苏磊[1]2008年在《鸡传染性支气管炎免疫胶体金诊断试纸研究》文中研究说明由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡传染性支气管炎(IB)(简称鸡传支)由于病毒具有多血清型和多组织嗜性,易于发生变异而难以防制,成为养鸡业发展的重大阻力。世界各国都非常重视,对其进行了大量研究。目前鸡传支确切诊断依赖于病毒的分离鉴定、血清学检测、分子生物学诊断技术以及电镜技术等。血清学诊断方法包括血凝及血凝抑制实验,神经氨酸酶抑制实验,琼脂糖扩散实验,病毒中和实验,酶联免疫吸附实验,免疫荧光技术等。但这些检测方法由于检测时间较长及检测所需仪器设备较昂贵,多数不适于临床快速检测。因此,新型快速检测鸡传支的方法急需建立,本研究利用免疫胶体金层析技术初步实现了对鸡传支的快速检测,对鸡传支的快速检测具有重要意义。本研究将鸡传染性支气管炎病毒C型株尿囊液经蔗糖梯度密度离心纯化制取抗原,免疫BALB/C小鼠,将4次免疫后的小鼠脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合,融合率达68.3%。经间接ELISA检测、有限稀释法克隆,筛选出了2株能稳定分泌特异性抗鸡传染性支气管炎抗体的杂交瘤细胞株,依次命名为4D_4、4D_6,2株单抗的亚类都属于lgG1,k型。ElISA检测时仅与IBV发生特异性反应,而与其他常见禽类病毒抗原不出现交叉反应。获得的单克隆抗体是制备鸡传染性支气管炎免疫胶体金快速诊断试纸条的理想试剂。用IBV C型鸡传支油乳剂疫苗对兔子进行长期免疫,用间接ELISA方法和琼脂扩散实验(AGP)进行检测,得到了高效价的兔抗IBV多克隆抗体。其效价分别为:ELISA法效价达1:10万以上,AGP法效价在1:16-1:32之间。本实验用获得的单克隆抗体和多克隆抗体建立了鸡传支病毒的胶体金免疫层析快速诊断方法。根据实验需求制备了30 nm的胶体金颗粒,对单克隆抗体(4D4株)最适稳定标记量进行测定,选择100 ml 0.01%金溶胶中的IBV单抗标记量为12ug/ml。通过最适稳定标记量对单克隆抗体进行标记,成功制备了性能稳定、免疫学活性好的金标IBV单克隆抗体,该金标抗体在4℃保存半年未见有沉淀或分层现象。将制备好的金标抗体及经辛酸-饱和硫酸铵法提纯的兔抗IBV IgG用于免疫胶体金诊断试剂条的制备。反应体系将金标抗体固定于玻璃纤维膜上作为显色源,将兔抗IBV IgG包被在硝酸纤维素膜上作为捕获线,羊抗鼠IgG固定硝酸纤维素膜上作为质检线,通过确定各部分最佳喷涂量后制成免疫胶体金诊断试纸条。在检测过程中若待检样品中含有IBV抗原,则在有效的检测试剂条上捕获线和质检线处均出现一条红线,若待检样品中不含IBV抗原则只在质检线处出现一条红线。通过结果的判定,该快速检测测试条灵敏度可达5ng/ml。同时本试验用单克隆抗体和多克隆抗体建立了双抗体夹心ELISA法用于检测鸡传染性支气管炎病毒,该方法灵敏度可达3.75ng/ml,标准曲线在3.75ng/ml-500ng/ml范围内线性良好。通过与免疫胶体金诊断方法进行比较,二者检测符合率达90%以上。本研究成功制备了抗IBV的多克隆抗体及抗IBV共同表位的单克隆抗体,并将其应用在IBV的诊断上,初步制成了鸡传支免疫胶体金诊断试纸条。通过与双抗体夹心ELISA方法比较研究表明,鸡传支免疫胶体金诊断试纸条具有检测灵敏度高,稳定性好,特异性好,准确度高,重复性好,操作方便等优点,在IBV的快速诊断上具有重要意义。
庄金秋, 阮震, 张颖, 梅建国, 苗立中[2]2018年在《鸡传染性支气管炎病毒实验室检测方法研究进展》文中进行了进一步梳理鸡传染性支气管炎(IB)是鸡的一种急性、高度接触性、呼吸道传染病,严重危害着养禽业的健康发展。为有效地控制本病的流行,建立快速准确的检测方法具有重要意义。本文从该病的病原分离和鉴定、血清学及分子生物学等方面对IB的实验室检测方法最新研究进展进行了综述。
