李均[1]2003年在《小鼠胚胎消化管上皮细胞凋亡相关蛋白的表达》文中研究表明目的 小鼠胚胎消化管形态发生主要在胚胎第11天～17天。细胞增殖和凋亡与胚胎消化管的形态发生关系十分密切。本课题拟通过观察凋亡相关蛋白P53，Bcl-2，Bax以及增殖细胞核抗原（PCNA）在胎鼠第11天～17天食管、胃、小肠、结肠上皮细胞内的表达，以探讨这些蛋白表达的时序和相互之间的关系，以及与消化管各段形态发生的关系。方法 雌、雄小鼠交配，取第11天～17天胎鼠，经固定、石蜡包埋、连续切片后，每间隔10张取一张贴片，做成间断连续切片，HE染色。光镜下观察间断连续切片，定位消化管食管、胃、小肠、结肠所在位置。根据定位，选出有食管、胃、小肠、结肠的切片，用免疫组织化学SABC法检测凋亡相关蛋白P53，Bcl-2，Bax以及增殖细胞核抗原（PCNA）在第11天～17天胎鼠食管、胃、小肠、结肠上皮细胞中的表达。图像分析系统测定P53，Bcl-2，Bax以及PCNA的表达强度，分析这些蛋白表达的时序和相互之间的关系，以及与四段消化管的形态发生的关系。结果 ① Bcl-2在第11天～17天胎鼠食管、胃、小肠、结肠上皮细胞中表达的峰值均在第11天～13天，第14天开始降低，第16天和17天仅有低水平表达。② P53在消化管四段上皮细胞中的表达峰值均在第11天～14天，第15天明显降低，第16和17天仅低水平<WP=6>表达。③ Bax在食管上皮细胞中的表达峰值为第11天，然后逐渐下降；胃和小肠上皮细胞中Bax的表达峰值均在第14天；结肠上皮细胞中Bax的表达峰值在第15天。④食管和胃上皮细胞中表达PCNA的峰值均在第11天，然后逐渐降低；小肠和结肠上皮细胞中表达PCNA的峰值分别在第14天和第15天。⑤ Bcl-2在胃、小肠、结肠上皮细胞表达峰值时间（第11天～13天）均在Bax表达峰值时间（分别为14天和15天）之前；Bax在小肠和结肠上皮细胞表达的表达峰值时间正是小肠和结肠细胞凋亡峰值出现的时间；P53在胎鼠胃、肠上皮细胞表达的峰值时间与Bcl-2表达的峰值时间一致，而与Bax表达峰值时间不一致。结论 ①Bax在胎鼠四段消化管上皮细胞中的表达有时序差异。②细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2在胚胎消化管各段发育中的表达结果表明： Bcl-2可能具有抑制胎鼠消化管上皮细胞凋亡的作用；Bax可能具有促进细胞凋亡的作用。③P53在胚胎消化管各段发育中的表达结果显示，P53与胎鼠消化管上皮细胞凋亡调控的关系不密切。④Bcl-2 及Bax在食管上皮细胞表达的峰值时间与其凋亡峰值时间基本一致，而在小肠和结肠上皮细胞表达的峰值与其凋亡峰值时间不一致。这表明参与胎鼠食管和肠上皮细胞凋亡调控的机制可能不完全相同。胎鼠消化管发育过程中上皮细胞凋亡的调控机制，可能依赖于多种凋亡蛋白间的相互作用。
张海英[2]2004年在《氯化甲基汞及氢化可的松对小鼠胚胎消化管上皮细胞凋亡及其相关蛋白表达的影响》文中研究表明目的 观察低剂量氯化甲基汞（MMC）及氢化可的松（HC）对小鼠胚胎消化管上皮细胞凋亡及其相关蛋白表达的影响，为预防消化管畸形提供理论依据。方法 体内实验：给E10.5d、E12.5d、E13.5d 的孕鼠一次性腹腔注射不同浓度的MMC液（1mg/kg, 2mg/kg, 4mg/kg），对照组给予相应体积的生理盐水，48h后取E12.5d胎鼠的食管近贲门段（E段），E14.5d十二指肠近幽门段（D段），E15.5d结肠近端段（C段）。体外实验：分别取E13.5d、E14.5d胎鼠的D段、C段，进行体外组织培养，培养液中加入不同浓度的MMC液（0.2ug/ml, 0.4ug/ml, 0.8ug/ml）或不同浓度的HC液（0.5ug/ml，1.0ug/ml，2.0ug/ml），对照组加入相应体积的DMEM/F12（1:1），培养24h后取出标本。