张继帅[1]2004年在《利用条件基因剔除技术研究Smad4基因在软骨内成骨过程中的功能》文中提出TGF-β超家族分子在调节细胞增殖、谱系分化、迁移、黏附和凋亡过程中具有重要作用。Smad4分子是TGF-β超家族分子信号通路的中心介导者。为了进一步深入研究TGF-β超家族分子在软骨内成骨过程中的功能，我们利用Cre-loxP系统研制了软骨细胞特异性Smad4基因剔除小鼠。我们首先利用ROSA26报告基因小鼠研究了软骨细胞特异性Cre转基因小鼠中Cre重组酶表达的组织特异性。结果显示，在间充质细胞分化为软骨细胞时，便开始表达Cre重组酶；Cre重组酶表达于脊椎骨、肋骨、四肢骨等所有由软骨内成骨形成的骨骼软骨组织部位；胫骨切片可以看到Cre重组酶表达于所有软骨细胞。这些结果表明Cre转基因小鼠能够在软骨细胞特异性表达Cre重组酶，可以作为在软骨细胞进行基因剔除的工具小鼠。通过将软骨细胞特异性Cre转基因小鼠和Smad4条件基因打靶小鼠交配，可以得到在软骨细胞特异性剔除Smad4基因的小鼠。我们使用了我们建立的不同软骨细胞特异性Cre转基因小鼠，发现产生的软骨细胞特异性Smad4基因剔除小鼠的表型不同，分别表现为：胚胎期死亡、新生期死亡和出生后存活。利用剖宫产术观察新生期死亡小鼠的死亡原因，发现死亡的基因剔除小鼠气管软骨环狭窄，肺不张，表明小鼠死亡的原因主要是Smad4基因剔除后，气管软骨环狭窄，气体不能通过，致使肺泡不能扩张，因为缺氧而死亡。我们主要分析了出生后存活的软骨细胞特异性Smad4基因剔除小鼠的表型，揭示了Smad4分子介导的BMP和TGF-β信号在软骨内成骨过程中的功能。Smad4基因剔除小鼠体型矮小，骨骼骨化延迟。从出生后第四天开始，基因剔除小鼠的胫骨生长板组织结构紊乱，表现为软骨细胞静止区增宽，增殖区和肥大区缩窄，软骨细胞提前肥大分化。利用Brdu掺入法测量出生后4天小鼠软骨细胞的增殖程度，发现基因剔除小鼠中增殖区软骨细胞的增殖能力降低。出生16人、22天后基因剔除小鼠胫骨生长板部位的软骨细胞排列极度紊乱，骨髓腔内残留有片状的静止软骨细胞。利用原位杂交检测生长板各区软骨细胞的标志分子，发现在软骨细胞增殖区有一些细胞表达胶原X分子，表明增殖软骨细胞的肥大分化提前。这些结果表明Smad4摘要分子可以促进静止软骨细胞分化，刺激增殖软骨细胞增殖，抑制软骨细胞肥大分化，并提示Smad4介导的信号可能作为调控生长板软骨细胞极性排列的形态发生素维持生长板软骨的正常组织结构。我们还研究了阻断Smad4介导的BMP、TGF一p信号对其它调控骨骼发育过程的关键信号通路的影响。原位杂交和免疫组化结果显示，Smad4基因剔除导致Ihh、Ptc、PTHrP、PPR基因的表达显着降低，提示基因剔除小鼠中Jh川PTHrP信号通路的功能减弱。研究还发现Smad4基因剔除导致了FGF信号的功能相对增强，生长板软骨细胞pZI分子表达水平升高以及STAT一1分子主要位于细胞核内。利用Von一Kossa染色观察小鼠骨骼矿化情况，发现基因剔除小鼠的骨领位置较高，紧邻增殖区软骨细胞。原位杂交检测成骨细胞的标志分子骨桥素和骨钙素，发现它们的表达位置比它们在对照小鼠的表达位置升高。这些结果表明基因剔除小鼠中软骨膜细胞提前分化为成骨细胞。为了验证Smad4介导的信号是否直接通过调节Ih树PTHrP信号通路控制软骨细胞的肥大分化，我们进行了胚胎期拓骨体外培养实验。