张宁[3]2013年在《肉鸡ND、IB抗体消长规律、免疫程序制定及效果监测》文中研究说明某公司肉鸡养殖场ND、IB等时有发生，为了控制该病的发生，本试验通过检测肉鸡ND、IB的母源抗体及疫苗免疫后抗体的消长变化，重新制定了免疫程序，并对其效果进行了监测。将200只1日龄罗斯308雏鸡，随机分成6组，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ六个组组。试验Ⅰ组30只雏鸡，自2日龄始，跟踪检测母源抗体变化，当ND的抗体≤6log2时进行ND疫苗的首免，继续检测血清抗体变化情况，若抗体再次低于6log2时，则进行第二次免疫。试验Ⅱ组30只雏鸡，按照公司的ND免疫时间进行疫苗免疫。试验Ⅲ组30只雏鸡，当ND≤6log2时，IB≤3000时进行两种疫苗的免疫，跟踪检测抗体变化，当血清中抗体再次低于ND≤6log2时，IB≤3000时，进行第二次免疫。试验Ⅳ组30只雏鸡，按照公司的ND、IB的免疫时间进行疫苗免疫。试验Ⅴ组30只雏鸡，严格执行公司整套免疫程序，按时接种ND、IB、IBD、AI四种疫苗。试验Ⅵ组为对照组，40只雏鸡不接种任何疫苗，跟踪监测ND、IB抗体变化。各试验组鸡只使用脚标编号，分别在2、5、7、10日龄进行心脏采血，在13、16、20、24、28、31、35、39、43日龄进行翅下采血，每次每组采血10只。IB抗体检测采用ELISA方法，ND抗体水平检测采用血凝血抑实验方法。母源抗体检测结果显示；2日龄时ND母源抗体水平较高且抗体滴度整齐、均匀、平均为9.1log2。随着日龄的增加，母源抗体逐渐下降，31日龄时母源抗体下降到1log2。在5日龄时，ND母源抗体均值为6.1log2（ND≤6log2），因此将试验Ⅰ组和试验Ⅲ组新城疫疫苗首免时间确定为6日龄，在16日龄时，ND抗体均值为6.9log2，决定进行第二次免疫，将第二次时间确定为17日龄，在28日龄时，ND抗体均值为6.1log2，进行第叁次免疫，免疫时间确定为28日龄。ND抗体检测结果显示：试验Ⅰ组与Ⅱ组比较，前期差异均不显着（P＞0.05），但31日时，试验Ⅰ组（6.8log2）较试验Ⅱ组（2.1log2）差异极显着（P＜0.01）；试验Ⅰ组与试验Ⅲ组（6.1log2）比较差异不显着（P＞0.05）；试验Ⅰ组与试验Ⅳ组比较，前期检测数据差异不显着（P＞0.05），在31日龄时试验Ⅰ组与试验Ⅳ组（2.1log2）差异极显着（P＜0.01）；试验Ⅰ组与试验Ⅴ组比较，31日龄时试验Ⅰ组与试验Ⅴ组差异极显着（P＜0.01），IB抗体检测结果显示：雏鸡IB母源抗体水平较高，2、7日龄分别在7486与2885之间，在第7日龄进行了IB疫苗的首免，16日龄IB抗体滴度为3025，17日龄进行二次免疫，随着日龄的增长肉鸡的母源抗体逐渐衰减，30日龄后降到很低。试验Ⅰ组与Ⅲ组比较，IB抗体消长差异不显着（P﹥0.05）；试验Ⅰ、Ⅲ组IB抗体明显高于其它各组，差异显着（P＜0.05），24日龄、28日龄、32日龄、35日龄检测结果显示，试验Ⅰ组、Ⅲ组IB抗体明显高于其它各组，差异显着（P＜0.05）。试验Ⅰ组与试验Ⅲ组间差异不显着（P＞0.05）。根据试验结果确定ND、IB的免疫程序为：新城疫疫苗接种日龄分别是6、17、28日龄；鸡传染性支气管炎疫苗接种日龄分别是7、17日龄。在盐山公司肉鸡养殖基地应用该免疫程序进行验证性试验，结果显示：整个饲养周期中，试验区域内均未出现发病情况，而应用公司免疫程序的鸡群，仍有ND、IB病的散发；在巨鹿、大名肉鸡养殖基地应用新免疫程序免疫鸡群，ND、IB基本得到了控制。