体内、外实验所得标本，制成石蜡切片，部分切片做HE染色，体视学方法计数各段消化管上皮中<WP=7>的凋亡小体密度（DAB）；另一部分切片用免疫组化SABC法，观察凋亡相关蛋白Bcl-2, Bax, P53 及c-Fos的表达。体内实验同时记录胎仔体重、顶臀长及胎盘重，观察MMC对胎仔发育的影响。结果 ①体内实验除了E14.5d 1mg/kg MMC组与2mg/kg MMC组胎仔的体重与对照组间的差异无统计学意义外，其它各实验组胎仔的体重均较对照组轻，P﹤0.05；E12.5d实验组胎仔的体长均较对照组短，P﹤0.05。②体内和体外各实验组胎鼠消化管上皮内的DAB值均较对照组高，P﹤0.05，无论是MMC组还是HC组，DAB值均与剂量呈正相关，P﹤0.01。③E段的体内实验结果为：各实验组Bcl-2在胎鼠食管上皮细胞中的表达均较对照组低，P﹤0.05，并与MMC的剂量呈明显负相关，P﹤0.01；而Bax、P53及c-Fos的表达则增加，P﹤0.05，并与MMC的剂量呈明显正相关，P﹤0.01。④D、C段的体内、外实验结果为：无论是MMC组还是HC组，各实验组Bcl-2在胎鼠肠上皮中的表达均较对照组低，P﹤0.05，且与MMC或HC的剂量呈负相关，P﹤0.01；Bax及c-Fos的表达则增高，P﹤0.05，且与MMC或HC的剂量呈正相关，P﹤0.01；MMC各实验组P53的表达均高于对照组，P﹤0.01，且与MMC的剂量呈明显正相关，P﹤0.01，但在HC各组其表达强度的差异无统计学意义。结论 ①MMC可抑制胎仔体重的增长，MMC对E12.5d胎仔体长的抑制作用可能与该期胚胎对MMC的毒性更为敏感有关。②MMC可使胎鼠食管及肠上皮内的DAB值增加，同时伴有凋亡相关蛋白Bcl-2<WP=8>表达的降低，以及Bax、P53及c-Fos表达的升高，且呈明显的剂量-反应相关性。表明MMC可能是通过降低Bcl-2的表达，增加Bax、P53及c-Fos的表达来促进胎鼠消化管上皮细胞凋亡的，其促凋亡作用可能是一种P53依赖性机制，并涉及多种凋亡相关蛋白间的相互作用。③HC可使胎鼠肠上皮内的凋亡小体数增加，同时伴有凋亡相关蛋白Bcl-2表达的降低，Bax及c-Fos表达的增高，且存在剂量-反应关系。表明HC具有促进胎鼠肠上皮细胞凋亡的作用，Bcl-2、Bax及c-Fos等凋亡相关蛋白可能参与了其促细胞凋亡的调控；P53的表达在HC各组间则未见差异，提示P53与介导HC促细胞凋亡关系不密切，故HC可能是通过P53非依赖性机制来促进胎鼠肠上皮细胞的凋亡。
汪维伟, 李均, 王正义[3]2005年在《小鼠胚胎食管和肠上皮细胞增殖与凋亡》文中研究表明目的:研究小鼠胚胎食管和肠上皮细胞的增殖与凋亡。方法:体视学方法观测E1117dICR胎鼠食管、十二指肠和结肠上皮的增殖与凋亡,免疫组化法显示Bcl2、P53、Bax在叁段消化管上皮中的表达。结果:叁段消化管的上皮细胞密度与凋亡小体密度和分裂细胞密度间未见一致的相关性。凋亡小体分布食管上皮各层,而肠上皮中主要在游离面。Bcl2和p53在食管、小肠、结肠上皮细胞中表达峰值分别在E11d～13d和E11d～14d,Bax的表达峰值分别为E11d、E14d、E15d。结论:上皮细胞密度对上皮细胞分裂和凋亡的影响不明显。食管和肠上皮中凋亡小体分布的不同可能与形态发生方式不同有关。Bax和Bcl2可能分别具有促进和抑制肠上皮细胞凋亡的作用;p53与上皮细胞凋亡的关系不密切。
林雪梅, 张海英, 姜蓉, 汪维伟[4]2007年在《低剂量甲基汞促进鼠胚肠上皮细胞凋亡及相关机制的体内实验》文中研究指明目的探讨低剂量氯化甲基汞(methyl-mercury chloride,MMC)对小鼠胚胎肠上皮细胞凋亡的影响及相关机制。方法给E12.5d、E13.5d孕鼠一次性腹腔注射MMC液(0、1、2、4mg/kg),48h后取十二指肠、结肠。所获标本均制成石蜡切片,部分经HE染色,体视学法计数肠上皮凋亡小体;其余切片用于免疫组化染色,半定量分析凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及即刻早期基因c-fos的表达。结果①各实验组凋亡小体数均高于对照组(P<0.05),与MMC剂量呈正相关(P<0.01)。②Bcl-2在各组上皮中的表达均低于对照组(P<0.05),与MMC的剂量呈负相关(P<0.01);而Bax及c-fos的表达均强于对照组(P<0.05),与MMC的剂量呈正相关(P<0.01)。结论低剂量MMC在体内可促进胎鼠肠上皮细胞凋亡,可能是一种通过下调Bcl-2表达,上调Bax及c-fos表达的机制。
