陆俊佳[1]2013年在《TIE2基因启动子及内皮抑素基因表达载体的构建》文中研究指明目的：克隆小鼠TIE2基因的启动子并分析其转录活性。方法：设计并合成引物,以小鼠肝脏组织DNA为模板,巢式PCR扩增小鼠TIE2基因启动子区。将扩增获得的系列截短片段克隆入荧光素酶(Luc)报告基因表达载体pGL3-Basic中,构建系列启动子区转录活性报告质粒pGL3-TIE2-Luco报告质粒与内参质粒共转染SVEC4-10、NIH3T3、 HUVEC及NIT-1细胞系,48小时后收获细胞检测双荧光素酶的表达情况。结果：构建的pGL3-TIE2-Luc系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA测序分析都显示正确；转染四种细胞系后进行双荧光素酶活性检测的结果表明,TIE2基因启动子区域(-2056～+1)具有较强的转录活性。结论：成功构建小鼠TIE2基因启动子报告质粒,证实TIE2基因上游区域(-2056～+1)具有较强的启动子活性。目的：构建小鼠及人类的内皮抑素基因的原核表达载体pet41b(+)一endostat in.方法：设计并合成引物,以重组质粒pUC57-endostatin为模板,PCR扩增获得小鼠及人类的内皮抑素基因。将扩增获得小鼠及人类的内皮抑素基因分别插入原核表达载体pet41b(+)中,构建小鼠及人类的内皮抑素基因的原核表达载体pet41b(+)-endostatin.通过转化大肠杆菌BL21(DE3)获得小鼠及人类的内皮抑素基因的原核表达载体pet4lb(+)一endostatin的大量扩增,进行菌落PCR,挑选阳性菌液提取质粒进行酶切检测,并进行测序分析。结果：构建的小鼠及人类的内皮抑素基因的原核表达载体pet4lb(+)一endostat in经酶切鉴定及测序分析都显示正确。结论：成功的构建了小鼠及人类的内皮抑素基因的原核表达载体pet4lb (+)-endostatin.
孙剑[2]2006年在《不相容双质粒共表达人内皮抑素及简化人纤溶酶原饼环区5》文中进行了进一步梳理目的构建人内皮抑素(human Endostatin)原核表达质粒pET28a/hES，并与简化人纤溶酶原饼环区(predigested human PlasminogenKringle5,predhPK-5)在大肠杆菌中实现共表达。方法以RT-PCR法从人肝癌组织中扩增人内皮抑素基因，利用基因克隆技术构建原核表达质粒pET28a/hES并与pGEX-1λT/predhPK-5共同转化E.coliBL21(DE3)诱导表达。结果成功构建pET28a/hES，其与pGEX-1λT/predhPK-5的共转化子在双抗生素压力下可以共存，并在E.coH BL21(DE3)中成功共表达了人内皮抑素及简化的人纤溶酶原饼环区5。结论构建了人内皮抑素原核表达质粒pET28a/hES，为进一步研究打下基础。利用不相容质粒共表达了人内皮抑素及简化人纤溶酶原饼环区5，对基因共表达方法作了有益探索，验证了不相容质粒共表达方法的可行性。
林志雄, 杨丽娟, 黄强[3]2005年在《内皮抑素和反义/正义内皮细胞生长因子cDNA真核共表达载体构建与表达》文中进行了进一步梳理目的构建大鼠内皮抑素cDNA和反义/正义血管内皮细胞生长因子(VEGF)cDNA真核共表达载体,并在C6胶质瘤细胞上获得表达。方法以1d龄大鼠脑组织总RNA为模板,利用RT-PCR法从中扩增出内皮抑素和反义/正义VEGF的cDNA,并将获得的目的cDNA依次重组入真核表达载体pBudCE4.1上。重组子经酶切、PCR及测序鉴定后脂质体法转染C6细胞,zeocin抗性筛选。Western-blot方法、免疫细胞化学法及MTT法鉴定含内皮抑素的阳性克隆子;ELISA方法检测各阳性克隆子上清液中VEGF含量。结果构建带有目的基因的重组子经酶切、PCR和测序鉴定,产物大小及基因序列与预期值相符。经抗性筛选的含内皮抑素cDNA的阳性克隆子可分泌具有生物学活性的内皮抑素;含反义VEGFcDNA的阳性克隆子VEGF均呈低表达,其中转染有内皮抑素cDNA和反义VEGFcDNA共表达载体的克隆子的VEGF表达最低;转染有内皮抑素cDNA和正义VEGFcDNA共表达载体的克隆子的VEGF也呈低表达。结论成功地构建大鼠内皮抑素和反义/正义VEGFcDNA真核共表达载体并在C6细胞上获得表达,内皮抑素可下调VEGF在肿瘤细胞上的表达。
