全防止全部转基因小鼠肝脏炎性改变及癌变的发生；2)血清学指标：经治疗干预后,AMH组(294±51)、α-干扰素组(231±59)和α-干扰素联合AMH组(215±64)的AST值均低于阴性对照组(322±45)(P<0.05)。α-干扰素组、α-干扰素联合AMH组AST值分别低于AMH组(P<0.05)。而α-干扰素组和α-干扰素联合AMH组比较,AST值差别无统计学意义(P>0.05)；α-干扰素加AMH组(58.43±14.42)、AMH组(25.37±8.36)、α-干扰素组(35.84±12.36)与阴性对照组(15.75±8.45)相比,血清IL-2有增高(P<0.05)；α-干扰素加AMH组与AMH组和α-干扰素组相比IL-2升高(P<0.05)；a-干扰素加AMH组(12.03±6.54)与阴性对照组(45.97±14.03)、AMH组(21.58±11.20)、α-干扰素组(18.74±9.36)相比,血清TNF-α有明显降低(P<0.01)；α-干扰素加AMH组(160.25±70.03)、AMH组(289.58±110.20)、α-干扰素组(240.69±95.36)与阴性对照组相比(375.03±120.48),血清IL-10值降低(P<0.05)；α-干扰素加AMH组与AMH组、α-干扰素组相比,血清IL-10值也有降低(P<0.05)；α-干扰素加AMH组中血清AST的水平与血清TNF-α水平呈负相关(F值6.529,P<0.05)；3)免疫组化与RT-PCR指标：经治疗干预后,AMH组(4.92±1.20)、α-干扰素组(4.57±1.09)和α-干扰素联合AMH组(2.86±0.94)肝组织中的TGF-β1的表达均低于阴性对照组(6.53±1.78)(P<0.05)。联合AMH组分别与AMH组、α-干扰素组比较,肝组织中TGF-β表达的变化均有统计学意义(P<0.05)；经治疗后,AMH组(3.51±1.78)、α-干扰素组(4.63±1.44)和α-干扰素联合AMH组(5.72±1.55)肝组织中Smad4的表达均高于阴性对照组(3.06±0.87)(P<0.05)。α-干扰素联合AMH组肝组织中Smad4的表达高于AMH组有统计学意义(P<0.05)；经治疗干预后,AMH组、α-干扰素组和α-干扰素联合AMH组肝组织中P-Smad2/3的表达均高于阴性对照组(P<0.05)。α-干扰素联合AMH组肝组织中Smad4的表达分别高于AMH组、α-干扰素组有统计学意义(P<0.05);经治疗干预后,AMH组(4.10±0.75)、α-干扰素组(4.57±0.93)和α-干扰素联合AMH组(5.38±1.25)肝组织中TβRⅡ的表达均明显高于阴性对照组(3.36±0.62)(P<0.01)；经治疗后,AMH组、α-干扰素组和α-干扰素联合AMH组肝组织中P-Smad2/3的表达均低于阴性对照组(P<0.05)。阴性对照组(5.38±2.21)、AMH组(5.19±1.91)、α-干扰素组(4.86±1.82)肝组织中Smad7的表达均高于α-干扰素联合AMH组(2.17±1.64)(P<0.05)。α-干扰素联合AMH组肝组织中TGF-β1mRNA的表达低于阴性对照组(P<0.05)。α-干扰素联合AMH组肝组织中TβRⅡmRNA的表达高于阴性对照组(P<0.05)。AMH组、α-干扰素组和α-干扰素联合AMH组肝组织中Smad2mRNA的表达均高于阴性对照组(P<0.05)。结论：1)HBV转基因C57BL/6J-TgN小鼠可以从HBV慢性感染状态发展到肝癌形成的过程,可以部分模拟人类的该病转归；2)应用HBV转基因C57BL/6J-TgN小鼠观察不同药物化学预防性治疗后,AMH可以明显改善肝脏功能,降低血清转氨酶水平,减缓癌变的发生；3)AMH可以诱导HBV转基因小鼠Thl类细胞因子作用增强,Th2类细胞因子作用降低,抑制恶性肿瘤的生成；4)AMH可能通过影响TGF-β/Smad信号通路的传导,降低肝癌的发生；5)AMH和α-干扰素的联用在预防肝癌发生中效果可能更强。