结果显示Smad4基因剔除的踢骨失去了对BMP和TGF一p信号的反应，但仍能应答Ihh替代分子Shh的作用，对照和基因剔除踌骨软骨细胞的肥大分化均受到Shh的明显抑制。这些结果表明基因剔除小鼠中th讨PTHrP信号通路的功能正常，Smad4抑制软骨细胞肥大分化的作用不依赖于thll/PTHrP信号通路。我们的实验结果首次提供体内的遗传学证据证明Smad4分子是维持生长板软骨正常组织结构所必需的。Smed4介导的信号促进静止软骨细胞分化，刺激增殖软骨细胞增殖，不依赖于Ih可PTHrP信号通路抑制软骨细胞肥大分化。软骨组织特异性Smad4基因剔除小鼠的成功研制为进一步深入研究smad4介导的TGF一p信号在软骨内成骨过程中的作用和机制奠定了基础。
侯昭晖[2]2007年在《软骨细胞特异性Smad4条件基因敲除导致小鼠听力丧失和内耳发育畸形的相关研究》文中研究说明TGF-β超家族成员包括TGF-β，ACTIVIN和BMP。它们对胚胎发育、器官形成、调节细胞生长、分化、凋亡和间质的合成等方面起重要作用，其信号转导需要TGF-β受体和Smads分子的参与。Smad4是Smads共用型分子，是转导TGF-β信号的重要胞浆内信号级联分子，它与活化的受体激活型Smad分子形成复合物，移位到细胞核，与其他转录因子协同作用，调节TGF-β应答基因的转录。Smad4功能失活或是表达低下可能影响TGF-β的信号转导。为了研究Smad4基因在内耳发育中的作用，利用Cre-LoxP系统形成软骨细胞特异性Smad4条件基因敲除小鼠，绕过了应用完全基因敲除Smad4基因后导致小鼠在胚胎发育早期(e6.5)死亡的障碍。本研究通过听功能表型的观察和内耳形态学的多种方法对Smad4基因在内耳发育中的作用进行了初步研究。本研究包括以下叁个部分。第一部分动物模型的鉴定和Smad4基因在小鼠耳蜗内的表达在应用该动物模型进行Smad4基因功能研究前，我们首先要确定该模型的可靠性和敲除基因的准确性。只有在确定动物模型成功建立后，才能够保证接下来的功能学和形态学研究最终结果的科学性。软骨细胞特异性Cre重组酶转基因小鼠和ROSA26转基因小鼠交配，得到Cre和ROSA26双转基因小鼠。在双转基因小鼠中，Cre重组酶发挥作用会使来自ROSA26转基因小鼠的LacZ基因表达，通过LacZ染色观察LacZ基因表达的组织特异性来反映Cre重组酶表达的组织特异性。所有由软骨内成骨形成的骨骼，尤其是颞骨岩部LacZ染色阳性。这些证明了颞骨岩部表达Cre重组酶。应用Southern Blot技术来证明只有在软骨细胞内Smad4基因被特异性的剔除。免疫组织化学荧光显示在新生的Smad4+/+小鼠内耳软骨细胞内有强烈的萤光显色，而Smad4-/-小鼠内耳软骨细胞内没有检测到荧光信号。这证明了在小鼠内耳软骨细胞的确没有Smad4基因的表达，软骨细胞特异Smad4条件基因敲除小鼠动物模型成功建立。应用免疫组化我们来观察了叁种基因型小鼠耳蜗膜迷路内Smad4基因的表达情况，结果显示Smad4基因在叁种小鼠耳蜗感觉上皮内均有广泛表达，尤其是耳蜗毛细胞和血管纹。这些结果说明在软骨细胞剔除Smad4基因没有影响内耳感觉上皮中该基因的表达。第二部分软骨细胞特异性Smad4条件基因敲除小鼠的听功能检测探究Smad4基因在内耳发育是否发挥作用，首先要了解动物模型的听力表型特征。在本研究中对软骨细胞特异性Smad4条件基因敲除小鼠我们进行了听觉脑干反应(auditory brainstem response ABR)、耳蜗微音电位(cochlear microphonic CM)、听神经复合动作电位(compound action potential CAP)叁种听功能检查。