莫秀娟[4]2013年在《鸡传染性支气管炎病毒间接N-ELISA试剂盒的研制及反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法的建立》文中认为鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。IB可感染所有日龄的鸡并且还常常引起支原体混合感染以及大肠杆菌等继发感染从而增加鸡群的死亡率,给养鸡业生产带来巨大的损失。目前,该病呈世界性流行,是严重危害世界养禽业的重要传染病之一。IBV基因组容易发生变异导致其血清型众多,不同血清型之间交叉保护力弱,给本病防治带来很大的困难。因此探索快速、灵敏、特异的抗体检测和病原诊断方法已成为当前迫切需要解决的难题。当前IBV抗体血清学检测方法中,ELISA因具有快速、简便、准确、特异的特点被广泛采用并已被国际兽疫局(OIE)确定为标准方法。当前商品化的IBV抗体检测试剂盒大多采用全病毒粒子包被,对不同血清型的地方毒株的交叉反应性差异较大,加上活病毒纯化困难且存在散播病毒的危险性及检测成本高,使得商品化IBV抗体检测试剂盒的应用受到限制。IBV传统的病原诊断方法虽然准确,但操作复杂、耗时、费力,其它的核酸诊断方法如核酸探针杂交、RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR方法灵敏、特异,但分别存在耗时、致癌物质EB的污染、需要昂贵的仪器和试剂的不足之处,不适于基层快速检测需要。因此,研究利用序列相对保守且具有强免疫保护性的IBV N基因重组蛋白作为包被抗原的ELISA诊断试剂盒和建立快速、操作简便的IBV检测方法十分重要。首先,本研究在本课题组建立的间接N-ELISA的基础上进行试剂盒的研制,即进行批内和批间重复性试验、37℃加速老化试验、4℃和-20℃保存期试验对比、符合性试验和阻断试验。结果表明,批内重复性试验变异系数为3.07%～8.34%,批间重复性系数为2.33%～6.36%,均小于10%,说明该试剂盒具有良好的重复性;4C和-20℃保存期试验表明该试剂盒的最佳保存条件为-20℃;37℃加速老化试验结果表明试剂盒在4℃可稳定保存7～8个月,二抗在4℃可稳定保存一年左右;应用研制的试剂盒和IDEXX公司的商品化试剂盒同时检测296份血清样品,结果该试剂盒阴性符合率为86.39%,阳性符合率为97.3%,说明本试剂盒具有很好的符合性。应用研制的IBV间接N-ELISA试剂盒对来自广西A、B、C、D、E五个公司的1368份血清样品进行检测,结果表明该试剂盒检测结果能够很好的反映免疫效果;应用保存期为2、4、6个月的试剂盒分别检测来自临床的540份血清,结果表明随着时间的推移,被检测样品抗体水平除了稍下降外,吻合性非常好。其次,本研究根据IBV的N基因序列设计了一套环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测IBV的方法,敏感性试验表明该方法的检测限为900fg以下;特异性试验表明该方法具有良好的特异性;批间和批内重复性试验表明本方法具有良好的重复性;该方法对临床病料的检测结果与常规RT-PCR结果符合。全程只需要一台水浴锅,一个小时即可完成全部反应。因此,本研究建立的RT-LAMP方法特异、重复性好、不需特殊仪器、简便、快速,适用于IBV的快速检测,值得在基层业务部门及养殖场推广。因此,本研究研制了特异、敏感、安全、稳定且廉价的IBV间接N-EILSA试剂盒和特异、敏感、重复性好、不需特殊仪器、简便、快速的反转录RT-LAMP检测方法。本研究具有非常重要的应用价值。
刘钧[5]2004年在《鸡传染性支气管炎抗体ELISA诊断方法研究》文中进行了进一步梳理鸡传染性支气管炎病是传染性支气管炎病毒引起鸡的一种急性、高度接触性传染病，是威胁集约化养鸡场的主要疫病之一。本试验建立了一种用于检测鸡传染性支气管炎血清抗体的方便、特异、快速的检测方法。方法：利用9日龄SPF鸡胚尿囊腔复壮IBV，通过鸡胚成纤维细胞传代培养IBV，经过蔗糖密度梯度离心纯化病毒，测定蛋白含量(抗原浓度为7.7mg／ml)，做系列稀释包被酶标板，利用过碘酸盐法将辣根过氧化物酶标记于兔抗鸡IgG上，作为酶结合物(酶工作浓度为1：800)，也做一系列稀释，利用棋盘滴定法，分别确定包被抗原、酶结合物以及血清稀释度，用TMB作为显色剂，建立了检测血清样品中传染性支气管炎抗体(阳性临界值判定标准为0.14)的ELISA检测方法。结果：利用将IBV接种鸡胚成纤维细胞的方法而制备的抗原可用于本试验；与NDV，MDV，IBDV，AIV，APIV，REV，ILTV，IC，MG，MS等抗血清无交叉反应；与IBV Gray株、M株、Conn株、T株、B株、H株、Ark99株、SE17株的抗血清有交义反应，有较好的群特异性；与IDEXX IB-ELISA检测方法相比较，结果吻合较好。结论：成功的建立了传染性支气管炎间接ELISA检测方法，可用于检测血清样品中鸡传染性支气管炎抗体。