徐宝艳[4]2003年在《乙型肝炎孪生子和非孪生子HBV preS1/S2区准种特性及其与临床表型关系的初步研究》文中研究表明乙型肝炎严重威胁人类健康，临床表型千差万别，从无症状感染以致清除病毒到持续性感染最终发展为肝硬化、肝功能衰竭或肝细胞癌，形成了复杂的疾病谱。而对于其致病机制目前尚无定论，普遍认为主要有宿主、病毒、环境叁方面因素参与。广义上的病毒变异包括在不同宿主体内病毒株的差异即基因型的不同以及机体内病毒的变异。当机体内变异株逐渐累积，就形成感染者体内病毒遗传异质性(genetic heterogeneity)，称为准种(quasispecies)。近来已有一些研究支持准种假说，最近的研究表明，HBV具有的准种特性可能是引起乙型肝炎慢性化和抗病毒治疗失败的一个非常重要的病毒学因素。宿主遗传因素在决定HBV易感性和感染后疾病的表型中起着重要作用。人类基因组研究为鉴定疾病易感和抗性基因提供了可喜的前景。主要研究方法是：① 根据基因编码产物的作用定向克隆。② 利用动物模型或已发现的疾病相关基因确定所要研究疾病的同源基因。③ 全基因组扫描，即微卫星和单核苷酸多态性分析。目前主要采用的研究对象包括孪生子、无亲缘关系的养子间、家系、种族和大量人群调查。孪生子作为很好的研究模型，已被广泛用于研究疾病复杂性状的影响因素中遗传和环境因素的相对作用。临床资料表明，HBV的母婴传播中孪生子HBV感染率明显高于非孪生子女，这就形成了具有相似遗传背景的两人同时感染相同病毒的绝妙现象，且HBV感染孪生子的表型往往都是相同的，符合反应时间遗传学(reaction-time genetics)的规律。对MZ孪生子之间或DZ孪生子之间配对研究，在感染相同或不同HBV毒株的情况下，可进行宿主遗传因素、宿主免疫应答、病毒基因变异、环境因素及临床表型等多变量分析，从而揭示遗传因素及其决定的免疫反应以及在免疫压力下的病毒变异对疾病易感及转归的影响。研究表明宿主遗传因素和病毒因素在决定疾病表型中可能起作用。而关于乙型肝炎孪生子和非孪生子准种特性的研究近年来未见报道，所以本研究以此为出发点，进行研究设计，以HBV感染孪生子及非孪生子为研究对象，初步探讨相同或不同遗传背景下宿主体内HBV preS1/S2区准种特性及其与临床表型之间的关系。人类基因组STR多态性扫描(Genescan)技术鉴定孪生子卵型，为孪生子研究奠定了遗传基础。对所收集的20
饶紫兰[5]2012年在《乙型肝炎表面抗原主蛋白改变HepG2细胞脂代谢基因表达》文中研究指明目的：通过SHBs稳定转染HepG2细胞，观察SHBs蛋白对肝细胞及细胞中ECHS1、PPARɑ及其调控下游基因表达的影响，为研究SHBs的生物学功能提供新线索，探讨HBV感染者脂肪肝的形成机理。方法：以C型HBV全S基因为模板，PCR扩增主S基因（SHBs基因），定向克隆至pcDNA3.1（+）载体中，构建真核表达质粒pcDNA3.1-SHBs；确定HepG2细胞G418的最佳筛选浓度，重组质粒pcDNA3.1-SHBs与空质粒pcDNA3.1分别转染HepG2细胞，G418筛选出稳定转染细胞株，通过RT-PCR和ELISA方法检测稳定转染细胞系中SHBsmRNA和蛋白以验证获得的表达细胞株，并用实时定量PCR和Western-Blot方法检测稳定转染细胞株中脂质代谢相关基因mRNA及蛋白水平表达差异。结果：成功构建出SHBs真核表达质粒pcDNA3.1-SHBs。确定HepG2细胞G418的最佳筛选浓度为1000ug/ml。以G418筛选出稳定转染肝癌HepG2细胞，并成功建立稳定表达目的蛋白的HepG2-pn3.1-SHBs细胞及空质粒对照的HepG2-pn3.1-neo。RT-PCR和ELISA方法检测到HepG2-pn3.1-SHBs细胞株中目的蛋白SHBs的表达，稳定转染后的HepG2-pn3.1-SHBs细胞株持续表达SHBs。