纪晋文[1]2005年在《幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白纯化及其免疫效果的研究》文中提出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种能够定植于人体胃粘膜的革兰氏阴性杆菌,全球约有50%的人感染Hp,普通人群中的感染率为8%～87%,Hp感染是慢性胃炎的主要致病因子,是消化性溃疡、胃癌、黏膜相关样淋巴组织(mucosa-associated lymphoid tissue,MALT)淋巴瘤的重要致病因素。1994年WHO国际癌症研究中心(IARC)正式将Hp列为人第一类致癌原(grade Ⅰ carcinogen),在感染者当中约10%～20%的人会发展成为消化性溃疡,1%～2%的人会发展成为胃癌。 虽然多种有效药物(抗生素、质子泵抑制剂等)的联合应用可根除Hp感染,但应用抗生素根治Hp显然不是最佳方法,它将会导致耐药菌株的不断增多,并且治疗费用高,复发机率大,患者依从性差,因此,研制有效的预防性和治疗性疫苗成为广大科研工作者攻关的重点。 随着疫苗研究的深入,多种候选抗原已被证明具有显着的免疫保护作用,然而,应用单一抗原成分进行免疫时却不能起到完全治疗和预防Hp感染作用,这就提示应用混合抗原成分制备Hp疫苗将是未来Hp疫苗研究的趋势。 有研究表明,尿素酶B亚单位(urease subunit B,UreB)和热休克蛋白A亚
刘开云[2]2004年在《幽门螺杆菌治疗性疫苗的动物实验研究》文中研究表明背景与目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)可引起慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等上消化道疾病,并与胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生有关。现阶段临床治疗Hp感染中存在患者依顺性差、费用昂贵及日趋严重的细菌耐药性等问题。大量实验证明,Hp疫苗能有效地预防Hp感染。目前研究中的Hp疫苗基本都属于预防性疫苗。然而,对Hp感染人群还需要进一步研制安全有效的治疗性Hp疫苗。动物实验研究发现,以Hp全菌抗原为基础的疫苗对Hp感染有一定的治疗效果。因此,本研究对Hp灭活全菌治疗性疫苗进行初步研究,摸索灭活全菌的制备,筛选佐剂、免疫剂量、免疫途径及免疫周期,观察免疫治疗效果及对Hp再次感染的抵抗力,初步探索Hp治疗性疫苗免疫清除机制。实验设计:1. 疫苗抗原制备:通过对接种量和产量定量,优化液体培养Hp条件,福尔马林灭活Hp全菌并检定其质量。2. 佐剂选择:分别以CT、LT、CpG为粘膜佐剂口服免疫,以弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂和CpG注射免疫Hp感染沙鼠模型,观察治疗效果。3. 免疫剂量、免疫途径、免疫周期的确定:用灭活Hp全菌加氢氧化铝佐剂(以下简称“Hp治疗性疫苗”)注射免疫Hp感染沙鼠模型,选择最佳注射免疫途径、免疫剂量、免疫周期。4. Hp治疗性疫苗免疫治疗效果、免疫记忆性观察:Hp治疗性疫苗注射免疫Hp感染沙鼠模型,末次免疫后1月再次用同一菌株感染,观察治疗效果及抵抗再感染的作用。5. 免疫清除机制探索:RT-PCR检测疫苗免疫后沙鼠胃粘膜的INF-γ、IL-4及IL-12p40表达量的相对差异;Hp治疗性疫苗用同样方法免疫BALB/c小鼠,ELISA检测不同时间Hp特异性血清IgG、IgA和唾液sIgA水平的变化。研究结果:1. 液体培养Hp接种菌量以106/ml为宜,培养27小时最佳;1:2000福尔马林25℃下灭活1×109CFU/ml Hp全菌14小时,灭活完全,镜下观察其形态无变化,抗原性好,