ABR检查结果显示，野生型和杂合型小鼠均可以引出稳定的、可辨别的、可重复的ABR波形。而所有纯合子小鼠在测试条件下100 dBSPL以下均无法引出可辨别的、可重复的ABR波形。进行统计学处理，野生型小鼠和杂合型小鼠ABR阈值和纯合型小鼠ABR阈值相比差异有统计学意义(p＜0.01)。CAP检查结果与ABR检查结果相似，纯合子小鼠的全频均未见听神经复合动作电位引出(click，0.5k，1k，4k，8k，16k，32k)。野生型和杂合型小鼠在测试条件下都可以引出稳定的、可辨别的神经复合动作电位波形。野生型、杂合型小鼠的CM波形可见波形幅值在给声强度增加时呈现饱和状态(非线性)，而纯合子小鼠的波形随着给声强度的增加呈现非饱和状态(线性)。叁种听功能检查从不同角度评价了动物模型的听功能特征，ABR显示小鼠的整个听觉通路的某个部位或是某几个部位出现了Smad4基因缺陷导致的病理变化。CM结果证明小鼠模型的耳蜗的外毛细胞功能异常，耳蜗非线性调节功能丧失。CAP的结果证明小鼠模型的听神经放电同步化不良。综合以上结果，说明由于在软骨细胞中的Smad4基因的剔除，引起这种小鼠出现重度感音神经性耳聋。这种小鼠是听功能表型稳定的Smad4基因缺陷耳聋动物模型。第叁部分软骨细胞特异性Smad4条件基因敲除小鼠耳蜗的形态学观察在了解到这种耳聋动物模型听力表型特征之后，就要进行形态学的相关研究来获得引起这种表型变化的形态学和病理学相关信息。在这一部分中，我们应用了多种研究手段来详细评价动物模型耳蜗内的结构变化。将叁种基因型小鼠的内耳取出后在显微镜下比较，可见Smad4-/-小鼠的内耳较Smad4+/+和Smad4+/-体积明显减小，而且在大体形态上呈现出耳蜗蜗尖的骨性凹陷。将叁种基因型小鼠的中耳听小骨在显微镜下解剖出来后进行细微的比较，发现Smad4-/-小鼠和Smad4+/-小鼠的砧骨发育畸形。内耳标本环氧树脂包埋后半薄连续切片观察。观察到Smad4-/-小鼠耳蜗形态异常，骨螺旋板发育异常。无论是骨螺旋板的螺旋角度还是基底膜的螺旋角度均与Smad4+／+和Smad4+／-小鼠不同。测量相邻骨螺旋板的角度并经过统计学处理，显示纯合子组与其它两组相比差异有统计学意义(p＜0.05)。我们对叁种基因型小鼠连续切片观察了内外毛细胞、支持细胞、盖膜、螺旋韧带和血管纹的形态学特点。Smad4+／+和Smad4+／-小鼠内、外毛细胞形态正常，未见缺失；Smad4-／-小鼠的内、外毛细胞偶见点状缺失。盖膜、螺旋韧带未见明显的差异。但是值得注意的是，Smad4-／-小鼠的螺旋凸形态异常，与Smad4+／+和Smad4+／-小鼠相比较呈现明显的膨隆凸起。Smad4-／-小鼠耳蜗半薄切片螺旋神经节观察，螺旋神经节细胞胞核小，胞浆多，核与核之间间隙较大。而Smad4+／+小鼠螺旋神经节呈现正常的形态，核大，细胞间排列较紧密。对耳蜗连续切片的螺旋神经节细胞进行计数比较观察，叁者螺旋神经节细胞数量差异无统计学意义(P＞0.05)。在扫描电镜观察中，Smad4+／+和Smad4+／-小鼠耳蜗各回的叁排外毛细胞的纤毛发育正常，形态无异，排列有序。内毛细胞纤毛也呈现正常的形态特点。因为基因敲除后引起的耳蜗骨性发育畸形导致骨螺旋板和基底膜的形态异常，在对中回及底回的基底膜观察中我们无法从正常角度得到外毛细胞纤毛形态及排列特点的具体信息。