候菲菲[6]2016年在《鸡传染性支气管炎免疫效果的监测及其对产蛋性能的影响》文中研究表明鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡的一种急性和高度接触性传染病。各个日龄的鸡均易感,主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统,给养鸡业造成了巨大的经济损失。疫苗接种被认为是目前防控鸡传染性支气管炎最有效的方法,但由于IBV血清型众多和容易发生变异,且这些血清型之间很少或没有交叉保护,这给鸡传染性支气管炎的防控带来了困难。本研究通过对山东省某种禽公司7个鸡场的父母代种鸡进行IBV抗体水平检测,并对疑似鸡群进行病毒株的分离鉴定和产蛋性能的统计分析,以期了解现有免疫程序对IB的免疫效果,并为免疫程序的调整提供依据。本试验获得结果如下:1.按照鸡场现有免疫程序的安排,应用ELISA方法检测血清中IBV特异性抗体水平情况。4周龄时,鸡场4的IBV抗体水平显着高于其它6个鸡场(p<0.01);16周龄时,各鸡场的抗体水平明显升高;19~21周龄时,有5个鸡场的抗体水平出现明显的下降;26周龄时,鸡场4的抗体水平明显高于其它几个鸡场(p<0.05);30周龄时,鸡场5的抗体水平显着高于其它几个鸡场(p<0.05)。总体上来看,鸡场6和7的整体免疫效果良好,鸡场4和鸡场5的免疫效果最差。2.从鸡场3、4和5鸡群中采集气管组织,经鸡胚传代和病毒RNA提取,采用RT-PCR对S1基因进行扩增鉴定,发现3个鸡场均为阳性。鸡场4和5的RT-PCR扩增序列完全一致,鸡场3由于信号较弱,测序失败。将扩增序列与国内流行的QX-Like毒株进行序列对比,发现其同源性在97%以上;遗传进化树分析与QX-Like毒株亲缘关系最近。3.与免疫效果良好的鸡场6相比,鸡场4和5的产蛋率和种蛋合格率下降,双黄蛋率、软壳蛋率、碎蛋率和畸形蛋率升高。可见,感染QX-Like毒株的鸡群对产蛋性能的影响较大,可造成产蛋量下降、畸形蛋量增加、种蛋合格率降低和蛋品质下降。
张兵[7]2008年在《鸡传染性支气管炎病毒（M41株）血凝抑制试验抗原的研制及应用》文中研究表明目前,我国鸡传染性支气管炎灭活疫苗产品的效力检验方法为血清学方法(HI试验),但国内尚无质量可靠的商品化血凝抑制试验抗原(以下称HI抗原),给该类产品的质量控制带来严重影响。为此,本课题开展了鸡传染性支气管炎病毒(M41株)HI抗原的研制及其在灭活疫苗效力评价上的应用研究。将鸡传染性支气管炎病毒(M41株)接种10日龄SPF鸡胚,37℃孵化36h后无菌收集尿囊液,经5000g离心40min,30000g离心2h进行100倍浓缩,浓缩病毒液用10%~20%的A型产气荚膜梭菌培养液上清37℃处理2~2.5h后,成功制备了鸡传染性支气管炎病毒HI抗原。按筛选的工艺制备并冻干了3批HI抗原,3批冻干抗原的血凝效价达到8-10log2。使用荷兰GD公司进口HI抗原和自制抗原检测新城疫、禽流感、产蛋下降综合征阳性血清及鸡阴性血清HI抗体≤3log2,特异性良好。依据产品质量标准使用3批HI抗原对洛阳普莱柯公司生产的10批鸡新城疫(La Sota株)-传染性支气管炎(M41株)-禽流感(H9亚型HL株)叁联灭活疫苗和4批鸡新城疫(La Sota株)-传染性支气管炎(M41株)-减蛋综合征(AV127株)叁联灭活疫苗共计14批产品的传染性支气管炎成分进行了效力检验,结果表明使用灭活疫苗二免后血清HI抗体几何平均滴度较活疫苗首免后血清HI抗体平均几何滴度分别高9.4倍(2007001)、8.5倍(2007002)、9.8倍(2007003)。