郑秋月[4]2003年在《鼠内皮抑素基因的克隆及表达》文中研究表明肿瘤生长依赖于血管生成，新生血管为肿瘤提供氧气和营养，排出代谢废物。没有新生血管形成，肿瘤生长超不过几个立方毫米，并且肿瘤生长速度与血管新生程度有关。新生血管在肿瘤转移中也有重要作用，促进肿瘤细胞进入血液循环，血管生长丰富的肿瘤比缺乏血管生长的肿瘤更容易发生转移。因此抑制肿瘤组织的新生血管形成，从而抑制肿瘤生长和发生转移已成为肿瘤治疗的一个重要策略。 肿瘤细胞不仅可产生促进血管生长因子，也能产生抑制血管生长因子，肿瘤生长受促进或抑制血管生长因子的共同调控。1997年O'Rilly首次从小鼠内皮细胞瘤培养液中分离出内皮抑素(endostatin)，氨基酸序列分析显示此蛋白是胶原ⅩⅧC末端的氨基酸片段，分子量为20KD。特异性蛋白水解酶降解胶原ⅩⅧ C末端的蛋白酶敏感区，产生内皮抑素。实验发现内皮抑素直接作用于血管内皮细胞，抑制血管内皮细胞增殖、迁移，具有强烈抑制血管生成活性。研究内皮抑素晶体结构显示其表面富含精氨酸残基，是肝素结合位点，此位点与其抑制血管生长的功能活性有关。许多研究表明重组内皮抑素特异性抑制内皮细胞增殖，而且这种抑制作用呈剂量依赖性。细菌表达产物内皮抑素大部分以不溶形式存在，将这种混悬液注射治疗老鼠仍可以抑制肿瘤生长。于小鼠皮下重复注射内皮抑素重组蛋白，几乎完全抑制鼠Lewis肺癌等多种肿瘤生长，并无耐药性产生，即使中断治疗肿瘤也不再复发。内皮抑素是一种很有潜力的抗肿瘤血管生成药物。 本文进行小鼠内皮抑素基因的克隆及表达，基因工程方法构建了鼠内皮抑素的温敏型表达载体pBV220-endostatin，为此作了以下工作： 1．从小鼠肝脏细胞中提取总RNA。设计合成一对特异引物，分别带有EcoRI和BamHI的限制性内切酶的识别位点。用RT-PCR法扩增endostatin的基因片段，在endostatin基因的两侧引入EcoRI和BamHI酶切位点。 2．用EcoRI和BamHI酶切endostatin cDNA的PCR产物，将其插入到质粒载体pBV220中相应的限制性酶切位点，构建非融合质粒表达载体pBV220-endostatin。 3.将重组质粒转化到克隆菌DH5a中，经PCR筛选和限制性内切酶鉴定，得到阳性克隆菌株。 4.以双脱氧末端终止法对重组质粒pBv220一endostatin进行测序，结果表明与己知小鼠endostatin基因序列一致。 5.温度诱导重组质粒pBv220一endostatin在宿主菌中表达外源蛋白。 6.用聚丙烯酞胺凝胶电泳检测表达产物，在20KDa处有一特异蛋白条带。 7.表达蛋白初步分离纯化。 本文成功克隆鼠内皮抑素基因，构建了内皮抑素基因的原核表达载体pBV220一endostatin，该载体为非融合性表达载体，将pBV22o一endostatin成功转化到大肠杆菌表达菌DH5a中，并诱导表达了鼠内皮抑素蛋白，为基因工程方法生产内皮抑素奠定一定基础。