吕琳[3]2009年在《幽门螺杆菌外膜蛋白Omp26重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗的研究》文中研究指明背景:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)为定植于人胃黏膜的一种微需氧、螺旋状的革兰阴性杆菌,已被公认为是慢性胃炎、胃十二指肠溃疡的重要病因,并与胃癌、胃黏膜相关性淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的发生密切相关,1994年被世界卫生组织定为I类致癌原(grade I carcinogen)。由于Hp的感染率极高,预防和治疗Hp感染成为消化领域和医学微生物界的研究热点。目前常用的治疗方案是抗生素加质子泵抑制剂或/及铋剂的“叁联”、“四联”疗法,但药物治疗存在一定的不良反应,停药后易复发,治疗费用较高,患者依从性差及耐药菌株的不断增加等问题使其发展受到限制,而疫苗将是预防和治疗Hp感染最经济有效的方法。Hp蛋白疫苗的免疫原性较低,只有与各种强效的免疫佐剂一起接种时才具有保护作用,但这些佐剂存在较大的毒副作用而限制了其进一步发展,而重组活载体疫苗可有效解决这一难题。Hp活载体疫苗为预防和治疗Hp感染提供了一种新的策略。耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.s)是一类来源于土壤的快速生长型分枝杆菌, 1～3 h繁殖一代,耻垢分枝杆菌既是一种非致病菌又是一种有效的细胞免疫佐剂,随着研究的深入,很多外源蛋白在耻垢分枝杆菌中获得了表达,并具有较好的免疫效果。这为研究Hp活载体疫苗提供了新的途径。Omp26是Hp的一种外膜蛋白(Outer membrane protein,Omp),分子量为26 000,不仅可作为检测Hp的一种标志性抗原,而且具有免疫原性。由于小分子(特别是Mr为18 000和26 000)的Omp,不仅对胃癌及胃癌高发人群的筛选具有重要的价值,而且可用其免疫动物或人,清除体内的Hp和防止Hp的感染。基于上述背景,本研究将Hp Omp26基因克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体中,然后将重组载体通过电穿孔导入M.s,筛选稳定表达Omp26基因的重组M.s菌株;将绿色荧光蛋白质粒电穿孔入构建好的重组M.s中,灌胃免疫小鼠后观察其在小鼠体内外的稳定性及毒副作用;然后将重组疫苗株灌胃免疫BALB/c小鼠或Hp感染BALB/c小鼠,在动物模型中评价重组M.s活载体疫苗预防和治疗Hp感染的效果,并对免疫预防和治疗机理进行探讨。本研究主要分为四个部分:第一部分:幽门螺杆菌Omp26重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株的构建目的:采用基因工程技术构建幽门螺杆菌外膜蛋白Omp26大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体,并在耻垢分枝杆菌中进行表达,筛选稳定表达幽门螺杆菌Omp26的重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株,为进一步探讨其防治Hp感染奠定基础。方法:利用PCR技术,以pET32a-Omp26为模板扩增Omp26基因片段,PCR产物胶回收后与载体pMD18-T连接,通过PCR、限制性酶切分析和测序鉴定阳性重组载体,然后将测序正确的重组载体经kpnI和NotI双酶切后亚克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pLA71、pLA73、pJMas和pJHsp70中,构建分泌型和非分泌型大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体,利用电穿孔方法将其转入M.s中,构建重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株(rM.s),通过PCR、限制性酶切分析鉴定所构建的rM.s疫苗株的正确性,SDS-PAGE及Western blot对其表达的蛋白进行分析。结果:采用PCR方法从pET32a-Omp26中扩增出约594bp的DNA片段,目的片段与pMD18-T载体连接后测序结果示插入的基因片段为Hp Omp26编码基因,由594bp组成,与GenBank中菌株HP AY033499序列同源性达98.8%。