用荷兰GD公司HI抗原检测结果为10.5倍。3批冻干抗原于4℃保存一年HA效价不变。使用叁批经2007003批HI抗原效力检验合格的鸡新城疫(La Sota株)-传染性支气管炎(M41株)-禽流感(H9 HL株)叁联灭活疫苗进行了鸡传染性支气管炎灭活疫苗效力评价方法的研究。结果表明,仅使用活疫苗免疫的B组试验鸡在产蛋高峰期经IBV M41株攻毒后在4周内产蛋率下降可达17%,作为对照的C组试验鸡在产蛋高峰期经IBV M41株攻毒后在4周内产蛋率下降达34%。而使用活疫苗基础免疫后再使用灭活疫苗加强免疫的A组试验鸡在产蛋高峰期可以抵抗IBV M41株的攻击并可维持高峰期的产蛋量。使用2-4周龄SPF鸡按两步法效力检验合格的灭活疫苗应用于产蛋鸡可以对生产性能起到良好的保护作用,说明以血清学效力检验方法作为鸡传染性支气管炎灭活疫苗的效力检验标准是科学的。
张淑霞[8]2007年在《鸡传染性支气管炎病毒HN99株N、M基因的研究》文中指出鸡传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。IBV主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统。病鸡出现呼吸困难、产蛋下降、肾炎和腺胃炎等症状和病变。IBV的特点是变异频繁,血清型复杂,所致疾病的临床表现差异很大。常规的诊断方法存在一定的局限性,新的分子生物学诊断方法成为近年来研究的热点。以前,人们对IBV的研究主要集中在S1基因上;但进一步的研究发现,IBV的其他结构蛋白也有重要的生物学功能。近年来,我国鸡传染性支气管炎的流行呈上升趋势,尤其是肾型、腺胃型鸡传染性支气管炎已造成了巨大的经济损失。许多学者认为大量变异株的出现与不规范使用活疫苗有关,但目前有关我国IBV地方流行株的基因序列数据还不够充分,分子生物学方面的研究也还不够深入。为了探索IBV血清型复杂多变的原因及基因工程诊断试剂的研制,本研究对IBV HN99国内分离株的N基因进行了克隆、序列分析、原核表达及表达产物的免疫活性检测;对IBV HN99株的M基因进行了克隆、序列分析及真核表达,为我国IB的诊断及免疫提供科学依据。1.根据GenBank中已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增IBV HN99株的N基因,并将其克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌Top10,提取pMD18-T-N重组质粒,进行酶切和PCR鉴定,并对阳性质粒进行测序,将测序结果与H52、Ark99、BJ等参考毒株进行序列分析。结果表明,N基因全长为1230 bp,编码一条409个氨基酸组成的多肽;其核苷酸与H52,Ark99和BJ等毒株的同源性为88.4%～90.7%,氨基酸同源性为91.7%～94.4%;HN99株与H52,Ark99和BJ等其他各毒株的亲缘关系较远,是一株新的IBV变异株。2.通过RT-PCR扩增HN99株和W株的M基因并测序,将这2个毒株的M基因与GenBank中毒株M基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较,并建立M基因系统发育树。结果表明:HN99株M基因全长为669 bp,编码222个氨基酸残基,HN99株存在碱基插入与缺失,而W株M基因全长为681 bp,编码226个氨基酸残基,W株有碱基插入;HN99株与GDS14、M41、Gray、H52、BJ等毒株的M基因核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性分别为87.0%～90.3%和89.7%～94.2%,W株与HN99、M41、Gray、H52、BJ等毒株的M基因核苷酸同源性及其推定的氨基酸分别为88.2%～92.7%和91.1%～95.6%。