佚名[5]2003年在《西南叁省一市第四届解剖学术会议论文摘要》文中研究指明1 .胚胎胰岛细胞发育相关基因表达的研究 杨开明 羊惠君 梅 妍 周红鹰 蒋吉英 李 华 四川大学基础与法医学院人体解剖学教研室 成都 6 10 0 4 1 近几年 ,糖尿病的发病率不断上升 ,而传统的治疗方法 ,其疗效并不理想 ,干细胞作为一类具有多
牛海静[6]2009年在《转录因子Sox2对胃粘膜肠化生表型转变作用的研究》文中研究表明目的:胃粘膜肠上皮化生(Intestinal metaplasia, IM)是肠型胃癌发病机制Correa's级联反应的一个中间步骤,一般被认为是一种癌前病变,尽管这个问题仍然存在争议。胃粘膜IM发生的机制还没有被详细阐明。如果我们想要预防肿瘤从这些病变中发生,就有必要研究控制这个过程的因子。研究表明干细胞及其后代从胃表型转变为肠表型的过程的启动常常是由转录因子控制的。已有一些关于胃粘膜IM中肠转录因子Cdx1和Cdx2表达及功能方面的研究,但控制胃表型的因子还知之甚少,一个候选者就是含有Sry样HMG盒子的转录因子家族成员之一Sox2基因。我们设计了以下实验来阐明转录因子Cdx2和Sox2是否以及如何调控胃粘膜IM的表型转变。方法:1.使用免疫组化方法检测80例病理学诊断为胃炎、轻度IM、中度IM和重度IM的石蜡包埋胃粘膜标本中SOX2和CDX2蛋白的表达;使用实时荧光定量PCR方法检测40例病理学诊断为胃炎、轻度IM和中重度IM的胃镜活检标本中Sox2和Cdx2mRNA表达。2.使用甲基化特异性PCR检测40例病理学诊断为胃炎、轻度IM和中重度IM的内镜活检胃粘膜组织的启动子区甲基化状态。3.将pcDNA3.1 /Cdx2质粒和Sox2siRNAs分别及共同转染到人胃上皮细胞系GES-1中分别使Cdx2上调和Sox2下调。RT-PCR检测Muc2、Sox2和Cdx2 mRNA的表达改变。将肠杯状细胞标志物Muc2 mRNA的出现,视为完成肠型转化。结果:1. SOX2和CDX2蛋白分别定位于正常胃和肠上皮细胞胞核。胃炎、轻度IM组、中度IM组和重度IM组中SOX2和CDX2蛋白阳性率分别为94.4 % vs5.6%、75%vs50%、23.5%vs85.7%、9.5%vs90.5%,差异有显着性(P<0.05)。在化生腺体中有SOX2蛋白的减少和CDX2蛋白的异位表达。2.胃炎组、轻度IM组、中重度IM组Sox2和Cdx2mRNA水平分别为0.5778±0.0778 vs 0.0517±0.0218、0.1496±0.0384 vs 0.1402±0.0300、0.1131±0.0384vs 0.3453±0.0537,差异有显着性(P<0.05)。随着IM进展,从胃炎、轻度IM到中重度IM中Sox2mRNA逐渐减少,而Cdx2逐渐被上调,二者呈逆相关(r<0)。3.Sox2和Cdx2的启动子甲基化分别出现在33.3%和83%的胃炎,56.25%和62.5%的轻度IM, 83.33%和25%的中重度IM中,差异有显着性(P<0.05)。Sox2和Cdx2 mRNA表达与其启动子区甲基化状态逆相关(r<0)。4.人胃上皮细胞GES-1中,pcDNA3.1 /Cdx2和Sox2siRNAs分别显着上调了Cdx2和下调了Sox2。下调Sox2可以导致Muc2和Cdx2表达上调;而上调Cdx2能够上调Muc2并下调Sox2;下调Sox2和上调Cdx2联合的作用强于二者各自单独的作用。