林志雄[5]2004年在《胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用对胶质瘤微生态系统与组织重构影响的初步研究》文中认为目的 通过研究FN和VEGF对胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用的影响及与侵袭的关系;同时,采用基因工程技术把胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用的刺激因子VEGF和抑制因子内皮抑素分别或同时转染至C_6细胞上,通过观察其阳性克隆子在裸鼠皮下移植瘤的微生态系统及重构后的肿瘤组织的形态学特征,来初步探讨胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用对肿瘤微生态系统与组织重构的影响及规律。 方法 ①在体外建立不同的C_6细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的共培养系统,利用电镜技术研究胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用的特征性结构—血瘤屏障的形态特征及与人体胶质瘤组织中血瘤屏障的区别;免疫细胞化学技术鉴定胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用后的层粘连蛋白(Laminin,LN)在血管内皮细胞上的表达变化,,以期建立一种既可以排除体内复杂因素的影响,又接近于肿瘤体内生长的内环境的,同时又能满足研究要求的胶质瘤细胞和血管内皮细胞的相互作用系统。②在体外利用Transwell共培养系统对HUVECs和C_6胶质瘤细胞进行共培养;RT—PCR和免疫细胞化学方法检测经共培养后C_6细胞和HUVECs上FN的基因转录及蛋白的表达情况;采用体外快速侵袭力测定法检测不同功能状态的HUVECs对C_6细胞侵袭力的影响及在FN抗体封闭下的变化;同样的方法检测不同状态的C_6细胞对HUVECs迁移力的影响及在VEGF和FN抗体封闭下对HUVECs迁移力的影响。③利用RT—PCR法从1日龄大鼠脑组织中扩增出内皮抑素和正义或反义VEGF_(164)基因,并将获得的基因依次重组入真核表达载体pBud4.1CE上。重组子鉴定后利用脂质体方法转染C_6细胞,Zeocin抗性筛选,Western-blot方法和ELISA方法检测鉴定阳性克隆子。把鉴定后的阳性克隆子接种裸鼠皮下,观察内皮抑素基因和/或反义/正义VEGF对C_6胶质瘤体内生长的影响,光镜和电镜技术系统观察比较了转染有内皮抑素和反义/正义VEGF的C_6胶质瘤细胞在裸鼠皮下的移植瘤标本中重构的TMES的形态学特
林丽彬[6]2007年在《大鼠内皮抑素基因克隆及其在大肠杆菌中的表达》文中研究指明目的大鼠内皮抑素基因克隆并在大肠杆菌中表达。方法以大鼠脑组织总RNA为模板，采用RT—PCR法从中扩增内皮抑素基因，并将获得基因重组入pThiohis表达载体，重组子经双酶切、PCR及测序鉴定。利用已成功转化的pthiohis-Endo融合表达重组子的大肠杆菌TOP10，在IPTG诱导下表达融合蛋白，亲和层析方法纯化，纯化产物EK酶酶切后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blot鉴定，MTT法鉴定其对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。结果从大鼠脑组织中成功扩增内皮抑素的eDNA片断，并将其克隆入pThiohis载体，经双酶切、PCR及测序鉴定，产物大小及基因序列与预期值相符。经过亲和层析方法纯化的内皮抑素融合蛋白行EK酶酶切后经聚丙烯酰胺电泳和Western-blot鉴定与预期相符，并能抑制人脐静脉内皮细胞增殖。结论成功克隆大鼠内皮抑素基因并在大肠杆菌中表达，获得具有生物学活性的内皮抑素融合蛋白，为今后自主开发利用内皮抑素进一步奠定实验基础。