遗传进化树显示W株与BJ亲缘关系近,HN99株与其他毒株亲缘关系均较远。3.鸡传染性支气管炎病毒HN99株膜蛋白(M)基因PCR产物经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,克隆入杆状病毒真核表达载体pF-MBP。将构建的重组表达质粒pF–MBP/M转化到DH10BAC-eGFP菌中,然后用脂质体转染法将重组质粒Bacmid-egfp-MBP/M转染Sf9细胞。盲传两代后,倒置显微镜下可见转染的Sf9细胞比正常细胞折光性增强,细胞核增大,细胞增大最后破裂;在荧光显微镜下观察可见细胞浆内有绿色的荧光。提取病变Sf9细胞的DNA,分别用M13引物、特异性引物进行PCR鉴定,从病变细胞中扩增出特异性片段,表明已经产生重组病毒。M基因的表达产物经SDS-PAGE和Western Blot检测结果显示,重组病毒蛋白条带大小约为68 ku,与预期结果一致。4.鸡传染性支气管炎病毒HN99株核蛋白(N)基因PCR产物经BamHⅠ、HindⅢ双酶切,分别克隆入大肠杆菌原核表达载体pMAL?-p2X、pMAL?-c2X、pET28a,构建重组表达载体,经IPTG诱导之后,选择表达量最大的pMAL?-p2X-N做进一步的蛋白纯化、鉴定及表达产物的免疫活性检测。将重组表达质粒pMAL-p2X-N,转化大肠杆菌TB1并进行诱导表达;通过pMAL?融合蛋白纯化系统对表达产物进行非变性纯化,将纯化的N蛋白按常规方法免疫新西兰大白兔,制备兔抗鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的多克隆抗体,并用ELISA检测其生物活性。结果表明,重组质粒pMAL?-p2X-N经IPTG诱导,表达的重组核蛋白纯化后相对分子质量分别约为92 ku和82 ku,82 ku的蛋白可能是92 ku蛋白的裂解产物,与Western blot出现的两条蛋白带相一致;纯化的重组蛋白经麦芽糖标签裂解因子作用后,出现两条蛋白带,相对分子质量分别为45 ku和35 ku,说明融合蛋白中的标签已被切除,得到了纯度较高的N蛋白,与预期结果相符合;制备的多克隆抗体可与不同鸡传染性支气管炎病毒株发生反应,与亲本毒株的反应性高于与其他毒株的反应性。综上所述,IBV HN99株N、M基因核苷酸序列均发生了一定程度的变异,与其他参考株亲缘关系均较远,是一株新的IBV变异株。IBV HN99株N基因在原核系统中获得了成功表达,表达的可溶性N蛋白具有高度的生物活性,有望做为新的基因工程抗原用于鸡传染性支气管炎病毒的群特异性诊断;IBV HN99株M基因在带有绿色荧光蛋白标签的真核系统中获得了成功表达;IBV W株M基因存在碱基插入现象,序列发生了变异。本研究为IBV的研究补充了新的试验数据,为预防和控制IB提供了新的资料和科学依据。
张进良[9]2010年在《鸡的主要病毒性疫病抗体快速检测方法的建立和应用研究》文中指出禽流感(AI)、新城疫(ND)、传染性支气管炎(IB)、传染性法氏囊(IBD)和鸡毒霉形体(MG)感染是目前危害我国养鸡业的几种主要的呼吸道传染病,可导致鸡群不同程度的死亡和生产性能的下降,给我国养禽业造成极大的经济损失。上述疫病虽均有疫苗进行免疫预防,但由于我国地域广阔,养殖模式多样,各种疫病特别是呼吸道疫病仍时有发生,因此,发病后的快速诊断或免疫后的血清抗体效价监测已经成为各地养禽场和诊断室的常规检测项目。目前常用的检测方法有血凝和血凝抑制试验、琼脂扩散试验以及酶联免疫吸附试验等,这些常规方法有的耗时长,有的需要特殊的仪器或技术人员,因而在基层应用受到一定限制。胶体金免疫层析方法是以条状纤维层析材料为固相载体,通过毛细管作用原理,以胶体金为示踪物来显示结果的一种新型的检测方法。这种方法具有操作简单、快捷,分析结果清楚、易于判断,且不需要任何仪器、成本低廉等优点,非常适用于现场检测及自动化检测分析。