说明肠转录因子Cdx2和胃转录因子Sox2有相互负调控作用,都在胃粘膜IM的形成中起重要作用。结论:1.随着胃IM的进展,有Sox2的表达下调和Cdx2的异位表达。2.表观遗传学机制,尤其是DNA甲基化可能在Sox2和Cdx2的转录调节中起重要作用。3.在胃IM进展中,胃转录因子Sox2和(或)肠转录因子Cdx2在启动胃表型向肠表型转化中都起了重要作用。论文二特异性小干扰RNA体外抑制人胃癌细胞IGF-ⅠR表达的研究目的：胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，虽然我国近年其发病率有所下降，但其死亡率仍具各类恶性肿瘤死亡之首。从基因水平上研究胃癌发展的分子学机制可为临床治疗和预防提供理论指导，因而成为当前研究的热点之一。我们观察了特异的siRNAs对人胃癌MGC803细胞IGF-ⅠR基因表达的抑制作用，研究干扰下调IGF-ⅠR对体外培养的胃癌细胞增殖和凋亡的影响。方法：设计并体外合成2条靶向IGF-ⅠR的siRNAs，脂质体法瞬时转染体外培养的MGC803细胞，转染48h后以Western blot法检测细胞IGF-ⅠR蛋白的水平，MTT法检测细胞活力，细胞计数并描记生长曲线，以流式细胞仪(FCM)检测细胞早期凋亡(Annexin V-FITC/PI法)。结果：转染后48h，Western blot检测显示干扰组(siRNA_2低剂量组、siRNA_2高剂量组、siRNA_1组)MGC803细胞IGF-ⅠR蛋白抑制率分别为64．41％±4．11％、74．14％±6．15％、89．8％±4．10％)；转染后第2～5天细胞活力逐渐减少，分别达对照组的49．9％±1．2％、45．9％±4．4％、39．1％±5．1％、29％±4．O％，同期生长曲线显示细胞数分别为对照组的65．58％±4．89％、55．59％±0．82％、44．18％±3．17％、21．15％±1．1％；但FCM检测各组细胞的早期凋亡百分比均<5％，各组之间的凋亡百分比差异未达统计学意义。结论：特异的siRNAs可显着抑制MGC803细胞中的IGF-ⅠR基因的表达，细胞的分裂增殖明显减少，但凋亡没有明显增加。
佚名[7]2015年在《中国解剖学会第十四届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会暨第十一届组织学与胚胎学教学与科研技术研讨会论文汇编》文中提出2015年7月25日—27日山东潍坊1.萝卜硫素对糖尿病视网膜病变的保护作用及相关机制研究任翔刘俊丽张成鸿孔力大连医科大学组织胚胎学教研室大连116044糖尿病视网膜病变(DR)是一种由高血糖引起氧化应激所致的神经退行性病变。硫氧还蛋白(Trx)通过其二硫化物还原酶与过氧化物还原酶活性,在体内各系统中行使多种氧化还原功能。萝卜硫素(SF)是西兰花等十字花科蔬菜中的提取物,前期研究发现它可通过上调Trx水平对Tubby基因变异小鼠视网膜感光细胞退变起到保护作用。我们在前期研究的基础上,进一步探讨了SF对
徐晨明[8]2008年在《人胚胎干细胞建系及线粒体和细胞骨架的分布模式与胚胎干细胞分化关系的研究》文中指出目的收集临床IVF剩余的正常受精胚胎、异常受精胚胎和植入前遗传学诊断异常的胚胎进行囊胚培养,分离培养新的正常hESCs以及疾病模型hESCs;研究早期胚胎、干细胞的自发分化和诱导分化过程中细胞骨架和线粒体的形成和分布特征,分析细胞骨架的变化以及线粒体数量形态的变化与胚胎干细胞分化的关系。材料和方法hESCs系的建立:胚胎来源于浙江大学附属妇产科医院生殖中心,患者签署了知情同意书后,使用其没有冻存价值的正常受精的废弃胚胎以及0PN,1PN,3PN和植入前遗传学诊断为异常的废弃胚胎。选择受精后5-7天内发育到扩张囊胚(expandedblastoeyst)的胚胎,用于内细胞团(Inner cell mass,ICM)的分离。使用机械法、免疫外科、全囊胚贴壁法分离内细胞团。