卢炳新[7]2004年在《基因重组分泌型内皮抑素腺相关病毒治疗膀胱癌的实验研究》文中研究说明膀胱癌是国人泌尿系统最常见的恶性肿瘤，如何预防膀胱肿瘤术后复发、治疗术后残余瘤与原位癌是临床亟待解决的重大问题。研究认为实体瘤的生长与转移离不开肿瘤血管的生成，当肿瘤生长体积超过3mm~3、细胞数达10~7后就必须依赖肿瘤组织中的新生血管形成来提供生长所必须的养分及排出代谢废物。如果肿瘤超过这样的体积还缺乏毛细血管和小血管的生成，肿瘤将发生退化。因此，抑制血管生成可能是抑制肿瘤生长、防止肿瘤转移的一种有效策略。 肿瘤的血管生成是血管生成刺激因子和抑制因子共同作用的结果。目前已分离出多种血管生成刺激因子和抑制因子，最主要的刺激因子有血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等，主要的抑制因子有内皮抑素、血管抑素及干扰素等。内皮抑素是大分子物质胶原蛋白ⅩⅧ羧基端的20kDa片段，被认为是迄今为止所发现的作用最强的血管生成抑制剂。内皮抑素能有效抑制血管内皮细胞的增殖，促使肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤的生长和转移，具有很强的抗肿瘤特性，而且无耐药性和毒副作用。因此，内皮抑素将成为肿瘤抗血管生成治疗的首选生物制剂。 目前使用内皮抑素进行生物治疗有两种形式：蛋白质形式的内皮抑素和基因形式的内皮抑素。虽然内皮抑素蛋白抗肿瘤血管生成作用显着，但是也出现了叁个不容忽视的问题：1．蛋白纯化过程可能破坏内皮抑素的天然属性导致产量降低或蛋白活性减弱；2．内皮抑素作为一个蛋白药物，在体内的半衰期很短，在血清中难以保持能起治疗作用的浓度；3．如何把内皮抑素蛋白源源不断地输送到患者体内存在实际的操作性困难。因此，解决上述问题的一个可能的方法就是基因治疗，即把内皮抑素基因转移入细胞内，使细胞不断表达和分泌内皮抑素，从而起到治疗作用。 天津医科大学博d匕学位论文 内皮抑素的基因治疗应用了不同的载体系统，如用质粒直接注射肌肉，脂质体介导转染，应用病毒载体进行基因转移等，这些方法各自取得了一定的效果。腺相关病毒属于微小病毒科，是一种缺陷病毒，而且是唯一一种以位点特异性方式整合在人19号染色体上的真核病毒，从而避免了随机整合而导致宿主细胞突变的潜在危险性。重组腺相关病毒载体在肿瘤血管生成基因治疗中的优越性是多方面的，近年来逐渐成为研究的热点。 同所有实体瘤一样，膀肤癌的浸润生长、转移也呈血管新生依赖性，甚至有人认为微血管密度是患者预后独立的检测指标。因此本实验采用人n型腺相关病毒为基因治疗载体，介导人内皮抑素基因，并在目的基因前方加上一段信号肤序列IgG，利用病毒对膀肤癌细胞天然的感染性，将内皮抑素基因转移入细胞内，使其特异整合在19号染色体上，伴随肿瘤细胞的分裂持续表达内皮抑素并分泌到细胞间质内，发挥抗血管生成作用。 第一部分 基因重组rAAy‘Endostatin的包装 应用基因工程和分子生物学技术构建载体质粒并以质粒共转染方法包装rAA铸Endos枉吐in病毒颗粒: 1.以质粒p1REs一Endo为模板PCR扩增IgG一Endostatin片段，上游引物:GAcatcga护汀GAA户TGCAGCTGGG了口以，C，引入aal位点;下游引物:，几，犯亡C认CTTGGAGGCAGTCATG，引入BamHI位点。pCR产物经测序鉴定无误后以Clal、BamHI双酶切该片段，电泳、胶回收备用;同时以相同的两种限制性内切酶酶切载体质粒pCMV-MCs，胶回收质粒骨架部分，将lgG一Endostatin序列定向克隆入pCMV-MCs，构建质粒pCMV‘IgG-Endostatin。将所构建质粒转化E. coli DHSQ感受态细菌，大量收获质粒后测序鉴定，上游引物:ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC，下游引物二TAGAAGGACACCTAGTCAGA，分别位于多克隆位点上游的beta-giobin Intron和下游的hGH pA中，片段长度为1006bp，电泳和测序结果无误，证明质粒pCMV-IgG一Endostatin构建成功。 