与HepG2-pn3.1-neo细胞相比，HepG2-pn3.1-SHBs细胞中细胞培养上清中转氨酶ALT、AST的含量较高[（46.80±4.78）vs（39.21±2.81）；（64.72±5.45）vs（54.58±1.20）,（p<0.01）]，细胞裂解液中CHO含量较高[（0.87±0.04）vs（0.87±0.04）,（p<0.01）]，而TG含量较低[（1.39±0.65）vs（0.58±0.05）,（p<0.01）]。实时定量PCR结果显示：与HepG2-pn3.1-neo细胞相比，HepG2-pn3.1-SHBs细胞中基因ECHS1、APOA1、LPLmRNA表达水平较低[（0.161±0.043）vs（0.210±0.022）,（p<0.05）；（0.031±0.007）vs（0.094±0.055）,（p<0.05）；（0.770±0.036）vs（0.982±0.031）]，基因ACC、SREBP-1cmRNA水平较高[（0.113±0.027）vs（0.059±0.022）,（p<0.01）；（0.019±0.002）vs（0.015±0.001）,（p<0.05）],差异有统计学意义，基因CPT1a、PPARα的转录水平差异虽无统计学意义，但呈减弱趋势[（0.028±0.005）vs（0.030±0.004）；（0.014±0.004）vs（0.015±0.002）]。Western-Blot结果显示上述基因蛋白水平的变化趋势与mRNA一致。Western-Blot结果显示上述基因蛋白水平的变化趋势与mRNA一致。结论：结果表明SHBs对肝细胞可以造成一定的损害作用，并干扰脂肪酸代谢，在转录和蛋白水平明显改变脂肪酸合成、分解相关基因的表达，但HBsAg是否直接导致肝细胞脂肪变性尚不明确，值得进一步研究。
李晓光[6]2008年在《B和C基因型重组乙型肝炎病毒的构建及其相关研究》文中研究说明研究目的:1.构建B和C基因型重组乙型肝炎病毒及检测其在Huh7细胞内的复制和表达。2.探讨B和C基因型乙型肝炎病毒对Huh7细胞全基因组表达模式的影响是否相似。3.评价针对重组B和C基因型HBV S区目的小发夹RNAs(shRNAs)在存在错配的情况下对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用,对HBsAg mRNA水平的抑制作用,及对HBV DNA复制的抑制程度。研究方法:1.根据相关文献设计扩增HBV全基因组的引物,分别从感染B和C基因型的患者血清中提取HBV DNA作为模板,应用高保真热启动Taq DNA聚合酶扩增HBV全基因组;2.SacⅠ酶切扩增的全长HBV和pUC19,应用T4 DNA连接酶使HBV插入pUC19上的SacⅠ酶切位点,命名为pUC19-BHBV和pUC19-CHBV;3.应用SapⅠ酶切pUC19-HBV和pHY106真核表达载体,将获得的全长HBV在与线性的pHY106连接,使全长HBV插入pHY106的SapⅠ酶切位点,命名为pHY106-BHBV和pHY106-CHBV;4.将pHY106-BHBV和pHY106-CHBV分别转染Huh7细胞,以pHY106空载体转染作对照;①分别于转染后24h、48h和72h取细胞培养上清,-20℃冻存,用于ELISA检测HBsAg和HBeAg表达;②转染后72h,裂解细胞,提取细胞内HBV核心颗粒内HBV复制中间体,用于Southern blot检测;③转染后72h,用PBS洗细胞5次,裂解细胞,应用Real-time PCR定量检测Huh7细胞内HBV DNA水平。5.基因芯片技术:B或C基因型重组乙型肝炎病毒(即pHY106-BHBV,pHY106-CHBV)转染Huh7细胞,以pHY106空载体为对照,48h后提取细胞mRNA,逆转录为cDNA,与芯片杂交,用GenePix Pro3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度,计算每个基因点在本次实验中的表达差异值Ratio,Ratio=Cy5/Cy3;筛选出Ratio大于2或小于0.5的基因点,这些数据所代表的基因在与两种探针杂交时表现出较大的差异;6.