屈长青[1]2006年在《猪脂肪间充质干细胞的分离培养及体外诱导分化研究》文中研究表明在动物体内,脂肪组织不仅是重要的能量贮存库和赋形组织,还是保持内环境稳定及具有分泌激素和细胞因子的重要部位。脂肪细胞增殖与分化失常是导致肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要因素。因此,脂肪细胞分化的研究一直是国内外医学及生物学领域的研究热点之一。2001年Zuk等发现脂肪中存在脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells, AMSCs)以来,在人、小鼠、大鼠和兔等多个物种上的研究证明其具有体外分化为多种细胞表型的能力。脂肪组织与骨髓相比,具有易分离,干细胞含量高等优点,在体外培养条件下,AMSCs要比骨髓MSCs具有更高的增殖速率,因此其有望成为未来细胞/基因治疗和组织工程的主要种子细胞之一。猪沉积脂肪能力强,是研究脂肪组织形成与发育较为理想的动物模型。近年来的研究也证明,猪在遗传上比通常使用的其他实验动物如小鼠和大鼠等更接近人类。但是,迄今为止,国内外尚未见关于猪AMSCs分离、培养和多向分化等方面的系统研究报道。本文以1-3日龄仔猪为实验动物,采集颈部及肩胛部皮下脂肪组织,胶原酶消化法获得AMSCs,传代培养,利用免疫组化、流式细胞仪和扫描电镜分析等实验技术研究了猪AMSCs的基本特性;运用免疫组化和RT-PCR法研究了AMSCs在不同因子诱导作用下向成骨细胞、成肌细胞及脂肪细胞分化能力。在此基础上,对比研究了AMSCs成脂诱导与原代培养的基质微管(sromal vascular fraction,SVF)细胞增殖与分化模式,为利用AMSCs研究脂肪细胞形成与分化早期事件奠定了基础。主要结果如下:1.应用胶原酶消化法分离获得猪脂肪基质微管成份(Stromal vascular fraction,SVF),进行原代培养,其中的AMSCs可形成集落。已传21代,并已扩增到1.0×108个细胞。2.本实验所分离的猪AMSCs呈叁角形或长梭形,易形成集落,类似于从人和其他物种所分离获得的AMSCs。3.扫描电镜下,猪AMSCs表面较为粗糙,有多个突起,并有较多微棘和丝突。4.免疫细胞化学与流式细胞仪检测分析表明,猪AMSCs能够表达间充质干细胞的表面标志CD44和CD105(阳性),而不表达造血干细胞的标志CD14、CD34和CD106 (阴性),也不表达成纤维细胞表面标记HLA-DR和前体脂肪细胞与脂肪细胞特异表面标记S-100。5.在体外可诱导猪AMSCs分化为成骨细胞。诱导后,碱性磷酸酶活性提高而呈现阳性反应,产生茜素红染色阳性的矿化结节。RT-PCR在诱导第7天检测到成骨特异基因骨钙素(OCN)和Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)的表达,随诱导时间的延长,两者mRNA水平均呈上升趋势。
林云锋[2]2003年在《脂肪基质细胞的分离及成骨诱导培养》文中研究说明脂肪基质中存在一些具有多向分化潜能的具有自我更新和一定分化潜能，处于全能干细胞和成熟脂肪细胞之间的成体干细胞，具有向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、肌细胞和神经细胞等多个方向分化的能力。 本实验由叁部分组成： (1)脂肪基质细胞的获取及培养 采用抽脂术获得的健康成体脂肪组织，经机械分割、胶原酶消化后，BGJ_b培养基培养、传代。 (2)脂肪基质细胞成骨诱导培养 以DMEM／F12培养基提供脂肪基质细胞向成骨方向分化所需要的生长因子；β—磷酸甘油钠提供形成矿化基质提供所需的磷酸根离子和钙离子；地塞米松抑制细胞的增殖而加速细胞的分化；左旋抗坏血酸及VitD_3可以诱导脂肪基质细胞向成骨方向分化。 (3)以光镜观察、常规HE染色、Von Kossa's矿化结节染色法、Gomori改良钙钴法ALP染色、Gomori萘酚磷酸酯法等方法对所获得之矿化诱导后的脂肪间质细胞进行鉴定。 研究结果表明：人体脂肪基质细胞在诱导条件下，可以分化成为成骨细胞样细胞，细胞周围可以形成类似于羟基磷灰石样的磷酸钙盐的沉积物，并可以形成矿化结节样的结构。而且可以表现出较高碱性磷酸酶(ALP)活性。 实验证明，在人类脂肪组织的基质细胞中，存在具有成骨方向分化潜能的成体干细胞；在矿化诱导条件下，人类成体脂肪组织的基质细胞可以向成骨方向转化，可以形成具有成骨表型的细胞。这些研究可以为下一步人成体脂肪基质细胞在骨组织工程的应用提供实验基础。
林云锋[3]2006年在《脂肪基质细胞多向分化能力及其在组织工程中应用的研究》文中研究表明在临床医学中，因创伤、感染、肿瘤术后及先天缺陷导致组织缺损的修复重建，一直是困扰各专业医生的棘手难题。当前临床上使用的各种组织修复与重建方法虽然各有优缺点，但总体来说不尽人意。组织工程是应用细胞生物学和工程学的原理，对病损组织结构、功能的修复与重建进行研究开发的一门新兴科学。种子细胞是组织工程的首要因素，脂肪基质细胞(Adipose tissue-derived stromal cells，ASCs)是近年来研究最热门的种子细胞，被认为是最有可能用于临床的种子细胞之一。ASCs具有向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等多向分化的能力，加之脂肪贮备量大、取材方便的优势，使其更具实际的应用价值。 本课题采用酶消化法获取绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)转基因小鼠脂肪基质细胞，通过体外多向诱导的培养方法，研究内源性GFP对ASCs分化能力的影响；然后以腺病毒(Adenoviral vectors，Ad)为载体，转染外源性GFP基因到Balb／c小鼠ASCs中，比较内、外源性GFP对小鼠ASCs分化能力的影响；进而研究外源性GFP对人脂肪基质细胞分化能力的影响。在此基础上，结合组织工程的方法，研究ASCs体外成软骨分化能力，并使用经过成软骨诱导的ASCs复合藻酸盐支架材料，种植于裸鼠皮下，研究ASCs形成异位软骨组织的能力；再使用经过成骨诱导的ASCs复合纳米双相磷酸钙陶
江毅, 刘智, 韩立强, 朱争艳, 田永刚[4]2010年在《体外培养人体脂肪基质细胞和骨髓基质细胞的成骨活性对比》文中研究说明背景:目前组织工程骨构建研究中的种子细胞主要来源于骨、骨膜、骨髓及骨外组织,近年来的研究多集中于骨髓基质细胞。而脂肪中基质细胞的发现,有望取代骨髓基质细胞。目的:观察体外培养脂肪基质细胞与骨髓基质细胞的生物学特性,并比较二者成骨诱导后的碱性磷酸酶活性,从成骨活性方面来评价脂肪基质细胞能否取代骨髓基质细胞。方法:手术中收集同一人体的脂肪组织与骨髓组织。脂肪组织经机械切割后以Ⅰ型胶原酶消化获得脂肪基质细胞,骨髓组织以淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离骨髓基质细胞;体外培养、传代后以诱导培养液行成骨诱导培养。诱导后第2,3周各检测1次细胞中的碱性磷酸酶活性,并行VonKossa钙结节染色鉴定成骨细胞。结果与结论:共获得15例患者的脂肪与骨髓组织,其中10例完成实验。与骨髓基质细胞相比,脂肪基质细胞更易培养成活,扩增速度快;二者细胞形态相似,诱导培养后细胞外基质中均有黑色的钙结节形成;碱性磷酸酶活性二者差异无显着性意义(P>0.05)。结果提示脂肪组织来源丰富,脂肪基质细胞成活容易,具有与骨髓基质细胞相似的生物学性能,且易培养、增殖快,二者的成骨活性相似,脂肪基质细胞比骨髓基质细胞更具有优势。