5 口毛创片医科大学博士学位论文 2.为了避免克隆过程中ITR的丢失，以Notl酶切质粒pCMV-IgG-Endos公妓in和腺相关病毒载体质粒pAAv-MCS，电泳、胶回收pA戌认MCS的原核表达片段及pCMV-lgG一Endostatin的真核表达框，两者连接进行亚克隆，构建质粒pAAv-IgG一Endostatin。将所构建质粒转化E coli DHS。感受态细菌，大量收获质粒后PeR鉴定，上游引物:CeTeTG解竹oAoCoTeG灯，下游引物:TACI沪n，GGTTGCTTTGACGT，分别位于上游的L一ITR和下游的R一ITR内，共3119bp。PCR产物电泳结果正确，证明质粒pAAV-IgG~Endostatin构建成功。 3.培养HEK293细胞，待HEK293细胞长至70一80%融和，取pAAv‘IgG-Endostatin、pRC和PHelPer电转法共转染，包装rAA认Endostatin;电转化72小时后取其冻溶液100川再次转染HEK293细胞，重复两次，收集冻溶液中的第叁代重组腺相关病毒，浓缩纯化。电镜检测病毒形态正常，ELISA法测定病毒滴度达一Zxlo，Zv.p/ml。 该课题部分利用基因工程和分子生物学技术构建pCMv-IgG一End0Statin穿梭质粒，为防止克隆过程中IT
孙俊杰[8]2010年在《子宫内膜异位症血管生成及靶向基因治疗的研究》文中研究说明第一部分携带人血管内皮抑素基因的重组腺相关病毒的制备和鉴定目的构建携带人血管内皮抑素(Endostatin)基因的腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)载体包装质粒pSNAV-Endostatin-CMV-EGFP,进而包装携带人血管内皮抑素基因的2型重组腺相关病毒(rAAV2-Endostatin-EGFP),为下一步探讨其在抗血管生成基因治疗动物模型实验中的作用奠定基础。方法采用分子克隆技术,从pCD-sEndostatin质粒获得Endostatin cDNA,并将PCR扩增产物插入至AAV包装质粒pSNAV-CMV-EGFP上,构建pSNAV-Endostatin-CMV-EGFP的AAV重组包装质粒,经PCR、酶切及测序鉴定。用Lipofectamine 2000将此包装质粒转染BHK-21细胞,建立载体细胞株。在转瓶中培养,用HSV1-rc/ΔUL2感染后收集培养物,进行纯化并测定其滴度。用rAAV2-Endostatin-EGFP感染BHK-21细胞24、48小时后(MOI=1×105v.g./cell)在荧光显微镜观察目的基因Endostatin在细胞表面的表达,即转染效率；48小时后采用BCA法检测目的基因Endostatin在蛋白水平的表达。结果经PCR、酶切鉴定及基因测序证实AAV包装质粒pSNAV-Endostatin-CMV-EGFP构建成功,进而rAAV2-Endostatin-EGFP包装成功。所包装纯化的重组病毒滴度达5×1011v.g./ml。利用PCR反应进行鉴定,扩增得到Endostatin。rAAV2-Endostatin-EGFP能有效感染BHK-21细胞,24小时后,转染效率为50%；48小时后为70%,并检测培养液上清液中血管内皮抑素蛋白浓度达194μg/ml。结论构建的AAV包装质粒pSNAV-Endostatin-CMV-EGFP可作为rAAV2-Endostatin-EGFP表达载体的包装质粒。成功包装的rAAV2-Endostatin-EGFP病毒,可直接用于抗血管生成基因治疗的实验研究。第二部分子宫内膜异位症裸鼠模型的建立目的建立人子宫内膜异位症裸鼠模型,观察异位种植病灶新生血管生成并探讨周细胞在血管生成过程中作用。方法通过开腹手术方法将人子宫内膜组织块种植于裸鼠盆腹腔,1周后观察其生长情况,并进行病理检查,同时采用免疫组化S-P法检测异位病灶内微血管密度(MVD, CD34标记)和周细胞(平滑肌肌动蛋白,a-SMA标记)的情况。