但在此区域我们至少可以观察到内毛细胞静纤毛发育不良。在中回偏上区域，Smad4-／-小鼠内、外毛细胞的纤毛发育很差，并有静纤毛的融合、转位的出现，还可以观察到外毛细胞的点状缺失。因为Smad4-／-小鼠耳蜗骨螺旋板和基底膜的畸形，无法得到理想的角度进行扫描电镜下毛细胞的观察，我们利用全耳蜗基底膜铺片进行免疫染色观察毛细胞形态学并且对叁种基因型小鼠的毛细胞进行计数比较。首先我们先进行了基底膜的Hoechst染色，显示毛细胞的细胞核。Smad4+／+小鼠内、外毛细胞均未见缺失，内、外毛细胞核排列整齐有序。Smad4+／-小鼠内、外毛细胞偶见缺失，内、外毛细胞核排列尚整齐。Smad4-／-小鼠内、外毛细胞均可见散在的点状的缺失，毛细胞排列紊乱失序。在此基础上我们又对内、外毛细胞进行了计数，叁者的内、外毛细胞数量未见统计学差异(P＞0.05)。为了观察毛细胞的纤毛发育及排列情况，我们进行了Hoechst和Phalloidin双染。染色结果显示Smad4+／+和Smad4+／-小鼠内、外毛细胞纤毛形态正常，排列整齐；Smad4-／-小鼠内、外毛细胞发育不良，排列紊乱，而且由于基底膜畸形的缘故纤毛高低不一，相邻纤毛不在同一平面。全耳蜗铺片的MyosinⅥ和Neurofilament双染色可以显示毛细胞的胞体、神经突触以及与之相连的神经丝。Smad4-／-小鼠的内毛细胞除了表现出形态各异，排列紊乱以外，还表现出与之相连的神经突触膨大，排列不规则，神经纤维减少消失的特点。与之相反，Smad4+／+和Smad4+／-小鼠无论是细胞形态、神经突触形态及排列还是神经丝的形态数量都相对正常。对叁种基因型小鼠耳蜗进行透射电镜观察，我们发现Smad4-／-小鼠外毛细胞突触末梢与另外两基因型相比，数量明显减少。在存在外毛细胞突触的情况下突触也明显较后两者小。Smad4-／-小鼠内毛细胞突触末梢与后两者相比，传入神经突触明显空泡化，与内毛细胞接触界限不清晰，神经纤维紊乱。形态学的结果显示软骨细胞内Smad4基因的异常引起小鼠耳蜗的各种病理变化，这些都证明了Smad4基因是内耳发育所必需的基因之一。Smad4基因的功能缺陷可以导致感音神经性耳聋，Smad4基因是一种耳聋相关基因。特异性地在软骨细胞内对Smad4基因进行敲除却引起耳蜗感觉细胞发育的异常，在动物模型上提供了遗传学证据证明了在胚胎发育的早期耳周间充质细胞与感觉上皮之间的确存在着重要的信号相互作用，这种信号相互作用不仅仅是内耳骨性包囊形成所必需，更是耳蜗内感觉上皮发育为成熟的感觉细胞所必需的。
邓安春[3]2007年在《Smad4基因在小鼠内耳前庭发育中作用的初步研究》文中提出小鼠是研究哺乳动物内耳形态形成及细胞分化发育、遗传性内耳疾病的极佳动物。前庭是内耳的重要组成部分，其起源与耳蜗相同，发育早于耳蜗，出生时前庭发育基本完成。哺乳动物前庭感觉器官的发育过程中，有多达几十种基因的参与，它们在时间、空间上精细、准确地差异表达，并以此决定各感觉器官、感觉上皮的分化发育方向。TGF-β超家族成员BMP4及其下游调节基因Smad4对于内耳发育的作用可能比较关键，但BMP4/Smad4，尤其是Smad4在小鼠内耳前庭发育中究竟有何作用、多大作用，目前不清楚。基因敲除技术是研究基因功能的常用方法。敲基因动物实验发现，Smad4基因剔除纯合子小鼠在胚胎发育早期死亡，杂合子小鼠听力明显障碍，内耳畸形，但其不能完全反映Smad4的作用。