因此,在医学快速检测领域得到了迅猛发展,目前已逐渐应用于动物医学领域的快速检测方面。本研究针对目前鸡的几种主要病毒性疫病抗体检测方法中存在的问题,运用胶体金免疫层析技术,采用间接法原理,建立了五种鸡的主要病毒性疾病抗体的快速检测方法,一种抗体叁联检的检测方法和一种抗体效价测定的检测方法。取得了如下研究成果。1. AIV-HA1、NDV-HN、IBV-N、IBDV-VP2和MG-VlhA1.2重组蛋白的表达纯化用带有GST标签的原核表达载体,实现了AIV-HA1、NDV-HN、IBV-N、IBDV-VP2和MG-VlhA1.2重组蛋白的高效表达,通过亲核层析的方法获得了适合于制备试纸条的重组蛋白,并用Western blot对纯化的蛋白进行了分析,结果证实,这5种融合表达的蛋白均具有较好的免疫活性。2.抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的制备复苏抗鸡IgG Fc段单克隆抗体生产细胞株BDRPDP细胞,经小鼠腹腔接种获得的抗体效价较高的腹水,用辛酸硫酸铵法纯化腹水,并用透析法对纯化的单克隆抗体进行脱盐,获得了高活性、高纯度的单克隆抗体。3.胶体金及胶体金单抗复合物的制备成功确立了柠檬酸叁钠还原法制备20 nm胶体金的条件；并利用该胶体金,对抗鸡IgG Fc段单克隆抗体进行了胶体金标记条件的摸索,成功确立了胶体金标记单克隆抗体的条件：每毫升胶体金加入7μL 0.1 mol/L K2CO3时pH最佳,每毫升胶体金加入12μg单克隆抗体为最适蛋白用量,并在该条件下制备了胶体金单抗复合物。4. AIV、NDV、IBV、IBDV和MG血清抗体快速检测试纸条的研制以胶体金标记抗鸡IgG Fc段单克隆抗体作为金标抗体,固定在检测线上的AIV-HA1或NDV-HN或IBV-N或IBDV-VP2或MG-VlhA1.2重组蛋白作为捕获抗原,采用间接法,分别成功地建立了AIV HA1蛋白血清抗体快速检测试纸条、NDV血清抗体快速检测试纸条、IBV血清抗体快速检测试纸条、IBDV血清抗体快速检测试纸条和MG血清抗体快速检测试纸条。用制成的这5种单一血清抗体快速检测试纸条对AIV H5亚型阳性血清、AIV H9亚型阳性血清、NDV阳性血清、IBV阳性血清、IBDV阳性血清、IBDV阳性血清和MG阳性血清分别进行测试。每种试纸条均只与相应的阳性血清发生反应,与其他所有阳性血清均呈阴性反应。在此基础上,本研究又以抗鸡IgG Fc段单克隆抗体作为示踪物,采用叁条检测线分别包被IBDV-VP2、IBV-N和AIV-HA1重组蛋白作为捕获抗原,建立了IBDV、IBV和AIV叁联血清抗体快速检测试纸条。实验结果证明,本方法特异性强,灵敏度高,且操作简便、结果判定直观,可在一份样品中同时对IBDV、IBV和AIV叁种抗体进行快速检测。5.IBV抗体效价快速检测试纸条的研制本研究以胶体金标记抗鸡IgG Fc段单克隆抗体作为示踪物,用固定在叁条检测线上的不同浓度的IBV-N蛋白作为捕获抗原,采用间接法,成功地建立了IBV抗体效价快速检测试纸条。用制成的试纸条检测AIV H5亚型阳性血清、AIV H9亚型阳性血清、NDV阳性血清、IBV阳性血清、IBDV阳性血清、IBDV阳性血清和MG阳性血清分别进行测试,未出现与交叉反应。对不同效价的IBV抗体进行测试,确定为血清效价大于8log2出现叁条检测线,介于8log2和5log2之间的出现两条检测线,介于5log2和2log2之间的出现一条检测线,小于2log2不出现检测线。实验结果表明,本方法特异性强,且操作简便、结果判定直观,可以用于IBV抗体效价测定。
