海洋酸化对泥蚶受精的影响及机理研究

论文摘要

自工业革命以来,化石燃料燃烧等人类活动导致大气中二氧化碳（CO2）的浓度不断升高,而这其中约有1/4至1/3的CO2被海洋吸收,造成了海水酸度的增加,即“海洋酸化”现象。在海洋中,大多数无脊椎动物在繁殖期直接将配子排放到自然海水中,并在海水中完成受精和发育的全过程。目前,已有大量研究证明海洋酸化会影响多种海洋无脊椎动物的雌雄配子和受精过程。与开阔海域相比,近岸滩涂环境更易受空气中CO2浓度影响,栖息于此的物种也因此更容易被海洋酸化所威胁。但迄今为止,海洋酸化对海洋滩涂贝类受精的影响及其作用机理尚不明晰。泥蚶（Tegillarca granosa）是我国重要的经济养殖滩涂贝类,具有重要的经济价值和生态地位,其广播式繁殖（Broadcastspawning）在海洋无脊椎动物中也极具代表性。因此,本研究通过模拟未来海水pH条件,探究了未来海洋酸化条件（pH 7.8和7.4）对泥蚶受精的影响。首先,本次研究采取了向海水中添加无机酸和加富CO2两种方法模拟未来海洋酸化条件并处理泥蚶配子。实验结果发现,两种方法制备出的酸化海水处理泥甜配子均会显著抑制其受精率,但加富CO2法对泥蚶精子运动能力的影响更大。由于海洋无脊椎动物的受精,按时序主要包括精卵相遇、精卵识别与卵子激活（钙波形成）三个步骤,为了进一步分析海洋酸化影响泥蚶受精的作用机理,本研究通过加富CO2的方法模拟了未来海洋酸化情景,探究了其对上述三个关键步骤的影响。在精卵相遇方面,研究发现海洋酸化会明显削弱精子的运动速度,从而减少精卵碰撞概率。实验中对泥蚶精子进行酸化处理后,其曲线运动速度（VCL）,平均路径速度（VAP）和直线速度（VSL）都显著降低。利用受精动力学模型（Fertilization kinetics model）模拟计算得出,若海水pH由8.1降至7.8或7.4时,仅泥蚶精子运动速度的下降就会使其受精率分别降低7.2%或20.8%。由于精子的三磷酸腺苷（ATP）水平与其活力呈显著的正相关,本研究也测定了不同海洋酸化条件下精子的ATP含量及其合成过程中关键酶酶活。结果表明海洋酸化可以通过抑制精子内ATP关键合成酶活性来降低ATP含量,这无疑会造成泥蚶精子运动速度的下降。在精卵融合方面,本研究发现未来海洋酸化会显著降低精卵识别的效率,造成泥蚶精卵融合比例的降低。根据实验所获的泥蚶精卵和受精相关参数,通过受精动力学模型计算得出,泥蚶精卵每次碰撞导致融合的概率（β/β0）在海水pH降至7.8和7.4时会分别下降到正常海水下的69.4%和46.8%。差异蛋白质组学的结果表明,酸化处理后卵膜上多个蛋白的表达水平发生了不同程度的改变,这其中也包括了调控受精相关细胞功能及介导精卵识别与融合的一系列蛋白。结合免疫荧光和荧光定量的结果可以推断,酸化处理后卵膜表面精卵识别与融合相关蛋白表达水平下调是导致泥蚶精卵识别效率降低的重要原因。在卵子激活方面,实验证实海洋酸化会抑制受精过程中卵细胞内钙离子（Ca2+）的波动幅度和浓度峰值。由于受精过程中的卵子激活是一个重要的Ca2+依赖性过程,此过程中卵细胞内Ca2+波动和浓度对卵子激活至关重要。因此,海洋酸化所导致的泥蚶受精过程中卵细胞内钙波形成紊乱将造成泥柑卵子激活失败。此外,荧光定量的结果显示,卵子内Ca2+转运相关蛋白表达受到抑制很有可能是造成海洋酸化条件下卵细胞内钙波生成紊乱的关键原因。综上所述,本研究发现未来海洋酸化条件会导致泥蚶受精率显著降低,主要是通过（1）削弱精子运动速度,减少泥蚶精卵碰撞的概率;（2）阻碍精卵识别,降低精卵每次相遇导致受精的概率;（3）造成卵细胞内Ca2+紊乱,导致卵子无法正常被精子激活。

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第一章绪论

1.1 海洋酸化

1.1.1 海洋酸化的成因与现状

1.1.2 关于海洋酸化的国际共识

1.1.3 海洋酸化对海洋贝类的影响

1.2 海洋无脊椎动物受精动力学

1.2.1 影响海洋无脊椎动物受精率的主要因素

1.2.2 受精动力学模型及其应用

1.3 泥蚶及其受精概况

1.3.1 泥蚶简介

1.3.2 泥蚶受精过程概况

1.4 本研究的内容与意义

第二章不同海洋酸化模拟方法对泥蚶受精与精子运动的影响

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 泥蚶的采集与暂养

2.2.2 实验仪器

2.2.3 海水处理与参数测定

2.2.4 泥蚶配子的收集

2.2.5 受精实验

2.2.6 精子活力实验

2.2.7 数据统计分析方法

2.3 实验结果

2.3.1 酸化对受精率的影响

2.3.2 酸化对精子运动的影响

2.4 小结与讨论

第三章海洋酸化对泥蚶精卵碰撞的影响

3.1 前言

3.2 海洋酸化对精子运动速度的影响

3.2.1 材料与方法

3.2.2 实验结果

3.3 海洋酸化导致的精子速度下降对受精的影响

3.3.1 材料与方法

3.3.2 实验结果

3.4 海洋酸化对精子能量的影响

3.4.1 材料与方法

3.4.2 实验结果

3.5 海洋酸化对精子钙离子转运的影响

3.5.1 材料与方法

2+-ATPase酶活影响'> 3.5.2 海洋酸化对泥蚶精子Ca²⁺-ATPase酶活影响

3.6 小结与讨论

第四章海洋酸化对泥蚶精卵融合的影响

4.1 前言

4.2 海洋酸化对泥蚶精卵碰撞导致融合概率的影响

4.2.1 受精动力学模型计算精卵碰撞引起受精概率

4.2.2 数据统计分析方法

4.2.3 实验结果

4.3 海洋酸化对泥蚶卵子膜蛋白表达的影响

4.3.1 材料与方法

4.3.2 实验结果

4.4 海洋酸化对泥蚶卵子钙网蛋白的影响

4.4.1 材料与方法

4.4.2 实验结果

4.5 小结与讨论

第五章海洋酸化对泥蚶卵子激活的影响

5.1 前言

5.2 海洋酸化对受精过程中卵细胞钙波形成的影响

5.2.1 材料与方法

5.2.2 实验结果

5.3 海洋酸化泥蚶卵子钙离子转运相关基因表达的影响

5.3.1 材料与方法

5.3.2 实验结果

5.4 小结与讨论

第六章结论、讨论与展望

6.1 结论

6.2 讨论

6.2.1 精卵相遇方面

6.2.2 精卵识别方面

6.2.3 卵子激活方面

6.3 展望

第七章本研究的主要创新点

参考文献

附录

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 施巍

导师: 刘广绪

关键词: 海洋酸化,泥蚶,受精,精卵碰撞,精卵识别,钙波形成

来源: 浙江大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,水产和渔业

单位: 浙江大学

基金: 国家重点研发专项,国家自然科学基金

分类号: S917.4

总页数: 119

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