王婷[5]2006年在《淫羊藿黄酮的分离鉴定及其抗骨质疏松活性的机制探讨》文中提出传统中药淫羊藿由于其丰富的药用植物资源、多样的药理作用和确切的临床疗效而备受关注，一直是国内外研究的热点。为了更好地开发利用这一资源，我们设计并开展了以下实验：(1)以小鼠骨髓基质细胞为模型，采用四甲基偶氮唑蓝法、碱性磷酸酶比活性测定方法，在细胞水平筛查了淫羊藿抗骨质疏松的有效极性部位；(2)利用硅胶和凝胶柱层析分离淫羊藿有效部位中的单体成分，根据化合物光谱数据(ESI-MS，~1HNMR和~(13)CNMR)鉴定其结构；(3)以小鼠骨髓基质细胞为模型，采用四甲基偶氮唑蓝法、碱性磷酸酶比活性测定、茜素红染色及定量测定和油红O染色及定量测定等方法，在细胞水平研究了淫羊藿有效部位和其中分离出的主要单体淫羊藿苷，以及淫羊藿苷代谢产物宝藿苷Ⅰ对小鼠骨髓基质细胞增殖、成骨和成脂分化的影响；(4)以小鼠成骨细胞为模型，采用四甲基偶氮唑蓝法、油红O染色及定量测定等方法，在细胞水平研究了淫羊藿有效部位、淫羊藿苷及宝藿苷Ⅰ对小鼠成骨细胞增殖及横向分化的影响；(5)采用蛋白印迹和荧光定量PCR等方法，在分子水平对淫羊藿苷在骨髓基质细胞成骨和成脂分化途径中可能的作用靶点和作用途径进行了研究；(6)采用MTT法和DPPH法测定6个淫羊藿黄酮对前破骨细胞株RAW264.7增殖的影响以及它们的细胞毒性和抗氧化清除自由基的能力。研究结果表明：(1)淫羊藿促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化的有效部位是乙酸乙酯萃取部位和水提物；(2)从淫羊藿药材乙酸乙酯萃取部位中分离鉴定的6个黄酮类成分，分别为淫羊藿苷(Ⅰ)，宝藿苷Ⅱ(Ⅱ)，朝藿素B(Ⅲ)，宝藿苷Ⅰ(Ⅳ)，金丝桃苷(Ⅴ)和木犀草素(Ⅵ)；(3)细胞水平上淫羊藿乙酸乙酯萃取部位可以促进小鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化而不抑制其向脂肪细胞分化。乙酸乙酯萃取物中主要成分淫羊藿苷及其代谢产物宝藿苷Ⅰ，在一定浓度范围内，可以促进小鼠骨髓基质细胞成骨分化并抑制其成脂分化，此作用与化合物结构、浓度及作用时间均有关，尤以10~(-9)和10~(-8)8mol／L的淫羊藿苷在第14d的效果最好；(4)细胞水平上，在一定浓度范围内，乙酸乙酯萃取部位、淫羊藿苷及宝藿苷Ⅰ可以抑制小鼠成骨细胞向脂肪细胞的横向分化，以10~(-9)和10~(-8)mol／L的淫羊藿苷在第6d的效果最好：(5)淫羊藿苷可能通过对ERα蛋白表达的作用影响小鼠骨髓基质细胞成骨分化和成脂分化。以上结果说明淫羊藿苷作为淫羊藿抗骨质疏松的有效成分，在合适的浓度和作用时间下，可以双向调节骨髓基质细胞的成骨和成脂分化，同时抑制成骨细胞的成脂横向分化：一方面通过增加成骨细胞的数量而直接促进骨形成，另一方面通过减少脂肪细胞的数量而间接促进骨髓基质细胞成骨分化并降低脂肪细胞对破骨细胞的促进作用，从而在整体水平上使骨量增加，达到防治骨质疏松的作用，而ERα则是淫羊藿苷发挥作用的可能靶点之一。(6)另外，其他生物活性筛查实验表明：淫羊藿黄酮类化合物对前体破骨细胞株RAW264.7细胞的生长是促进还是抑制依赖于其自身的化学结构以及作用浓度。通过抑制前体破骨细胞的增殖，进而抑制前体破骨细胞分化形成破骨细胞，可能是淫羊藿发挥抗骨质疏松作用的机理之一；同时，淫羊藿抗肿瘤的作用可能部分通过黄酮抗氧化机理产生。这些为淫羊藿其他方面的开发利用提供了一些数据。
