光滑球拟酵母转录因子CgRds2应答环境胁迫的生理机制

2020-12-08阅读(950)

论文摘要

微生物在自然生长和发酵生产过程中经常会面临胁迫环境,抑制菌体生长并且降低发酵产物的产量。通过调节转录因子的表达来抵御环境胁迫已经成为一种有效的策略。本论文以一株光滑球拟酵母Candida glabrata ATCC 55为研究对象,以解析光滑球拟酵母抵御盐胁迫和酸胁迫的生理机制为研究目的,利用分子生物学和生物化学等分析方法,就转录因子CgRds2应答盐胁迫和酸胁迫的生理机制展开研究,主要结果如下:1.采用基因敲除和回补表达的方法构建了敲除菌株Cgrds2Δ和回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2,发现:在1.5 M NaCl条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ的细胞浓度和细胞存活率分别降低了23.4%和39.6%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2的细胞浓度和细胞存活率分别提高了10.2%和6.3%;在pH 2.0条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ的细胞浓度和细胞存活率分别降低了32.6%和56.9%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2的细胞浓度没有显著变化,但细胞存活率提高了17.6%。2.通过转录组数据分析发现,盐胁迫下敲除菌株Cgrds2Δ中糖酵解、核糖体生物合成和rRNA转录等路径中基因的转录水平显著上调;脂质代谢、MAPK信号传导和细胞周期等路径中基因的转录水平显著下调,其中脂质代谢路径中甘油磷脂代谢基因的表达量变化最为显著。进一步研究盐胁迫下CgRds2的调控机制发现,MAPK路径中的关键激酶CgHog1能够与转录因子CgRds2发生相互作用,并且CgHog1通过磷酸化CgRds2的Ser64和Thr97两个位点激活转录因子CgRds2。最后,CgHog1介导CgRds2调节甘油磷脂基因的表达、甘油磷脂组分和细胞膜完整性。在1.5 M NaCl条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ中甘油磷脂基因的转录水平显著降低,总磷脂含量和细胞膜完整性分别降低了30.3%和47.6%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2中总磷脂含量和细胞膜完整性分别提高了27.2%和12.1%;磷酸化位点突变菌株Cgrds22A中Cg Rds2与甘油磷脂基因的结合程度显著降低,总磷脂含量和细胞膜完整性分别降低了29.4%和21.8%。3.通过转录组数据分析发现,酸胁迫下敲除菌株Cgrds2Δ中减数分裂、蛋白质转运和转录过程等路径中基因的转录水平显著上调;翻译过程、细胞膜生物合成、氨基酸代谢和能量代谢等路径中基因的转录水平显著下调。进一步研究酸胁迫下CgRds2的调控机制发现,钙离子响应路径中的钙调磷酸激酶CgCmk1能够与转录因子CgRds2的PAS结构域发生相互作用,激活转录因子CgRds2的表达,使其从细胞质转移到细胞核中发挥作用。最后,CgCmk1介导CgRds2调节能量代谢基因的表达、胞内ATP含量和细胞膜通透性。在pH 2.0条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ中能量代谢基因的转录水平显著降低,胞内ATP含量和细胞膜通透性分别降低了33.5%和23.6%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2中胞内ATP含量和细胞膜通透性分别提高了41.5%和18.8%;PAS结构域缺失菌株Cgrds2-pas中CgRds2与能量代谢基因的结合程度显著降低,胞内ATP含量和细胞膜通透性分别降低了30.7%和19.1%。

论文目录

摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 细胞膜抵御环境胁迫的研究进展

1.1.1 细胞膜的结构特点和生理功能

1.1.2 细胞膜抵御环境胁迫的研究现状

1.2 调控细胞膜功能的研究进展

1.2.1 细胞膜完整性的调控策略

1.2.2 细胞膜流动性的调控策略

1.2.3 细胞膜通透性的调控策略

1.3 转录因子调节细胞膜组分和功能的研究进展

1.3.1 转录因子调节细胞膜组分和功能的研究现状

1.3.2 转录因子Rds2 的研究现状

1.4 本论文的立题依据及意义

1.5 本论文的主要研究内容

第二章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 培养基和培养条件

2.1.3 试剂和酶

2.1.4 主要仪器

2.2 分子生物学技术

2.2.1 基因敲除

2.2.2 质粒构建

2.2.3 酵母感受态细胞的制备与转化

2.3 菌株生长及耐受性检测

2.3.1平板点种实验

2.3.2 生长曲线测定

2.3.3 细胞存活率测定

2.4 蛋白互作及磷酸化分析

2.4.1 免疫共沉淀

2.4.2 酵母双杂交

2.4.3 染色质免疫共沉淀

2.4.4 碱性磷酸酶处理方法

2.4.5 体内磷酸化分析

2.5 基因及蛋白表达分析方法

2.5.1 RNA-seq分析基因转录水平

2.5.2 qRT-PCR分析基因转录水平

2.5.3 Western blotting分析蛋白表达水平

2.5.4 荧光共聚焦显微镜分析蛋白亚细胞定位

2.6 分析测定方法

2.6.1 甘油磷脂的提取和测定

2.6.2 细胞膜完整性分析

2.6.3 胞内ATP检测

2.6.4 细胞膜通透性分析

第三章结果与讨论

3.1 转录因子CgRds2对光滑球拟酵母环境胁迫耐受性的影响

3.1.1 转录因子CgRds2突变体的构建与验证

3.1.2 转录因子CgRds2对环境胁迫耐受性的影响

3.1.3 缺失CgRds2降低菌株在盐胁迫下的生存能力

3.1.4 缺失CgRds2降低菌株在酸胁迫下的生存能力

3.1.5 小结

3.2 转录因子CgRds2响应盐胁迫的生理机制

3.2.1 转录组数据分析盐胁迫下CgRds2参与的代谢路径

3.2.2 盐胁迫下CgHog1与CgRds2发生相互作用

3.2.3 盐胁迫下CgHog1磷酸化CgRds

3.2.4 CgHog1介导CgRds2调节甘油磷脂代谢基因的表达

3.2.5 CgHog1介导CgRds2调节甘油磷脂组分

3.2.6 CgHog1介导CgRds2调节细胞膜完整性

3.2.7 小结

3.3 转录因子CgRds2响应酸胁迫的生理机制

3.3.1 转录组数据分析酸胁迫下CgRds2参与的代谢路径

3.3.2 酸胁迫下CgCmk1与CgRds2的PAS结构域发生相互作用

3.3.3 酸胁迫下CgCmk1激活CgRds2的表达

3.3.4 CgCmk1介导CgRds2调节能量代谢基因的表达

3.3.5 CgCmk1介导CgRds2调节胞内ATP水平

3.3.6 CgCmk1介导CgRds2调节细胞膜通透性

3.3.7 小结

主要结论与展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吴承晋

导师: 刘立明

关键词: 光滑球拟酵母,细胞膜,盐胁迫,酸胁迫

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ920.1

总页数: 57

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