实时定量PCR:pHY106-BHBV,pHY106-CHBV转染Huh7细胞48h,以pHY106空载体为对照,提取细胞总RNA,逆转录为cDNA,应用实时定量PCR对基因芯片差异表达的部分基因进行验证。7.将shRNAs分别和B或C基因型重组HBV,即pHY106-BHBV和pHY106-CHBV共转染HepG2细胞;于转染后24h、48h、72h、96h和120h分别取细胞培养上清,-20℃冻存,留作ELISA检测HBsAg和HBeAg表达水平;8.shRNAs分别和B或C基因型重组HBV转染HepG2细胞72h后,应用Trizol法提总RNA,逆转录为cDNA,进行RT-PCR,对HBsAg mRNA水平进行半定量检测;于转染后72h,裂解细胞,提取HBV核心颗粒内的HBV复制中间体进行Southernblot实验。结果:1.成功构建了pHY106-BHBV和pHY106-CHBV两个表达载体;2.pHY106-BHBV和pHY106-CHBV转到Huh7细胞后,检测到了HBsAg和HBeAg的表达,HBsAg表达于48h达高峰,HBeAg的表达高峰晚于HBsAg约24h;3.应用Southem blot检测到了细胞内HBV核心颗粒内的HBV复制中间体,包括rcDNA,dsDNA和ssDNA;4.应用Real-time PCR定量检测发现转染到Huh7细胞内的pHY106-BHBV和pHY106-CHBV HBV DNA拷贝数高,于72h达高峰,可达8log_(10);5.pHY106-BHBV转染Huh7细胞48h后,从4097个基因中筛选出差异表达基因共60条,其中1条基因表达明显增强,59条基因表达降低明显;6.pHY106-CHBV转染Huh7细胞48h后,筛选出差异表达基因共122条,其中34条基因表达明显增强,88条基因表达降低明显;7.实时定量PCR验证上述芯片结果,证实pHY106-BHBV转染Huh7细胞48h后,IFNGR2、GPR125、DDEF2和PI3K mRNA表达水平均不同程度下调,相对表达率分别为0.8、0.5、0.3和0.4,与基因芯片结果基本一致;pHY106-CHBV转染Huh7细胞48h后,EEF2、INF592表达下调,相对表达率分别为0.8和0.6,与基因芯片结果符合。8.shRNA·458和shRNA·635对B和C基因型HBV HBsAg和HBeAg表达具有很强抑制作用,转染后48h显现明显的抑制作用,于72h抑制作用达高峰,对HBsAg和HBeAg表达抑制水平分别可达到80%和50%左右;9.shRNA共转染72h,shRNA·458和shRNA·635对B和C基因型HBV HBsAgmRNA具有明显的抑制作用,抑制水平在60%～70%左右;10.Southern blot结果发现shRNA·458和shRNA·635对B和C基因型HBV的复制具有明显的抑制作用。结论:1.本研究构建成的HBV真核重组表达载体pHY106-BHBV和pHY106-CHBV能够在Huh7细胞内复制和表达HBsAg和HBeAg,适合用于B和C基因型HBV的致病机制、病毒与机体的相互作用、新药开发等方面的研究工作。2.B和C基因型乙型肝炎病毒均能对Huh7细胞表达谱产生明显的改变,B和C基因型乙型肝炎病毒对Huh7细胞表达谱的改变明显不同,仅发现DDEF2在两者均下调,这表明B和C基因型乙型肝炎病毒对机体的影响可能存在不同的方式。3.shRNA·458和shRNA·635是良好的抑制B和C基因型HBV的有效工具;一定范围的错配仍然能够发挥shRNA的抑制HBV的作用。
高学松, 成军, 甄真, 郭江, 张黎颖[7]2005年在《乙型肝炎核心启动子的研究进展》文中研究指明乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)与病毒复制、转录及疾病的关系密切,近年来国内外对核心启动子的结构、功能进行了广泛的研究,但目前研究的热点集中在核心启动子变异后的生物学活性改变以及与治疗的关系等方面,本文就其研究进展作一综述.