因此，本课题组利用基于loxP—Cre系统的条件基因敲除技术，构建了软骨组织Smad4条件基因敲除小鼠动物模型。该动物模型可以在一定程度上反映Smad4在前庭发育中的作用。我们研究了该动物模型的前庭功能及前庭末梢器官病理形态改变，同时，对C57BL/6小鼠的前庭发育过程及该过程中BMP4/Smad4在内耳前庭分布的时空特征进行了初步研究，并结合实验结果，对Smad4可能影响前庭发育的机制进行了探讨。第一部分：Smad4条件基因敲出小鼠的前庭功能检测通过设计的一系列前庭功能检测实验对同窝成组的软骨组织Smad4条件基因敲除野生型、杂合子、纯合子小鼠的前庭功能进行了对比性评估。这些前庭功能检测方法包括：一般行为观察、空间姿势反射、游泳试验、前庭眼反射(VOR)、短声刺激前庭诱发肌源性电位(VEMP)等。结果没有发现软骨组织Smad4条件基因敲除小鼠出现行为、步态、空间姿势反射和游泳实验等前庭综合功能障碍；叁个基因型小鼠均能诱出眼震且相互之间没有差别；VEMP的潜伏期在叁个基因型组间无差异，与野生型和杂合子相比，纯合子小鼠VEMP的反应阈值明显增加。该研究显示，前庭功能系列检测结果一致，只有Smad4条件基因敲除纯合子小鼠的部分球囊功能受到一定程度的影响。第二部分：Smad4条件基因敲除小鼠前庭外周器官的病理形态变化该部分通过冰冻切片、半薄切片、超薄切片；甲苯胺蓝染色、HE染色；大体观察、普通光镜、激光扫描共聚焦显微镜、扫描电镜、透射电镜观察；Southern Blot、免疫荧光、免疫组织化学等技术方法对软骨组织Smad4条件基因敲除野生型、杂合子、纯合子小鼠的内耳前庭结构、病理变化情况进行了研究。结果发现：1．Southern Blot及免疫组化显示小鼠内耳前庭软骨囊里Smad4被有效剔除，而前庭感觉上皮里Smad4表达没有受到明显影响。2．纯合子小鼠体形、内耳颞骨体积明显小于野生型和杂合子，纯合子小鼠内耳前庭形态轮廓基本正常，局部畸形，半规管及半规管壶腹嵴、椭圆囊及斑、球囊及斑、内淋巴管和内淋巴囊均小于野生型和杂合子小鼠，其半规管走行与野生型和杂合子小鼠不同，但无明显畸形。3．纯合子小鼠后半规管壶腹嵴的副嵴明显粗大，副嵴与后半规管壶腹嵴间的距离变小；纯合子小鼠后半规管壶腹嵴偶可见到感觉上皮有空泡样变；叁个基因型小鼠未见其它病理改变。扫描电镜和透射电镜在叁个基因型小鼠的前庭均未发现病变。神经丝免疫荧光染色提示Smad4条件基因剔除小鼠前庭上皮里的初级前庭神经元末梢分布正常，其与毛细胞的联系正常。该研究提示，软骨组织Smad4条件基因敲除小鼠动物模型造模成功；Smad4条件基因敲除小鼠的内耳前庭形态轮廓基本正常但细节上有一定程度的畸形，纯合子小鼠前庭末梢感受器病理改变轻微。第叁部分：C57BL/6小鼠前庭末梢器官的形态发育及BMP4、Smad4在其各个阶段的表达该部分通过冰冻连续切片、HE染色及免疫组织化学染色后普通光镜观察、免疫荧光染色后激光扫描共聚焦显微镜观察等技术方法对C57BL/6小鼠内耳前庭的发育过程及发育过程中BMP4、Smad4的表达情况进行了研究。结果发现：1．小鼠前庭的发育较早、过程较短，E15时所有囊斑、壶腹嵴基本形成，所有壶腹嵴、囊斑里均出现MyosinⅥ阳性表达毛细胞，未见支持细胞表达MyosinⅥ。2。BMP4从E10开始，在间充质浓聚前就有表达；间充质一开始浓聚，BMP4在其中就有较丰富的表达；早期主要表达在前庭囊及前庭囊周围的间充质，在胚胎发育的后期，其在软骨囊及前庭上皮里有广泛阳性表达。