将测序正确的重组T载体分别亚克隆入质粒pLA71,pLA73,pJMas, pJHsp70中,构建分泌性和非分泌性穿梭表达载体, PCR和酶切鉴定穿梭表达载体构建成功。将表达载体利用电穿孔的方法导入M.s中,经卡那霉素抗性筛选、限制性酶切分析和PCR鉴定rM.s株构建成功。重组质粒pPL71-Omp26,pPL73-Omp26在M.s中表达的蛋白可分泌到细菌培养上清中,Western blotting在细胞培养上清中能检测到Omp26。重组质粒pJMas-Omp26和pJHsp70- Omp26由于缺乏信号肽,所表达的蛋白仅存在于细菌沉淀中。结论:成功构建了重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pPL71-Omp26,pPL73-Omp26,pJMas-Omp26和pJHsp70- Omp26;成功构建了稳定表达幽门螺杆菌Omp26的重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株。第二部分:幽门螺杆菌Omp26重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株体内外稳定性及安全性研究目的:研究幽门螺杆菌Omp26耻垢分枝杆菌活载体疫苗株在小鼠体内外的稳定性及在小鼠体内的定植,并对疫苗的安全性进行评价。方法:将绿色荧光蛋白质粒电转化入构建好的重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗中,经体外传代培养,随机挑取20个菌落观察荧光表达及提取质粒判断重组质粒的稳定性;灌胃免疫BALB/c小鼠,免疫4周和8周后处死小鼠,对小鼠各内脏器官行组织学检查,并对各组织内细菌进行活菌计数及质粒提取,以判断重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗体内的稳定性及安全性。结果:体外稳定性研究结果表明重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗在体外具有高度稳定性,在有卡那霉素抗性存在和无选择性压力情况下均可连续传代20次而不发生质粒丢失。应用rM.s灌胃免疫BALB/c小鼠后无明显的毒副作用出现,重组活载体疫苗可稳定地存在于胃、脾脏、肺和肝脏。结论:绿色荧光蛋白为观测rM.s在体内的定植提供了更为直观的手段。rM.s在体内外具有高度的稳定性,无明显毒副作用。第叁部分:重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗预防幽门螺杆菌感染的研究目的:通过动物模型评价重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗预防幽门螺杆菌感染的效果,明确其预防幽门螺杆菌感染的作用机制。方法:选择标准化实验动物SPF级BALB/c小鼠构建Hp定植模型,将2×107 CFUs重组M.s疫苗(pPL73-Omp26)灌胃免疫BALB/c小鼠,同时设PBS对照组、M.s空菌组,免疫4w后,各组处死一批小鼠,取血清、胃、脾组织待用;余下的小鼠用Hp SS1攻击2次,4w后处死小鼠,行快速尿素酶试验, Hp定量培养,组织病理学检查以评价疫苗预防胃黏膜Hp感染的免疫保护作用。MTT检测脾淋巴细胞增殖;RT-PCR检测小鼠胃粘膜和脾组织中Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-12)与Th2细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)的表达; ELISA检测血清Hp特异性IgG, IgA,IgG1和IgG2a抗体水平。结果:rM.s(pPL73-Omp26)疫苗组胃黏膜中Hp数量明显低于PBS对照组和空菌组, rM.s(pPL73-Omp26)疫苗组不仅可以降低Hp的定植,而且能减轻Hp造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎症反应。