结果成功建立人子宫内膜异位症裸鼠模型,异位种植病灶能保持原有内膜组织的形态结构,并可见血管生成明显。内皮细胞CD34表达阳性,周细胞a-SMA表达阳性。高血管密度区的MVD为(16.20±1.64)条,阳性周细胞数为(22.40±7.23)个,低血管密度区MVD为(3.62±1.50)条,阳性周细胞数为(15.56±5.34)个,高血管密度区MVD及周细胞数均高于低血管密度区,差异具有统计学意义(P<0.05)。高血管密度区周细胞与MVD的比值为(1.38±0.13),低血管密度区则高达(4.30±0.92),两者差异具有统计学意义(P<0.05)。结论子宫内膜异位症裸鼠模型的建立是子宫内膜异位症早期临床研究的理想模型,而且异位种植病灶组织内血管新生的早期即有周细胞存在。周细胞可能参与异位种植病灶组织血管生成过程,周细胞在血管生成中可能起负向调节作用。第叁部分重组腺相关病毒介导的人血管内皮抑素基因治疗裸鼠子宫内膜异位症目的研究重组腺相关病毒介导的人血管内皮抑素基因对裸鼠子宫内膜异位症的治疗作用。方法建立子宫内膜异位症裸鼠模型1周后,取建模成功的60只裸鼠作为实验研究对象,分为叁组：治疗组20只,于异位病灶局部直接注射rAAV2-Endostatin-EGFP;空载体对照组20只,于异位病灶局部直接注射rAAV2-EGFP;空白对照组20只,于异位病灶局部直接注射等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。分别于给药后1、2、3周各开腹一次,观察裸鼠盆腹腔病灶,同时留取异位病灶组织,观察各组裸鼠异位病灶中人血管内皮抑素蛋白表达情况和检测腺体数目；采用免疫组化S-P法检测病灶中微血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况；同时称量体重观察脂肪沉积情况。于给药后3周猝死,采用ELISA法检测各组裸鼠血清中雌二醇(E2)和孕酮(P)的水平；并对各组裸鼠卵巢、子宫、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏进行病理学检查。结果(1)荧光显微镜下观察,给药后1、2、3周,治疗组裸鼠异位病灶组织腺体和间质内出现绿色荧光；而空载体对照组和空白对照组裸鼠异位病灶组织内未见绿色荧光。rAAV2-Endostatin-EGFP局部注射异位病灶后在异位病灶腺体和间质可见人血管内皮抑素蛋白表达。(2)给药1周后,治疗组裸鼠异位病灶平坦、中央下陷,光镜下可见腺体数减少,腺腔变窄,细胞稀疏、呈萎缩状态。(3)各组裸鼠给药后1、2、3周的异位病灶内腺体数,治疗组分别为(7.8±1.9)、(7.0±1.5)和(5.5±1.73)个,均低于空载体对照组[分别为(10.1±1.7)、(10.2±2.0)和(9.84±2.4)个]和空白对照组[分别为(10.2±2.2)、(10.0±2.0)和(9.7±2.2)个],差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗组裸鼠给药后1、2、3周的异位病灶内腺体数比较,差异也有统计学意义(P<0.05)。(4)各组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶内的MVD,治疗组分别为(12.2±1.5)、(11.44±2.1)、(9.0±1.4)条,均低于空载体对照组[分别为(16.5±1.7)、(16.5±1.9)、(16.9±1.9)条]和空白对照组[分别为(16.2±1.6)、(16.0±1.6)、(16.3±1.7)条],差异均有统计学意义(P<0.05)；治疗组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶内MVD比较,差异也有统计学意义(P<0.05)。