随后进行ICM增殖物的离散、传代和扩增,冻存hESCs,并进行鉴定。hESCs的鉴定:碱性磷酸酶活性染色、对细胞是否表达干细胞标志物SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81,OCT-4进行免疫荧光鉴定、采用RT-PCR检测hESCs中干细胞特异性基因Nanog,TDGF1,Sox2,EBAF,Thy-1,FGF4,Rex1等7个基因的表达情况,进行hESCs核型分析以及hESCs的叁胚层体外分化实验。线粒体和细胞骨架的动态观察:超排卵后收集不同发育阶段的卵母细胞和胚胎;常规hESCs培养,进行类胚体途径的ES自发分化;常规小鼠胚胎干细胞的培养和增殖与传代。参照Huang(2006)的RA诱导进行mES定向分化。常规免疫荧光技术进行线粒体(Mitotrack Red)和细胞骨架(FITC conjugated mouse anti-β-tubulin)的荧光染色。透射电镜的切片染色按照常规方法进行。结果1.从正常受精胚胎中分离了两株的hESCs分别被命名为ZJ01和ZJ02,从非正常受精胚胎分离了四株hESCs分别被命名为ZJ03、ZJ04、ZJ05以及ZJ06。所有干细胞呈典型的集落样生长,集落边缘光滑清晰,细胞排列紧密,细胞具有较高的核质比和2-3个明显的核仁;对干细胞进行鉴定,发现ZJ01,ZJ02,ZJ03,ZJ04干细胞的碱性磷酸酶活性染色强阳性,且均表达干细胞标志物SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81,OCT-4;RT-PCR检测表明,这两株干细胞表达干细胞特异性基因Nanog,TDGF1,Sox2,EBAF,Thy-1,FGF4和Rex1;核型分析结果表明,ZJ01,ZJ02,ZJ04干细胞系为正常的二倍体,ZJ03为4号染色体叁体的干细胞,可作为疾病(染色体病)模型干细胞;体外分化实验证明,上述干细胞系具有向叁胚层分化能力。2.从合子到八细胞期,卵裂球内线粒体基本呈现均匀分布,没有极化现象;从桑椹胚到囊胚,卵裂球内细胞骨架结构明显,且线粒体的分布也从原来的均匀分布到极化分布;4.未分化的干细胞中,微管蛋白及微管均均匀分布,干细胞开始发生分化后,微管蛋白的表达量及微管数量显着增加,随着分化程度的深入,微管结构出现;未分化的干细胞中,线粒体亦均匀分布于细胞质中,发生分化后,线粒体出现极化分布现象,明显分布在细胞的一端;类胚体中微管结构明显,线粒体集中分布在微管周围;RA诱导后,分化细胞的类型呈现不同的微管和线粒体的分布特性。结论1.成功构建两株正常hESCs和四株异常受精的疾病模型hESCs。2.在干细胞以及早期胚胎细胞分化开始前,细胞质足够的细胞骨架蛋白以及细胞骨架结构的形成是细胞分化的必要前提;在不同胚层的分化过程中,细胞骨架分布模式具有特殊性,细胞骨架是细胞形态的决定因素,可能决定细胞分化方向,线粒体的分布模式能推断细胞分化的方向。
毛宇彬[9]2007年在《转录因子Dermol、Twist在多种人类肿瘤中的功能分析与甲基化调控机制》文中研究表明第一部分Dermol和Twist在人类卵巢癌、乳腺癌、胃癌中的表达及功能分析高度保守的转录因子Dermol和Twist都属于碱性Helix-loop-helix(b-HLH)蛋白家族,它们具有结构的高度同源性,功能的部分相似性。b-HLH家族蛋白在细胞分化、胚胎发育的调控中具有重要作用,同时广泛参与多种组织的形成,如:骨、肌肉、神经、心脏、造血组织等。最新研究成果表明Twist能促进细胞存活,抑制非恶性细胞分化,诱导非恶性细胞肿瘤发生,促进恶性细胞肿瘤形成、发展和转移,也参与多种难治性肿瘤抗药性(破坏微管药物如taxol和vincristine)的形成。近来发现,乳腺癌、恶性黑色素瘤以及其他肿瘤中Twist过表达可作为预后不良的一个指标,许多证据表明Twist蛋白也参与调节细胞凋亡。