用ConA和Hp抗原刺激后rM.s疫苗组小鼠脾淋巴细胞明显增殖。免疫后BALB/c小鼠特异性抗体显示rM.s(pPL73-Omp26)疫苗组诱导血清Hp特异性抗体IgG、IgA、IgG1和IgG2a水平均升高,以IgG2a占优势。RT-PCR结果示,疫苗灌胃免疫后4周,空菌组和重组疫苗组小鼠胃和脾淋巴细胞IL-2, IFN-γ表达量显著增加,PBS对照组无IL-2, IFN-γ表达。受Hp攻击后4周对照组和疫苗组小鼠胃组织和脾淋巴细胞IFN-γ,IL-2和IL-4均有不同程度的的表达,PBS对照组出现以IFN-γ为主的增生,空菌组出现以IL-2为主的增生,IFN-γ和IL-2水平显着高于rM.s疫苗组(P<0.05);而rM.s疫苗组则出现以Th2细胞(IL-4)为主的增生,IL-4水平显着高于PBS对照组和空菌对照组(P<0.05),各实验组Hp攻击前后均未见IL-12, IL-10,IL-6的表达。结论: rM.s疫苗经灌胃免疫BLAB/c小鼠后不仅能降低Hp定植,而且能减轻小鼠胃黏膜的局部慢性炎症反应,对Hp感染有明显的预防保护效果。该疫苗的作用机制可能是诱导Th1和Th2两种细胞平衡型免疫应答。第四部分:重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗治疗幽门螺杆菌感染的研究目的:通过动物模型评价重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗对幽门螺杆菌感染小鼠的治疗效果,明确其治疗幽门螺杆菌感染的作用机制。方法:建立幽门螺杆菌感染BALB/c小鼠动物模型,感染4周后将2×107 CFUs重组M.s(pPL73-Omp26)疫苗灌胃免疫幽门螺杆菌感染BALB/c小鼠,对照组用PBS或M.s空菌,免疫4w后处死小鼠,行胃组织快速尿素酶试验, Hp定量培养,组织病理学检查以评价疫苗对胃黏膜Hp感染的免疫治疗作用。MTT检测淋巴细胞增殖;RT-PCR检测小鼠胃粘膜和脾组织中Th1细胞因子(INF-γ、IL-2、IL-12)与Th2细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)的表达; ELISA检测血清Hp特异性抗体IgG, IgA,IgG1和IgG2a水平。结果:rM.s(pPL73-Omp26)疫苗治疗组小鼠胃黏膜中Hp数量明显低于感染对照组和空菌组, rM.s(pPL73-Omp26)疫苗不仅可以降低Hp的定植,而且能减轻Hp造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎症反应。治疗后四周ConA刺激后各实验组脾淋巴细胞均有不同程度的增殖,与感染对照组和空菌对照组相比,rM.s(pPL73-Omp26)疫苗治疗组小鼠脾淋巴细胞增殖更明显(P<0.05)。治疗后BALB/c小鼠特异性抗体检测示rM.(spPL73-Omp26)疫苗治疗组小鼠血清Hp特异性抗体IgG, IgA,IgG1和IgG2a均明显高于感染对照组和空菌组(P<0.001)。RT-PCR证实,各实验组胃和脾组织IFN-γ,IL-2,IL-4均有不同程度的表达,但rM.s(pPL73-Omp26)疫苗治疗组IFN-γ,IL-2,IL-4水平明显高于感染对照组和空菌组,各实验组均未见IL-6,IL-12和IL-10的表达。结论:成功建立了BALB/c小鼠的Hp感染模型, rM.s(pPL73-Omp26)疫苗经灌胃免疫Hp感染BLAB/c小鼠能明显降低Hp定植,减轻胃黏膜的炎症反应,对Hp感染有一定的治疗作用。其免疫治疗机理可能是rM.s产生以Th1细胞和Th2细胞协同作用的保护性免疫应答。