(5)各组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶中VEGF的阳性率及表达强度,治疗组分别为35%、30%、25%和1.60±0.43、1.33±0.30、1.03±0.36,均低于空载体对照组[分别为80%、75%、85%和2.43±0.53、2.43±0.29、2.66±0.45]和空白对照组[分别为85%、90%、90%和2.36±0.53、2.64±0.57、2.53±0.52],差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶中VEGF阳性率及表达强度比较,差异也有统计学意义(P<0.05)。(6)治疗组裸鼠体重[17.79±1.28、17.63±1.21和17.64±1.26 g]在给药后1、2、3周分别与空载体对照组[17.87±1.43、17.66±1.63和17.74±1.53 g]和空白对照组[17.62±1.57、17.54±1.54和17.55±1.59 g]比较,差异无统计学意义(P>0.05)。而且各组治疗前后比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(7)给药后3周,治疗组裸鼠血清中的雌二醇、孕酮水平分别为(48±7) pmol/L、(61±8)nmol/L,与空载体对照组[分别为(50±9) pmol/L、(60±10) nmol/L]、空白对照组[分别为(48±7) pmol/L、(58±10) nmol/L]比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(8)给药后3周,对治疗组裸鼠的卵巢、子宫、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织进行显微镜下观察,未发现缺血、坏死和炎症改变。结论携带人血管内皮抑素基因的重组腺相关病毒可抑制裸鼠子宫内膜异位症病灶的血管生成,从而抑制异位病灶的生长,而不影响体内性激素水平和脂肪沉积,对卵巢、子宫和其他重要脏器也无影响,抗血管生成基因治疗可能成为子宫内膜异位症治疗的新选择。
陈岩[9]2009年在《pIRES介导的HSV-tk和Endostatin双靶点联合治疗脑胶质瘤的实验研究》文中研究表明脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,现有治疗方法疗效不佳,迫切需要开发新的治疗手段。自杀基因疗法和抗肿瘤血管生成治疗是近年来胶质瘤基因治疗领域的研究热点,其中以单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-tk,简称TK)自杀基因疗法和内皮抑素(Endostatin,简称ES)基因治疗方法颇具应用前景。本研究在探讨Endostatin在人脑胶质瘤中表达情况的基础上,以TK和ES作为双靶点,构建双基因共表达载体,探讨其对脑胶质瘤的体内外治疗作用。研究结果显示:1、脑胶质瘤患者血清中ES含量及胶质瘤组织中ES mRNA和蛋白表达量均显着高于正常脑组织,且表达强度随肿瘤恶性程度增高而增强。Pearson相关性分析表明,随着ES表达强度的增高,肿瘤微血管密度呈显着上升趋势。2、成功构建了pTK-IRES-ES双基因共表达载体。3、体外实验:转染pTK-IRES-ES重组质粒的人脐静脉内皮细胞ECV304和大鼠C6胶质瘤细胞可同时表达TK和ES基因;双基因重组质粒可明显抑制肿瘤细胞及血管内皮细胞增殖,促进细胞凋亡,同时可抑制血管内皮细胞的迁移能力。4、体内实验:成功建立了大鼠胶质瘤脑内动物模型,pTK-IRES-ES重组质粒治疗组与单基因治疗组及模型对照组相比,大鼠神经系统症状明显减轻,生存期延长,肿瘤生长受到明显抑制,肿瘤细胞发生凋亡坏死,肿瘤组织微血管密度降低。以自杀基因和血管内皮抑素基因作为双靶点对脑胶质瘤进行联合基因治疗,其效果显着优于单基因治疗。高效、靶向、低毒副作用,协同作用强的双靶点基因治疗策略为未来胶质瘤治疗提供了新的思路。目前国内外尚未见联合应用HSV-tk和Endostatin双基因治疗脑胶质瘤的相关研究报道。