在人类肿瘤中Twist活化可能具有非常重要的临床意义,Twist很可能作为指导诊断、判断预后的指标,并可作为肿瘤生物治疗的一个新靶点。作为twist基因的高度同源类似物,dermol基因分布更为广泛,表达强度在不同组织存在很大差别,但是它在发育和肿瘤发展过程中的作用尚不清楚。本论文中,我们比较了Dermol和Twist在多种人类肿瘤中的作用,分析了Dermol在卵巢癌生长、存活、侵袭以及转移中的功能。我们首先采用免疫组化(SP法)研究Dermol、Twist在人类卵巢癌、乳腺癌、胃癌中的表达定位状况,探讨它们在不同类型肿瘤中的表达特点。结果表明在不同种类的人类肿瘤中Dermol与Twist蛋白表达模式不同。我们首次发现:Dermol在卵巢癌中表达明显增加,主要分布在细胞质和细胞膜上;在乳腺癌中的表达也显着增高,主要分布在细胞质中,细胞核也有一定程度表达;而在胃癌组织中,与非癌胃组织、癌旁胃粘膜组织相比较,表达明显降低。进而证明Twist与卵巢癌之间没有相关性;在乳腺癌中表达增加,主要分布在细胞核中;在非癌胃组织、癌旁组织及胃癌组织中虽然均有一定表达,主要分布在细胞质中,但未见存在显着性差异。提示Dermol、Twist蛋白在不同的正常组织或非癌组织所发挥的作用不同,在不同肿瘤中亦有不同的功能。鉴于Dermol在人类卵巢癌中表达增加,我们构建了dermol基因在真核细胞的表达载体,筛选出稳定超量表达dermol(转基因)的卵巢癌HO-8910细胞株,通过体外研究过表达Dermol所产生的形态学变化、亚细胞定位以及对细胞功能的影响,并利用动物模型研究体内过表达Dermol的功能变化,以揭示Dermol与表型性状间的关系。结果表明,外源Dermol蛋白表达在细胞核内,Dermol蛋白过表达对细胞增殖速度、细胞周期分布影响不大。但是与人类卵巢癌中Dermol升高的结果一致,动物实验表明Dermol的确能促进肿瘤生长、转移,我们进而对其机制进行进一步研究,发现缺氧压力胁迫作用下卵巢癌细胞发生凋亡,Dermol可能至少部分通过激活PI-3K-Akt通路,增加Bcl-2、减少Bad,以对抗缺氧诱导的卵巢癌细胞凋亡,从而利于卵巢癌存活,利于皮下肿瘤的生长。稳定过表达Dermol的卵巢癌细胞粘附能力不变,非锚定依赖能力增加,并且细胞出现极性,由上皮样向成纤维梭形形态转变,很可能通过促进EMT转变,使间叶细胞标记物Vimentin、fibronectin表达增加,增加迁移、侵袭转移能力。本研究发现Dermol、Twist蛋白在乳腺癌中表达均明显增加,有一定的相似作用;而在卵巢癌、胃癌中所起作用不同。Dermol一方面可能至少部分通过激活PI-3K-Akt通路对抗缺氧诱导的卵巢癌细胞凋亡,从而利于卵巢癌存活、生长,另一方面很可能通过促进EMT转变,增加癌细胞迁移、侵袭、转移能力,在卵巢癌中发挥促癌作用。在胃癌中的作用以及机制尚有待研究。对于Dermol功能的研究,将有助于我们对同一基因在不同肿瘤中差异作用的认识,有助于对卵巢肿瘤的发生、发展机制的进一步了解,同时对预防、早期诊断、判断预后、治疗恶性肿瘤均具有重要指导意义。第二部分Dermol和twist基因在肿瘤细胞中的甲基化调控DNA甲基化是一种非常重要的表观遗传机制,与肿瘤的发生和演进有密切联系。甲基化通过直接或间接地影响调控因子与DNA的相互作用以及染色质结构而抑制转录,而不涉及有关基因DNA序列的改变,并可通过减数分裂遗传。多种基因启动子甲基化状态的改变在肿瘤细胞是一种常见特点,并且往往发生在肿瘤形成早期,破坏基因功能的突变通常在基因组位置的比较大范围内存在差异,而启动子CpG岛甲基化的位置对于某个基因却是不变的。由于采用非常少量的DNA即可检测出特异性DNA甲基化这一稳定的分子变化,近年研究中常应用特异性的DNA甲基化检测发生已知遗传突变的基因,作为肿瘤早期诊断的生物标记物。利用甲基化机理可以阐明一个或多个调控系统异常是如何导致肿瘤的,并且DNA甲基化的变化是可逆的,研究特定基因DNA甲基化将有助于恶性肿瘤分类,肿瘤基因治疗的开发,指导临床用药,帮助判断预后。