磷酸葡萄糖变位酶对蜡样芽孢杆菌0-9细胞壁特性和环境适应度的影响

论文摘要

细菌细胞壁作为细菌外层的一种刚性结构,不仅对于维持细菌形态发挥关键作用,而且细胞壁的有序代谢在细菌的正常生长、分化、物质运输乃至提高对环境条件变化的适应性等方面起重要作用。葡萄糖磷酸变位酶（PGM）是在原核和真核细胞中广泛存在,催化葡萄糖-6-磷酸转化为葡萄糖-1-磷酸,在细胞壁和多糖生物合成中具有重要功能。在模式细菌枯草芽孢杆菌中,PGM参与肽聚糖和磷壁酸的生物合成,该蛋白的缺失影响细胞壁的结构和组成,导致细胞形态发生改变。蜡样芽孢杆菌广泛存在于土壤、动植物体内和体表等多种完全不同的生态环境,具有良好的适应能力。目前,有关PGM在蜡样芽孢杆菌中的作用尚没见深入研究。蜡样芽孢杆菌0-9是一株从小麦根部分离获得的对于小麦纹枯病具有防治效果的生防菌,研究其环境适应机制,有助于揭示其生防机制。在本研究中,通过生物信息学分析,发现蜡样芽胞杆菌0-9中存在与枯草芽孢杆菌PGM氨基酸序列高度同源的编码序列,命名为phosman。PCR扩增该基因的侧翼序列,插入到含有温度敏感复制子的穿梭载体pMAD的多克隆位点,成功构建基因敲除载体。将敲除载体转入0-9菌株的感受态细胞,通过同源重组敲除基因,成功构建基因敲除菌株。在此基础上,构建了基因敲除菌株的互补菌株。测定phosman的基因缺失菌株及其互补菌株在不同条件下的表型,结果显示,与野生型0-9菌株相比,该基因缺失后,突变体的菌落形态、生长,盐胁迫耐受等性状发生明显的改变。基因互补后,互补菌株的上述表型恢复至野生型水平。为了进一步分析phosman基因的功能,构建该基因的表达载体并实现在大肠杆菌的诱导表达。对纯化蛋白进行酶活测定,结果显示该基因编码蛋白能够催化葡萄糖-6-磷酸转化为葡萄糖-1-磷酸,表明phosman的编码产物是葡萄糖磷酸变位酶（PGM）。上述结果表明,蜡样芽孢杆菌0-9中也有PGM,PGM的缺乏可能影响细胞壁组分的改变,进而导致菌株的表型发生变化。在枯草芽孢杆菌中,添加Mg2+离子可以使突变株的性状恢复,在蜡样芽孢杆菌中,培养基中添加Mg2+后也不能恢复突变体的表型,暗示PGM缺乏对蜡样芽孢杆菌的影响不同于对枯草芽孢杆菌的影响。为了进一步分析PGM对于蜡样芽孢杆菌细胞壁代谢中的作用,利用基因同源重组方法敲除UDP-葡萄糖焦磷酸酶的两个编码基因,分别构建单基因缺失突变体ΔgtaB1和ΔgtaB2以及双基因缺失突变体ΔgtaB1ΔgtaB2,测定不同突变体的表型。结果发现该基因缺失后,突变体的菌落形态、生长,盐胁迫耐受等性状与Δphosman有一定的区别,但在与细胞壁合成有关的抗生素敏感性方面与Δphosman相似,说明在蜡样芽孢杆菌中,gtaB基因和phosman基因存在着一定的调控关系,但是否和枯草芽孢杆菌中的调控途径一样有待进一步的证明,测定几种菌株与细胞壁形成有关的一些生物性状如zeta电位,细菌的表面电荷量,细菌对水的亲疏性,以及对细胞壁形成有关的一些抗生素的抗性,发现基因gtaB和基因phosman对这些性状都有影响,说明这两个基因可能和细胞壁的合成有关。通过构建0-9菌株及其phosman突变体的绿色荧光蛋白（GFP）标记菌株,测定不同菌株在土壤的存活能力,结果发现phosman突变体在土壤中的存活能力明显降低,表明基因phosman影响着细菌在土壤中的存活率。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 曹雪风

导师: 王刚

关键词: 蜡样芽孢杆菌,葡萄糖磷酸变位酶,细胞壁,存活率

来源: 河南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 河南大学

分类号: Q93

总页数: 59

文件大小: 3320K

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