3．Smad4在小鼠内耳前庭的表达情况与BMP4不一致，E10到E12的小鼠内耳Smad4表达阴性，E15时各个壶腹嵴、囊斑里才有较明显的Smad4表达，而内耳周围软骨囊到E16时才有明显的Smad4表达。该研究结果提示，E15是前庭毛细胞成熟的关键时期；BMP4与小鼠内耳前庭形态形成及毛细胞分化发育、功能形成有关；Smad4与BMP4的表达时空特征不同，Smad4在小鼠内耳前庭发育的早期作用并不关键，BMP4的信号转导可能还存在其它途径。通过上述研究，我们认为Smad4在小鼠内耳前庭发育的早期作用并不关键，但Smad4参与了发育后期的形态塑形和功能发育。
张继帅, 杨晓[4]2004年在《TGF-β超家族分子在软骨内成骨中的作用》文中研究表明转化生长因子 β(transforminggrowthfactor β ,TGF β)超家族分子包括TGF β、骨形态发生蛋白 (BMP)等30多个成员。它们在软骨组织分布广泛 ,在软骨内成骨的各个阶段皆具有重要功能。TGF β分子可以促进软骨细胞细胞外基质合成 ,抑制软骨细胞的肥大分化和矿化。BMP分子可以诱导间充质细胞分化为软骨细胞 ,促进合成细胞外基质 ,抑制软骨细胞的终末分化。另外 ,TGF β、BMP分子可以和IHH PTHrP信号通路相互作用协调软骨细胞分化 ,BMP和FGF分子相互拮抗控制软骨细胞增殖、IHH分子表达和软骨细胞的终末分化。但是 ,TGF β超家族分子在软骨内成骨中的详细作用机制仍需进一步的研究来阐明。
谭晓红[5]2004年在《成骨细胞特异性Smad4基因剔除导致小鼠早期发生骨质疏松》文中研究说明转化生长因子-β(TGF-β)超家族分子通过调节细胞的增殖、分化、移行和凋亡而在脊椎动物发育过程中起重要的作用。大量的TGF-β贮于骨基质之中，是骨骼发育和骨重建的重要调节者。Smad4是TGF-β信号的中心介导者，在胚胎期和成体的许多组织中广泛表达。完全剔除Smad4基因导致小鼠胚胎发育早期死亡，其在成骨细胞中的作用尚无明确报导。为了深入研究Smad4基因在成骨细胞增殖和分化过程中的作用，我们利用Cre-loxP系统构建了成骨细胞特异性Smad4基因剔除小鼠。成骨细胞特异性．Smad4基因剔除的纯合型小鼠出生时表型正常，从2周起生长比对照小鼠延迟，体型矮小，牙齿短小，钙化不良，在3周以后表现更加明显。青春期和成年纯合型小鼠的骨密度显着降低，特征为骨小梁减少，顶骨菲薄。16日龄小鼠可见破骨细胞数量减少，并随着小鼠的生长日趋明显。3周龄小鼠的生长板比对照小鼠缩窄，体内荧光标记提示骨形成减弱。体外细胞培养提示纯合型小鼠成骨细胞的分化并未受到明显的影响。分别用TGF-β1和BMP2处理成骨细胞，发现在成骨细胞中剔除Smad4基因阻断了这两条信号通路。原位杂交的结果显示纯合型小鼠骨组织中Runx2／Cbfa1和多种细胞外基质基因的表达下调，提示在成骨细胞中剔除Smad4基因影响了细胞外基质的沉积，导致骨形成下降，成骨细胞明显减少。另一方面，在成骨细胞中剔除Smad4基因也影响了破骨细胞的形成和分化，表现为破骨细胞数量减少，从而使骨吸收减弱。我们的实验结果证实在成骨细胞中剔除Smad4基因同时影响了骨形成和骨吸收，使小鼠在早期出现了骨质疏松的表型，揭示了Smad4基因在维持成骨细胞正常功能和骨量中具有重要作用。成骨细胞特异性Smad4基因剔除骨质疏松小鼠模型可用于深入研究Smad4介导的FGF-β信号通路在维持正常成骨细胞功能以及骨质疏松发生中的作用及其分子机制，并可用于骨质疏松治疗药物的筛选和治疗方案的评价。