屈长青, 张国华, 杨公社[6]2007年在《猪脂肪间充质干细胞分离培养及成骨诱导》文中指出脂肪间充质干细胞(AMSCs)是一类存在于脂肪组织中具有多向分化潜能的干细胞．近年来的研究证明,脂肪组织具有取材方便和干细胞含量高的优势,在研究与应用领域较骨髓干细胞具有更广阔的应用前景．猪是一种比啮齿类等更接近人类的动物,具有较强的脂肪沉积能力．文中探讨了猪脂肪间充质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向成骨细胞诱导分化的条件．采用I型胶原酶消化分离脂肪基质微管成分(SVF),传代培养扩增,流式细胞仪检测细胞表面标记．取第5代AMSCs,以含地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油钠的培养基诱导培养,光学显微镜下观察,诱导后的细胞呈现典型的成骨细胞样改变．分化细胞碱性磷酸酶(AIP)染色呈阳性,RT-PCR检测到I型骨胶原(COL-I)和骨钙素(OCN)表达,结果表明可以从SVF中分离培养出AMSCs,经传代后可提高其纯度．经流式细胞仪检测,其CD105和CD44表达呈阳性,CD14,CD34,S-100,HLA-DR呈阴性,在合适的诱导条件下,可向成骨细胞分化．
李娜[7]2005年在《组织工程中应变对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响》文中认为骨髓间充质干细胞具有自我复制、未分化的特点,并可在不同条件下分化为中胚层起源的多种细胞,这些特点决定了其在组织工程中的重要地位。此外,机体内几乎所有的细胞都会受到力学因素的影响,所以有必要研究力学因素对骨髓间充质干细胞的作用,为其体外扩增、诱导分化提供一种新途径。 本实验首先探索了分离、培养骨髓间充质干细胞的方法,并了解其一般生物学特性。其次,选取传至第3代(P_3)的骨髓间充质干细胞进行实验。加载大小为1000微应变、频率为0.5Hz(1秒拉伸,1秒缓解)的单向循环拉伸应变,每12小时拉伸30分钟,连续72小时。测定了未加载及应变加载后不同时间点碱性磷酸酶的活性;应变和(或)成骨条件培养基对骨髓间充质干细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响;加载组与未加载组细胞基质钙盐沉积情况;骨钙素的基因表达情况。最后,筛选适宜骨组织工程的支架材料。 结果显示:应变加载组较非加载组碱性磷酸酶活性明显增强;应变加载后6h的碱性磷酸酶活性最强;应变能有效地促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,且诱导效能强于普遍采用的诱导条件培养基,但抑制了细胞的增殖速度。在几种材料中,生物陶瓷更适宜用作骨组织工程的支架。
陈希哲, 林云锋, 乔鞠, 田卫东, 闫征斌[8]2004年在《人体脂肪基质细胞分离培养及其成骨潜能》文中提出目的 :分离人体脂肪基质细胞并诱导培养其成骨表型。方法 :将脂肪抽吸术获取的人体脂肪进行机械分割 ,通过Ⅰ型胶原酶消化后得到脂肪基质细胞 ,在BGJb 培养基中原代培养 10d ,消化传代后用含体积分数 10 %FBS及 10 - 8mol/L地塞米松 ,50mg/L左旋抗坏血酸 ,10nmol/L维生素D3 ,10mmol/Lβ 磷酸甘油钠的DMEM /F12培养基中诱导培养 14d ,观察细胞形态 ,绘制细胞生长曲线并对其成骨表型进行鉴定。结果 :脂肪基质细胞呈成纤维细胞样贴壁生长 ,其中的成体干细胞经诱导培养后体积明显增大 ,胞核大面圆 ,胞浆丰富 ,群体倍增时间为 66h。Gomori萘酚磷酸酯法染色显示其胞浆内富含碱性磷酸酶颗粒 ,vonKossa染色表明聚集的细胞团能形成矿化结节。结论 :脂肪基质细胞中的成体干细胞经过矿化诱导培养后可向成骨细胞分化 ,并具有明显的成骨表型