陈雄[10]2006年在《携带内皮抑素基因增殖型腺病毒治疗卵巢癌的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景及目的: 卵巢癌是卵巢恶性肿瘤,是女性生殖器常见的叁大恶性肿瘤之一。由于缺乏有效的早期诊断方法,诊断时多为晚期。死亡率居妇科恶性肿瘤首位。虽然近年来治愈率有所提高,但国内5年生存率仍徘徊在25%～30%之间。由于近年来宫颈癌和子宫内膜癌诊治进展,卵巢癌已经成为严重威胁妇女生命及健康的主要肿瘤。90年代以来,随着分子生物学迅速发展,肿瘤基因治疗正逐步从实验室进入临床,基因治疗成为肿瘤领域的热点。同时卵巢癌因其具有局限于腹膜腔的特点,而被较多地应用于动物试验和临床试验。但研究的进展缓慢,其主要障碍是传统基因治疗采用非增殖性病毒或物理化学方法等基因传输方案,造成基因转染率、表达量低,载体对肿瘤细胞缺乏靶向性,而达不到有效治愈肿瘤的目的。 腺病毒载体被广泛应用于基因治疗和临床试验。然大多数腺病毒载体尚存在外源基因表达时间短、免疫原性较强、高滴度时有明显的细胞毒性等缺点。肿瘤特异性增殖型腺病毒克服了上述腺病毒载体的不足,能够靶向肿瘤细胞增殖,且病毒本身可杀死肿瘤细胞,而不损害正常细胞,从肿瘤细胞释放出来的病毒可继续感染周围的肿瘤细胞,具有疗效放大作用。与传统治疗方法机制完全不同,一般不引起严重的毒副作用。其中增殖型腺病毒ONYX-015被认为是最为有效的肿瘤生物治疗方案之一,ONYX-015是E1b55Kda蛋白编码基因缺失的2型和5型腺病毒嵌合体,可在p53基因突变的肿瘤细胞内特异性增殖而不影响正常细胞。p53抑癌基因是人体恶性实体瘤最常见的一种可突变基因,55%～80%的原发性卵巢癌可发现有p53的突变,ONYX-015已在卵巢癌的治疗中实验应用。 通过新生血管的生成满足其不断生长所需的丰富血供,是实体肿瘤一个重要特征,当直径超过2cm时其生长依赖于新生血管的形成,另外,新生血管生成在肿瘤的转移过程中也起着决定性作用。卵巢癌富含血管,易发生腹腔
参考文献：
[1]. TIE2基因启动子及内皮抑素基因表达载体的构建[D]. 陆俊佳. 广西医科大学. 2013
[2]. 不相容双质粒共表达人内皮抑素及简化人纤溶酶原饼环区5[D]. 孙剑. 四川大学. 2006
[3]. 内皮抑素和反义/正义内皮细胞生长因子cDNA真核共表达载体构建与表达[J]. 林志雄, 杨丽娟, 黄强. 中华神经医学杂志. 2005
[4]. 鼠内皮抑素基因的克隆及表达[D]. 郑秋月. 大连医科大学. 2003
[5]. 胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用对胶质瘤微生态系统与组织重构影响的初步研究[D]. 林志雄. 苏州大学. 2004
[6]. 大鼠内皮抑素基因克隆及其在大肠杆菌中的表达[D]. 林丽彬. 福建医科大学. 2007
[7]. 基因重组分泌型内皮抑素腺相关病毒治疗膀胱癌的实验研究[D]. 卢炳新. 天津医科大学. 2004
[8]. 子宫内膜异位症血管生成及靶向基因治疗的研究[D]. 孙俊杰. 天津医科大学. 2010
[9]. pIRES介导的HSV-tk和Endostatin双靶点联合治疗脑胶质瘤的实验研究[D]. 陈岩. 吉林大学. 2009
[10]. 携带内皮抑素基因增殖型腺病毒治疗卵巢癌的实验研究[D]. 陈雄. 第二军医大学. 2006
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