Dermol和twist属于Helix-loop-helix(b-HLH)蛋白家族中的一对转录因子,在细胞分化、胚胎发育的调控中具有重要作用,我们第一部分的研究结果表明,在不同类型肿瘤中Twist和Dermol有不同的表达方式,它们的异常表达有助于肿瘤的发生,而DNA甲基化模式可反映基因的表达状态。已有研究证实twist是乳腺癌中高甲基化的基因,慢性淋巴细胞白血病患者中dermol基因启动子上游调控区域的甲基化抑制该基因的表达。由于在肿瘤中DNA甲基化调控具有肿瘤组织和细胞特异性,且不同肿瘤组织中高甲基化的基因不同,肿瘤细胞中DNA甲基化型式的变化常用于研究基因表达调节的内在机制,我们研究并比较了twist(twist1与dermol(twist2)DNA的5'CpG岛甲基化型式和基因表达状态。我们先对dermol启动子附近1000bp的序列进行分析,基于对所研究基因富含GC这一特点的认识,我们考虑到启动子DNA甲基化参与表达调控的可能性。为研究这一新的癌相关基因的表观调控机制,我们采用亚硫酸盐PCR(Bisulfite PCR,BS-PCR),亚硫酸盐基因组测序,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)分析包括白血病、乳腺癌、肺癌、宫颈癌等多种肿瘤细胞株Dermol基因启动子区域甲基化图谱。先选择有甲基化可能性的CG岛设计BS-PCR引物,将经亚硫酸盐修饰的CpG岛进行PCR扩增,得到450bp的片段。先用特异性甲基化敏感位点酶酶切分析BS-PCR产物,初筛发现不同细胞株中所研究基因启动子区域均有不同甲基化片段存在;随后对BS-PCR扩增产物进行亚硫酸盐基因组测序分析,找到所扩增基因启动子局部区域在不同细胞株中的甲基化图谱;然后根据基因组测序结果设计出用于MSP的2对M、U引物以区分甲基化和非甲基化状态,同时对MSP产物进行亚硫酸盐基因组测序以验证MSP结果的正确性。本研究共检测14株人类肿瘤细胞(HL60,Molm14,MV4-11,RS4:11,HepG2,Huh7,Skhep1,BT-549,MDM-BA231,MCF7,skBr3,H358,H1299以及Hela)dermol基因的甲基化状态,利用RT-PCR研究这些细胞株中dermol基因的表达水平。由于dermol与twist结构的同源性以及功能的重迭性,同时对twist的甲基化图谱以及基因表达情况进行了比较研究。应用BSP我们发现不同肿瘤细胞株中dermol基因启动子CpG位点甲基化型式不同,MSP分析提示dermol在12/14(85.71%)细胞株中为部分甲基化,在2/14(14.29%)细胞株中为完全甲基化,RT-PCR表明dermol mRNA在绝大多数肿瘤细胞株中(12/14,85.71%)有不同程度的阳性表达。在这些肿瘤细胞株中Dermol启动子的普遍甲基化提示这一基因存在甲基化的表观调控方式。应用MSP发现所研究的肿瘤细胞株中twist启动子有7/14(50%)为完全甲基化,4/14(28.57%)为部分甲基化,1/14(7.14%)为未甲基化,但是有2株细胞未能检测出信号。RT-PCR提示超过一半的肿瘤细胞株(57.14%)不表达twist mRNA,但有4/14(28.57%)twist有显着表达,2/14(14.29%)表达低水平的twist mRNA。综上所述,dermolmRNA在绝大多数肿瘤细胞株中有不同程度的阳性表达,至少部分通过甲基化调控基因的表达,且甲基化调控方式普遍存在于多种不同类型的肿瘤中;twist表达方式与dermol不同,在半数肿瘤细胞株不表达,该基因的沉默在一定程度上是通过甲基化调控的,甲基化调控方式同样普遍存在于多种不同类型的肿瘤中,人类肿瘤细胞中dermol与twist mRNA表达的调节均有基因启动子甲基化调控的参与。探讨转录因子twist和dermolDNA甲基化调控机制,有助于全面了解各种肿瘤的甲基化模式,有助于阐明致癌机理,对肿瘤分型、预后判断、早期诊断、肿瘤的基因治疗提供一定的理论基础。