江毅, 韩立强, 朱争艳, 肖连平, 刘智[9]2007年在《人体脂肪基质细胞的分离培养及其成骨活性的研究》文中研究说明目的:脂肪组织来源的脂肪基质细胞具备向其他多种组织成分,如神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、软骨细胞、骨细胞等分化的能力。探讨人体脂肪组织来源脂肪基质细胞的分离培养方法及其成骨活性。方法:于2005-10/2006-05选取临床手术中收集的废弃脂肪组织及行脂肪抽吸术所得的脂肪组织为实验材料,采用机械切割及Ⅰ型胶原酶消化法从脂肪组织中分离获得脂肪基质细胞,原代培养后,以诱导培养基(内含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10-8mol/L地塞米松、50mg/L维生素C)进行诱导培养。实验评估:应用形态学观察、碱性磷酸酶钙-钴法染色检测碱性磷酸酶,Von Kossa钙化结节染色检测钙化结节的形成等方法来鉴定诱导分化所得细胞的成骨活性。结果:行诱导培养的脂肪基质细胞呈多层成长,形态多为梭形、锥形或立方形,细胞外基质有白色钙化结节形成;细胞增殖速度减慢,生长周期变长。碱性磷酸酶钙钴法染色及Von Kossa钙化结节染色后均表现为阳性,未诱导培养的脂肪基质细胞则表现为阴性。结论:初步建立了一套由脂肪组织分离培养脂肪基质细胞的方法,并证明该细胞具备成体干细胞的特性,在体外诱导培养条件下具备向成骨细胞分化的能力。
张超, 龚跃昆, 刘劲松, 李彪[10]2009年在《兔脂肪基质细胞的分离培养及其成骨活性的研究》文中研究指明目的探讨兔脂肪组织来源脂肪基质细胞的分离培养方法及其成骨活性.方法取成年新西兰大白兔腹股沟皮下脂肪组织1～2mL,采用机械切割及Ⅰ型胶原酶消化法从脂肪组织中分离获得脂肪基质细胞,原代培养及传代以后,以诱导培养基(内含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10～8mol/L地塞米松、50mg/L维生素C)进行诱导培养.实验评估:应用形态学观察、碱性磷酸酶钙-钴法染色检测碱性磷酸酶,VonKossa钙化结节染色检测钙化结节的形成等方法来鉴定诱导分化所得细胞的成骨活性.结果行诱导培养的脂肪基质细胞呈多层成长,形态多为梭形,细胞外基质有白色钙化结节形成;细胞增殖速度减慢,生长周期变长.碱性磷酸酶钙钴法染色及VonKossa钙化结节染色后均表现为阳性,未诱导培养的脂肪基质细胞则表现为阴性.结论初步建立了一套由脂肪组织分离培养脂肪基质细胞的方法,并证明该细胞在体外诱导培养条件下具备向成骨细胞分化的能力.
参考文献：
[1]. 猪脂肪间充质干细胞的分离培养及体外诱导分化研究[D]. 屈长青. 西北农林科技大学. 2006
[2]. 脂肪基质细胞的分离及成骨诱导培养[D]. 林云锋. 四川大学. 2003
[3]. 脂肪基质细胞多向分化能力及其在组织工程中应用的研究[D]. 林云锋. 四川大学. 2006
[4]. 体外培养人体脂肪基质细胞和骨髓基质细胞的成骨活性对比[J]. 江毅, 刘智, 韩立强, 朱争艳, 田永刚. 中国组织工程研究与临床康复. 2010
[5]. 淫羊藿黄酮的分离鉴定及其抗骨质疏松活性的机制探讨[D]. 王婷. 中国协和医科大学. 2006
[6]. 猪脂肪间充质干细胞分离培养及成骨诱导[J]. 屈长青, 张国华, 杨公社. 自然科学进展. 2007
[7]. 组织工程中应变对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响[D]. 李娜. 中国人民解放军军事医学科学院. 2005
[8]. 人体脂肪基质细胞分离培养及其成骨潜能[J]. 陈希哲, 林云锋, 乔鞠, 田卫东, 闫征斌. 实用口腔医学杂志. 2004
[9]. 人体脂肪基质细胞的分离培养及其成骨活性的研究[J]. 江毅, 韩立强, 朱争艳, 肖连平, 刘智. 中国组织工程研究与临床康复. 2007
[10]. 兔脂肪基质细胞的分离培养及其成骨活性的研究[J]. 张超, 龚跃昆, 刘劲松, 李彪. 昆明医学院学报. 2009
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