张晓姝[8]2005年在《CpG ODN对HBV感染者PBMC的刺激作用》文中认为人工合成的含有非甲基化CpG基序的单链脱氧核苷酸(CpG ODN)可分为A、B、C叁种类型,其中A型和C型CpG ODN具有强效诱生干扰素、激活天然杀伤细胞的活性,可望被用于病毒性疾病的治疗。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的感染性疾病,重组的α-干扰素(IFN-α)是治疗HBV感染的主要药物。但α-干扰素的有效率仅为20-40%,且长期使用会刺激IFN抗体的产生,并可引发贫血等不良反应。因此,研制可取代IFN-α的新型抗HBV的药物是重大的研究课题。为了筛选抗HBV的药物,我们设计并筛选了数百种CpG ODN,发现了一种新型的具有高效抗病毒活性的CpG ODN,它可有效的刺激HBV感染者末梢血单个核细胞(PBMC)产生抗病毒免疫反应,提示这种CpG ODN可能成为新型抗HBV的药物。
郭虹敏[9]2010年在《表达乙肝病毒受体人ASGPR转基因小鼠的建立》文中认为乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种传染病。小鼠是研究人类疾病最常用的模式生物,但由于HBV的感染具有严格的种属特异性,小鼠不能自然地感染乙肝病毒,只能感染人类和灵长目动物,使得乙肝疫苗和药物的研发、致病机制的研究缺乏合适的易感动物模型。人脱唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein Receptor ,ASGPR)是一个特异性地表达在肝脏窦状隙和基侧肝细胞膜上的跨膜分子,介导脱唾液酸化的糖蛋白的摄取和胞内降解。它是由2个同源亚基H1和H2组成二聚体,两个亚基的共同表达对于产生高亲和力的ASGPR结合位点是必须的。有研究认为ASGPR可以通过HBV包膜蛋白的pres1区域特异性地结合HBV,这种结合为HBV的肝细胞内吞提供了机制。本研究利用显微注射技术,制备表达HBV受体人ASGPR的转基因小鼠,为相关的HBV病毒研究提供易感动物模型。方法:克隆人的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)两个亚基的cDNA,连入PCAGGS构建转基因表达载体,将载体用SalI和DrdI线性化之后,以显微共注射的方法将两种各3.9kb的转基因片段引入小鼠的受精卵;采用PCR、Southern印迹的方法,检测ASGPR H1和ASGPR H2基因的整合情况;采用RT-PCR的方法,检测目的基因在F1代子鼠体内的转录情况;采用Western印迹的方法鉴定ASGPR H1和ASGPR H2蛋白在转基因小鼠体内的表达情况。结果:得到了5个同时整合了ASGPR H1和ASGPR H2基因的Founfer鼠系,显微共注射两种载体片段的阳性率为9.6%。在部分F1代ASGPR转基因小鼠体内检测到了两种基因的转录。得到了一个同时表达ASGPR H1和ASGPR H2两种蛋白的鼠系。结论:获得了在小鼠肝脏组织中共表达有乙肝病毒(HBV)受体ASGPR H1和ASGPR H2的转基因小鼠系,有可能为HBV的研究提供一种良好的感染动物模型。
成军, 李克, 刘妍, 王琳, 陆荫英[10]2004年在《HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响》文中指出目的:研究HCBP6蛋白在细胞内表达时,是否通过蛋白- 蛋白之间的相互作用,对HCV核心蛋白的反式激活作用产生影响. 方法:利用常规的分子生物学技术分别构建HCBP6蛋白和丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的真核表达载体.酶联免疫黏附法enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测CAT的表达水平,间接测定HCV核心蛋白对于SV40病毒即刻早期启动子的反式激活活性. 结果:重组表达载体pcDNA3.1(-)-HCBP6、pcDNA3.1(-)- core经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.转染HepG2细胞之后,HCV核心蛋白的表达,对于SV40病毒即刻早期启动子的转录表达活性具有显着的反式激活作用.但是,当与HCBP6蛋白的表达载体进行共转染时,SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性受到抑制.重复试验得到了相似的结果.HCBP6蛋白的表达对于HCV反式激活SV40病毒即刻早期启动转录活性的抑制率40.4-62.3%. 结论:HCBP6蛋白在细胞内的表达对HCV核心蛋白反式激活SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性具有显着的抑制作用.
参考文献：
[1]. 重症乙型肝炎HBV DNA CP 区及前S区基因变异与河南地区HBV DNA 基因型的研究[D]. 李志勤. 郑州大学. 2004
[2]. DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用[D]. 陈宗艳. 四川农业大学. 2008
[3]. 真菌松茸提取物在HBV转基因小鼠癌变中化学预防作用的初步评价[D]. 曹峻. 新疆医科大学. 2010
[4]. 乙型肝炎孪生子和非孪生子HBV preS1/S2区准种特性及其与临床表型关系的初步研究[D]. 徐宝艳. 第叁军医大学. 2003
[5]. 乙型肝炎表面抗原主蛋白改变HepG2细胞脂代谢基因表达[D]. 饶紫兰. 福建医科大学. 2012
[6]. B和C基因型重组乙型肝炎病毒的构建及其相关研究[D]. 李晓光. 中国人民解放军军医进修学院. 2008
[7]. 乙型肝炎核心启动子的研究进展[J]. 高学松, 成军, 甄真, 郭江, 张黎颖. 世界华人消化杂志. 2005
[8]. CpG ODN对HBV感染者PBMC的刺激作用[D]. 张晓姝. 吉林大学. 2005
[9]. 表达乙肝病毒受体人ASGPR转基因小鼠的建立[D]. 郭虹敏. 西北农林科技大学. 2010
[10]. HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响[J]. 成军, 李克, 刘妍, 王琳, 陆荫英. 世界华人消化杂志. 2004
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