马铃薯泛素结合酶E2基因家族鉴定和StUBC9基因克隆及功能研究

论文摘要

泛素蛋白酶体系统（Ubiquitin–proteasome system,UPS）是一种重要的蛋白质周转系统,能够降解或修饰真核细胞内的蛋白质。多数情况下26S蛋白酶体系统识别并快速降解靶蛋白,从而去除大多数异常肽和短寿命多肽,该系统参与调节多种生命过程,包括激素响应、光形态发生、昼夜节律、器官发育、植物防御、叶片衰老及对生物和非生物胁迫的响应。泛素结合酶E2（Ubiquitin conjugating enzymes）是该系统中泛素从泛素激活酶E1（Ubiquitin-activating enzymes）转移至泛素连接酶E3（Ubiquitin-ligase enzyme）的关键酶,是靶蛋白泛素化的重要组成部分。目前已经对拟南芥、水稻、番茄等物种的E2基因家族进行了鉴定,而马铃薯中该家族基因的研究未见报道。本研究鉴定并系统分析了马铃薯E2基因家族,克隆了马铃薯的StUBC9基因,并通过根癌农杆菌转化的方法将StUBC9基因的过表达载体及干扰表达载体分别转入微型薯中,对该基因功能进行了初步分析。试验方法及取得的结果如下:1.通过隐马尔科夫模型搜索及BLAST比对相结合的方法共鉴定出了57个马铃薯E2家族基因成员。根据马铃薯与拟南芥构建的系统进化树,将该家族分为8个亚家族,并分析了该家族基因成员的生物学信息。基因重复分析表明,马铃薯E2家族基因有13个片段重复而未发现串联重复。这表明片段重复在马铃薯E2基因家族扩展与功能多样化的过程中扮演着重要的角色。2.对马铃薯E2基因家族的结构分析发现E2家族基因内含子的数目在0-9之间,其中最多的基因含有4个内含子,这与玉米及番茄的情况相似。比较番茄、拟南芥、马铃薯E2家族基因的motif结构发现,它们所包含的motif高度相似,这说明E2家族motif在进化过程中高度保守。分析发现马铃薯E2家族成员的三级结构相似,空间构型较为一致。空间结构决定蛋白质的功能,这表明马铃薯E2基因家族在功能上比较保守。3.分析了马铃薯E2家族基因的启动子区域,发现该家族基因启动子区有多种与植物生长发育、非生物胁迫和激素应答反应有关的顺式作用元件。GO分析发现E2酶具有蛋白质结合功能和连接酶活性。E2家族的蛋白互作网络分析表明,共有143个蛋白参与740对蛋白互作,其中E2家族成员之间互作有392对,其他与E2酶互作的蛋白大部分与泛素介导的蛋白质水解、DNA的修复、RNA转运及蛋白质修饰有关。4.根据马铃薯基因组数据库的测序结果,E2家族基因在根、叶、块茎中表达较高,且在ABA、盐及高温处理时上调表达。运用qRT-PCR对马铃薯基因组数据库的E2家族基因进行表达分析,结果表明有8个StUBCs基因在NaCl胁迫下显著上调;17个StUBCs在热处理中的表达显著上调,且大多数上调的StUBCs在处理6小时后表达量达到最高。这表明E2家族基因参与了马铃薯对非生物胁迫的响应。5.马铃薯StUBC9基因的CDS区长度为486bp,编码161个氨基酸。运用生物信息学的方法预测了启动子区的顺式作用元件,发现StUBC9基因启动子区含有与脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯等有关的顺式作用元件。GO注释表明,E2酶与分解代谢、蛋白结合等有关;蛋白的互作网络分析表明StUBC9与2个E3酶和4个E2酶互作;空间结构与E2家族其他成员较为相似,比对了不同物种StUBC9的保守结构域,构建了13个物种与马铃薯StUBC9同源基因的系统进化树。6.PCR克隆了马铃薯StUBC9基因,构建了两种植物表达载体。一种是强启动子CaMV35S驱动的过表达载体pCPB-StUBC9;另一种运用巢式PCR技术扩增StUBC9的Micro RNA前体片段amiR-StUBC9,构建pCPB121-StUBC9干扰表达载体。通过农杆菌转化法分别获得马铃薯转基因试管苗。7.在热、盐、PEG600和ABA处理下,马铃薯栽培品种“Atlantic”试管苗中StUBC9基因均下调表达。经qRT-PCR检测,过表达植株中StUBC9基因的表达量上调,最高是对照组的6.37倍;在干扰表达植株中StUBC9基因的表达量下调,最低是对照组的0.53倍。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘维刚

导师: 张宁

关键词: 马铃薯,家族,生物信息学,基因

来源: 甘肃农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 甘肃农业大学

基金: 国家自然科学基金(31660416,31860399),甘肃农业大学学科建设基金项目(GSAU-XKJS-2018-169)

分类号: Q943.2;S532

DOI: 10.27025/d.cnki.ggsnu.2019.000140

总页数: 120

文件大小: 7989K

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