翁土军[6]2009年在《利用成骨细胞特异性基因敲除小鼠模型研究Pten和Gab1在骨稳态过程中的功能》文中指出坚硬的骨骼能够支撑机体、保护内脏。骨的强度取决于骨量和骨的结构。骨骼是一个动态的、处于新陈代谢的组织——骨重建过程中破骨细胞不断吸收旧骨、成骨细胞不断形成新骨,成年机体通过骨吸收和骨形成的动态平衡维持骨量的稳态。骨重建是由破骨细胞、成骨细胞、骨细胞共同精确调节的动态过程,它们之间相互耦联使骨吸收和骨形成保持动态平衡。成骨细胞和破骨细胞的活性受到生长因子、细胞因子、激素和力学刺激等多种因素的调控。加强成骨细胞的基础研究,对于促进骨形成类药物的研发和骨代谢疾病的防治有重要意义。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)/AKT信号通路通过调节细胞的增殖、分化、迁移和凋亡而具有广泛的生物学效应。但是,PI3K/AKT信号通路在成骨细胞及骨稳态维持中的功能还缺乏足够的体内证据。本研究利用组织特异性条件基因敲除技术,探讨了能影响PI3K/AKT信号通路的两个分子Pten和Gab1基因在成骨细胞中的功能及其对骨代谢的调控。10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(Phosphatase and Tensin homolog deleted from chromosome 10,Pten)是一个重要的抑癌分子,它通过负向调控PI3K/AKT信号通路来影响细胞的生物学功能。在本研究中,我们基于Cre-LoxP系统获得了成骨细胞特异性Pten基因敲除小鼠,发现Pten基因敲除小鼠发生骨质硬化症。我们从影像学、组织学、细胞和分子水平研究了Pten基因在骨稳态维持中的功能,并分析了成骨细胞中Pten基因影响骨重建的可能机制。我们利用本室研制的骨钙素启动子指导的Cre重组酶转基因小鼠同Pten条件基因打靶小鼠交配,获得了成骨细胞特异性Pten基因敲除小鼠(Ptenflox/flox; OC-Cre)。检测4月龄小鼠股骨的骨密度,发现无论是雄性还是雌性Pten基因敲除小鼠比同窝同性别对照小鼠的骨密度明显升高。我们用μCT对4月龄小鼠股骨进行了扫描和叁维重建,股骨的纵向扫描图显示Pten基因敲除小鼠骨小梁体积增加,靠近膝关节侧松质骨叁维重建图显示Pten基因敲除后骨小梁增多变厚,横断面扫描发现Pten基因敲除后皮质骨增厚、骨髓腔变小。接着,我们对小鼠胫骨的骨重建进行了组织和细胞的骨形态计量分析。胫骨塑料切片Von Kossa染色显示,Pten基因敲除后骨小梁增加。骨计量结果显示,与对照小鼠相比Pten基因敲除小鼠骨体积、骨小梁厚度,成骨细胞数量均明显增加。体内钙黄绿素标记显示Pten基因敲除小鼠骨形成率(BFR/BS)和骨矿化率(MAR)较对照小鼠明显提高。这些结果显示Pten基因敲除导致骨形成增加。我们分离原代成骨细胞诱导培养,茜素红染色结果显示矿化结节增多。在前成骨细胞系干涉Pten基因,Westernblot结果显示AKT通路激活,前成骨细胞分化加快。接着我们用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定破骨细胞,骨计量结果显示Pten基因敲除小鼠破骨细胞数量(N.Oc/B.Pm)增加。