张发仁[10]2008年在《Fascin、Ezrin及NGAL/NGALR在正常胚胎和成人组织中的表达模式》文中指出Fascin是一种细胞骨架肌动蛋白结合蛋白。Ezrin是一种细胞骨架连接蛋白,属于ERM (Ezrin-Radixin-Moesin)家族。NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)是一种分泌蛋白,属于Lipocalin家族,其功能也可能与细胞骨架相关。近10年来,包括我们课题组的系列研究在内的大量实验结果表明,Fascin、Ezrin和NGAL等在乳腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、食管癌和甲状腺肿瘤等多种肿瘤组织中异常表达,与肿瘤细胞的移动侵袭等恶性特征行为表现密切相关。在此基础上,本论文拟研究Fascin、Ezrin和NGAL等细胞骨架相关蛋白,以及NGAL受体NGALR(NGAL Receptor),在人类胚胎以及成人正常组织中的表达模式,以期与在肿瘤组织中的表达情况进行对比,为深入揭示它们的功能提供资料。本文主要采用组织芯片和免疫组织化学实验技术手段,对4-22周胎龄的胚胎和成人组织样本中Fascin、Ezrin、NGAL和NGALR等的表达情况进行了检测。检测结果:1)Fascin的表达,4周胎龄神经管上皮即为阳性,8-12周胎龄小脑皮质和肠管呈现强阳性,胚胎后期与成人阶段的小脑蒲肯野细胞层以及肠腺上皮为阴性;8-12周胎龄肾上腺皮质与髓质强阳性,然而在出生后各期外周球状带阳性,向内逐渐减弱,至髓质完全阴性;淋巴组织中的树突状细胞、复层鳞状上皮的基底层细胞、间充质细胞、血管内皮细胞以及神经细胞(不包括胚胎后期与成人阶段的小脑蒲肯野细胞)等在生长发育过程中均呈现显着阳性,而在正常的胆管、结肠、胰腺和胃部的单层柱状上皮为阴性。2)Ezrin的表达,在胃肠道中广泛阳性,6-8周胎龄主要位于肠管上皮,胚胎后期和成人阶段的胃肠腺上皮细胞刷状缘和胃壁细胞显着阳性;神经中仅4周胎龄神经管上皮阳性;8-12周胎龄肾上腺皮质和髓质强阳性,而后期发育成熟时由外向内逐渐增强,外周球状带弱阳性,网状带强阳性,但髓质阴性;肾脏、脾、淋巴结和复层鳞状上皮阳性,而肺、肝、心脏和血管阴性。3) NGAL的表达,8-12周胎龄肾上腺髓质和肺腺泡上皮阳性,而胚胎后期和出生后各期阴性;4周胎龄神经管阴性,后期生长发育过程中大脑皮层神经细胞尤其是星形细胞阳性;小脑蒲肯野细胞层6月胎龄阴性,出生后各期阳性;脾脏髓质富含中性粒细胞部位、肾小管上皮细胞和胃肠道某些腺上皮细胞阳性,而正常心脏和肝脏阴性。4)NGALR的表达,小脑蒲肯野细胞层6月胎龄阴性,出生后各期阳性;肾小管上皮细胞和胃肠道某些腺上皮细胞阳性,而正常心脏和肝脏阴性。上述结果表明,Fascin、Ezrin、NGAL和NGALR等在人类胚胎以及成人正常组织中的表达具有一定的时间特异性和组织特异性。
参考文献：
[1]. 小鼠胚胎消化管上皮细胞凋亡相关蛋白的表达[D]. 李均. 重庆医科大学. 2003
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[4]. 低剂量甲基汞促进鼠胚肠上皮细胞凋亡及相关机制的体内实验[J]. 林雪梅, 张海英, 姜蓉, 汪维伟. 第叁军医大学学报. 2007
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[9]. 转录因子Dermol、Twist在多种人类肿瘤中的功能分析与甲基化调控机制[D]. 毛宇彬. 厦门大学. 2007
[10]. Fascin、Ezrin及NGAL/NGALR在正常胚胎和成人组织中的表达模式[D]. 张发仁. 汕头大学. 2008
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