郝春丽[10]2007年在《鸡传染性支气管炎病毒S1和NP基因的表达及NP-ELISA方法的建立》文中提出IBV血清型众多,不同血清型间交叉保护差,给诊断与防制带来很大的困难;为建立一种更为简便、快速、群特异性、能用于大面积检测抗体的方法,来补充中和试验和HI试验,以评价疫苗的免疫效果,本研究将对NP-ELISA和S1-ELISA进行探讨。本研究利用RT-PCR技术成功地扩增了传染性支气管炎病毒M41株的NP基因,克隆并重组于原核表达载体pET-28a,经PCR、酶切鉴定及序列测定成功地构建了重组表达载体pET-NP。重组菌pET-NP经IPTG诱导,获得了高效表达,分子量约为49kDa,且以可溶性蛋白形式存在。重组菌pET-NP经大量诱导表达后,收集菌体,超声波裂解,取上清透析后,采用Ni亲和层析柱纯化重组NP蛋白,经12%的SDS-PAGE分析,表明获得了纯度较高的重组NP蛋白。用纯化的NP蛋白作包被抗原,建立了检测IBV抗体的NP-ELISA。抗原最佳包被浓度为1.45μg/孔,待检血清最佳稀释度为1:80,酶标二抗最佳工作浓度为1:800。确定阳性判定标准为0D450≥0.270。NP-ELISA与AIV H9、H5、H7、IBD、ND、EDS_(76)的标准阳性血清不发生交叉反应,具有良好的特异性,且灵敏度高、重复性好,但试验表明与HI试验、攻毒保护试验结果没有相关性,故不能用于IB免疫效果的评价方法。本研究利用RT-PCR技术成功地获得了完整的S1基因(S1-1),片段大小为1614bp。在分析全长S1基因的基础上,又扩增了去掉信号肽及包含主要抗原位点的S1-2和S1-3片段,大小分别为1533bp和801bp。将叁个片段分别克隆并重组于原核表达载体pGEX-6P-1,构建了pGEX-S1-1、pGEX-S1-2、pGEX-S1-3重组原核表达载体,经PCR、酶切鉴定及序列测定证明叁个基因片段均正确地插入到表达载体中,且阅读框正确。叁种重组质粒分别转化于宿主菌BL21(DE3),经IPTG进行诱导表达,表达产物经12%的SDS-PAGE电泳分析,结果表明,重组质粒pGEX-S1-1和pGEX-S1-3没有得到有效表达,而重组质粒pGEX-S1-2获得了表达,表达产物以包涵体形式存在,表达产物的分子量约为80kDa,与理论上推测的分子量大小一致。表达产物经Western-blotting分析表明,该表达蛋白能与M41株标准阳性血清反应,说明此表达蛋白具有良好的生物学活性。S1蛋白是最重要的保护性抗原,可诱导机体产生中和、血凝抑制及保护性抗体,通过实现S1蛋白的有效表达,并建立S1-ELISA,探讨S1-ELISA效价与攻毒保护间的关系,有望替代HI试验和中和试验,用于免疫后抗体的检测和疫苗质量的评价,S1蛋白的表达也可为S1蛋白结构与功能的深入研究和基因工程疫苗的研制奠定良好基础。
参考文献：
[1]. 鸡传染性支气管炎免疫胶体金诊断试纸研究[D]. 苏磊. 西南大学. 2008
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[3]. 肉鸡ND、IB抗体消长规律、免疫程序制定及效果监测[D]. 张宁. 河北农业大学. 2013
[4]. 鸡传染性支气管炎病毒间接N-ELISA试剂盒的研制及反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法的建立[D]. 莫秀娟. 广西大学. 2013
[5]. 鸡传染性支气管炎抗体ELISA诊断方法研究[D]. 刘钧. 中国农业大学. 2004
[6]. 鸡传染性支气管炎免疫效果的监测及其对产蛋性能的影响[D]. 候菲菲. 西北农林科技大学. 2016
[7]. 鸡传染性支气管炎病毒（M41株）血凝抑制试验抗原的研制及应用[D]. 张兵. 中国兽医药品监察所. 2008
[8]. 鸡传染性支气管炎病毒HN99株N、M基因的研究[D]. 张淑霞. 西北农林科技大学. 2007
[9]. 鸡的主要病毒性疫病抗体快速检测方法的建立和应用研究[D]. 张进良. 华中农业大学. 2010
[10]. 鸡传染性支气管炎病毒S1和NP基因的表达及NP-ELISA方法的建立[D]. 郝春丽. 河南农业大学. 2007
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