荧光定量PCR结果显示,Pten基因敲除后破骨细胞的功能分子TRAP和组织蛋白酶K(CathK)的表达都明显升高。这些结果表明Pten基因敲除小鼠骨吸收增加。但是,小鼠血清ELISA分析结果显示耦联调控破骨细胞分化的OPG、RANKL没有明显变化,提示成骨细胞Pten基因缺失可能通过别的机制调节破骨细胞分化。荧光定量PCR结果显示,Pten基因敲除小鼠骨组织中单核细胞趋化因子(MCP-2、MCP-5、SDF-1)表达明显升高,提示成骨细胞Pten基因缺失可能通过增加趋化因子的表达招募更多的破骨细胞前体至骨微环境中发育为破骨细胞。Gab1(Grb2-associated binder 1)是一个锚定蛋白,能被多种酪氨酸激酶受体激活,主要通过PI3K/AKT和Ras/MAPK向下传递胞外多种生长因子、细胞因子的刺激。我们首次建立了成骨细胞特异性Gab1基因敲除小鼠(Gab1flox/flox; OC-Cre)模型,发现Gab1基因敲除小鼠发生骨质疏松。本研究通过影像学、组织形态计量、细胞和分子多层面分析证实Gab1基因在维持骨稳态过程中的重要作用,并用叁点弯曲力学实验证明Gab1基因敲除小鼠股骨生物力学性能下降。我们检测分析了2月龄和6.5月龄雄性小鼠的骨密度。与同窝对照相比,Gab1基因敲除小鼠的骨密度明显下降。软X线相片显示6.5月龄Gab1基因敲除小鼠椎骨、股骨的骨密度明显加少。μCT扫描和叁维重建的结果显示,Gab1基因敲除小鼠骨小梁减少、皮质骨变薄。我们对2月龄小鼠的骨形成和骨吸收进行了细致分析,发现Gab1基因敲除小鼠骨体积明显下降、成骨细胞数量和破骨细胞数量减少,体内钙黄绿素标记显示Gab1基因敲除小鼠骨形成率(BFR/BS)和骨矿化率(MAR)明显降低。这些结果表明Gab1基因敲除小鼠发生低转换率的骨质疏松。通过Gab1基因敲除小鼠原代成骨细胞的研究,发现Gab1基因敲除后成骨细胞矿化减少、凋亡增加、表达RANKL较少从而支持破骨细胞分化的能力减弱。前成骨细胞干涉Gab1基因,也证实Gab1表达下降的细胞矿化减少、凋亡增加。Gab1基因敲除的成骨细胞在IGF-1和insulin刺激时不同时间点p-AKT和p-ERK的水平较野生型明显降低,表明Gab1基因参与IGF-1和insulin对成骨细胞AKT和ERK的激活。综上所述,本研究揭示了能够正、负调控PI3K/AKT信号通路的两个分子Gab1和Pten在骨代谢调控和骨稳态维持中的生理功能。研制成功的Pten基因敲除导致骨质硬化症小鼠,以及Gab1基因敲除导致骨质疏松小鼠为进一步深入研究骨稳态维持的分子机制提供了新的实验动物模型。
参考文献：
[1]. 利用条件基因剔除技术研究Smad4基因在软骨内成骨过程中的功能[D]. 张继帅. 中国人民解放军军事医学科学院. 2004
[2]. 软骨细胞特异性Smad4条件基因敲除导致小鼠听力丧失和内耳发育畸形的相关研究[D]. 侯昭晖. 中国人民解放军军医进修学院. 2007
[3]. Smad4基因在小鼠内耳前庭发育中作用的初步研究[D]. 邓安春. 中国人民解放军军医进修学院. 2007
[4]. TGF-β超家族分子在软骨内成骨中的作用[J]. 张继帅, 杨晓. 军事医学科学院院刊. 2004
[5]. 成骨细胞特异性Smad4基因剔除导致小鼠早期发生骨质疏松[D]. 谭晓红. 中国人民解放军军事医学科学院. 2004
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