袁小澎[4]2004年在《幽门螺杆菌多亚单位融合疫苗的实验研究》文中研究说明目的： 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种全世界范围的人类感染病原菌，对人类健康构成严重危害。本研究拟通过生物信息学方法和体外尿素酶活性中和试验筛选稳定的能够替代全长尿素酶B(UreB)亚单位的活性片段，在此基础上将片段与另外两个已确定的Hp保护抗原成分热休克蛋白A(HspA)、鞭毛粘附素蛋白A(npak)构建融合基因。通过不同表达系统得到多亚单位的蛋白和基因疫苗，分别观察在小鼠体内诱导的不同免疫应答和保护作用，为揭示Hp潜在的保护性机制以及新型多亚单位Hp疫苗的研制提供理论和实验依据。 方法： 1．通过生物信息学方法对尿素酶B亚单位蛋白亲水性、抗原性和结构功能域等进行分析，结合尿素酶B亚单位蛋白的叁级结构X射线衍射图，依据尿素酶B亚单位蛋白功能、结构稳定性，选择能够替代全长亚单位的活性片段。 2．采用PCR方法从HpCQ9803基因组中扩增目的片段基因(UreB414)并构建到原核表达载体pET-28a(+)，通过酶切、测序鉴定阳性重组子。将阳性重组子转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，Tris-trcine PAGE及免疫印迹确定目的蛋白表达。Antheprot V 5.0软件分析蛋白性质，AKTA纯化仪纯化融合蛋白。将纯化片段免疫家兔制备高免血清，对免疫后血清通过体外尿素酶中和试验检验片段的生物学活性。 3．http://mathbio.nimr.mrc.ac.uk蛋白linker库中选择合适的蛋白linker，采用重迭延伸的方法，以HspA为融合蛋白前端，将HspA、HpaA及UreB活性片段依次串联，酶切及测序鉴定连接结果，NcoI、XhoI双酶切将融合基因构建到原核表达载体中。SDS-PAGE电泳和免疫印迹鉴定融合蛋白表达，软件分析融合蛋白理化特性，通过包涵体洗涤，纯化条件摸索，AKTA纯化仪纯化融合蛋白。 4．将160只小鼠随机分为4组：融合蛋白组(HspA-HpaA-UreB414)、叁亚单位物理混合组(HspA+HpaA+UreB)、单一尿素酶组(UreB)和PBS对照组。以LT无毒突变体为佐剂，分别于O、7、14、28天免疫接种，剂量为150μg／只／次。末次免疫后10天，每组取10只小鼠剖杀取样，ELISA检测口服免疫后血清特异IgG、IgA、IgGl、IgG2a，第叁军医大学博士学位论文粪便、胃肠道冲洗液slgA，EISp0T法检测小肠Pp结19卉^sc、xgG一^se数目，盯一PeR检测脾脏淋巴细胞IL一4，正N一Y水平。每组余下30只口服10scFu Hp动物适应株，30天后通过Hp培养、快速尿素酶试验、涂片及特异性PCR检测小鼠胃部标本并计算口服免疫后各组攻毒保护率。 5，将融合基因构建到真核表达载体pCDNA3.1(+)，酶切及测序鉴定得到阳性重组子。磷酸钙法将阳性重组子转染COS一7细胞，RT一PCR方法确定了融合基因在细胞中的表达。40只BALB/c小鼠，随机分为2组，大量抽提质粒，分别以空质粒载体和阳性重组子质粒，按照O、21、42天各一次，每次100林g/.q/次胫前肌注射的方案免疫接种小鼠，在末次免疫后30天依前法检测免疫后血液、胃肠道冲洗液标本指标及攻毒保护率。 结果: 1.选择了从UreB蛋白中5’端251位氨基酸到389位氨基酸的138个氨基酸为目的片段UreB414，该片段含有己确定的CHHLDKSIKEDV12肤的尿素酶活性相关位点。 2.成功构建目的片段的表达载体pET一28a-UreB414，目的片段分子量约为巧.SKD，包涵体鉴定试验证实为可溶形式表达，纯化后得到>90%纯度的目的蛋白，.蛋白免疫家兔后产生的抗体在体外能够中和尿素酶活性。 3.成功构建了包含HsPA、HpaA、UreB414叁个Hp保护性亚单位的融合基因，不同基因组分之间以R场甲PP6氨基酸linker的相应碱基连接，该U川沈r为非螺旋刚性蛋白linker。 4.得到融合蛋白表达载体phhu，表达的融合蛋白具有叁个亚单位蛋白各自的免疫反应性，分子量约为43.9KD。UVP扫描证实融合蛋白表达约占总蛋白的26%。包涵体鉴定试验证实融合蛋白以包涵体形式表达，确定了采用亲和层析、离子交换层析相结合的纯化方法。纯化后得到纯度>85%的融合蛋白。 5.融合蛋白组血清IgG、IgA，粪便，胃肠道冲洗液slgA水平，肠道PP结IgA一Asc、IgG一AsC细胞数量与PBs组相比，升高明显，差异非常显着(P<0 .001)，与叁个亚单位蛋白物理混合组相比，无明显差别(P>0.05)，血清IgGI、IgGZa，脾脏淋巴细胞体外Hp刺激后IL一4，正N一Y的水平都明显增高。融合蛋白组、叁个亚单位物理混合组和单一蛋白组小鼠的攻毒保护率分别为89.6%、72.3%和65.5%。 6.转染后融合基因能够在细胞中的表达。与空质粒免疫对照组相比，融合基因免疫组小鼠血清IgG、IgA显着升高(P<0.001)，粪便，胃肠道粘液slgA未见升高，血清IgG以IgGZa升高为主。动物攻毒保护率为88.75%。 结论:第叁军医大学博士学位论文 1.通过理论预测及尿素酶体外中和试验实验得到性质稳定能够替代全长尿素酶B亚单位的活性片段UreB414。 2.重组融合蛋白经口服免疫后激发的为一种Thl、Th:平衡的免疫应答模式小鼠免疫应答，攻毒保护试验取得89.6%的保护率。融合蛋白组小鼠的攻毒保护率显着高于单一蛋白组(P二0.0283)。 3.Hp多亚单位融合基因DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠，诱导产生一种以Th;为主?
周维英[5]2007年在《治疗性幽门螺杆菌表位疫苗的实验研究》文中进行了进一步梳理幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是慢性胃炎、胃十二指肠溃疡的主要病原菌,与胃癌、胃粘膜相关性淋巴组织淋巴瘤密切相关,已被世界卫生组织列为Ⅰ类致癌因子。目前临床治疗H. pylori感染主要方法为联合应用质子泵抑制剂和抗生素的疗法,虽然在一定程度上能清除H. pylori,但患者对药物的依从性差、抗生素耐药菌株不断出现、再感染的发生及药物的不良反应等,这都使临床药物治疗受到限制。有效的预防性和治疗性H. pylori疫苗可以克服上述药物治疗H.pylori的不足,被认为是控制H. pylori感染的最有前景的方法,是根除H. pylori感染的希望。基于表位疫苗设计(Epitope-based Vaccine Design,EBVD)的策略被认为是第四代疫苗,其着眼点是免疫应答的功能单位——表位。表位疫苗明显的优势是设计灵活、针对性强,选择优势表位进行合理的组合设计,能够诱导高效、安全、特异的免疫应答。近年来,表位疫苗已经成为研制感染性疾病、恶性肿瘤以及自身免疫性疾病等疫苗设计的新方向,并取得显着进展。H.pylori自然感染可通过免疫偏差、免疫颠覆和免疫缺陷等机制逃避机体的清除,进而引起机体对H.pylori自身天然蛋白成分的免疫耐受,研究表明仅仅选用H.pylori天然抗原进行免疫治疗是很难打破机体免疫耐受,激发有效的免疫应答,因此,必须对天然抗原分子进行设计、修饰和改造。蛋白抗原发挥其功能主要通过表位来体现特异性,这些表位不仅包括B细胞表位、Th细胞表位、CTL表位等与免疫识别相关的结构,而且还同时存在毒性或抑制性表位等不利于免疫保护的因素。为了提高蛋白抗原的保护性,就必须在表位水平上作出选择和设计以得到理想的疫苗分子。借鉴其它疾病表位疫苗的设计经验,选择H.pylori优势抗原的保护性、特异性、免疫原性强的表位进行设计,辅以粘膜佐剂来激发更强、更特异的、不同于自然感染时的粘膜免疫应答,有可能打破免疫耐受,达到预防或治疗H.pylori感染的目的。H.pylori感染免疫治疗后的保护机制较为复杂,所设计的不同类型H.pylori治疗疫苗的免疫应答机制也存在差异。在细胞免疫方面,已有很好的证据证实:CD4~+T细胞对于H.pylori的免疫保护是必需的,并且,随着对H.pylori疫苗治疗效果及机制研究的深入,逐渐认识到机体抵抗H.pylori感染的保护性机制可能为一种Th1/Th2同时存在的平衡应答模式;在体液免疫方面,不能完全排除特异性体液免疫应答的作用,基于对H.pylori感染免疫机制的进一步认识和本室先前H.pylori感染治疗的动物试验结果,H.pylori治疗性疫苗的设计可能遵循以CD4+ T细胞介导的Th1/Th2平衡应答为主,兼顾特异性体液免疫的基本策略。在H.pylori的已知蛋白抗原中,尿素酶B亚单位(UreB)和粘附素(HpaA)是已经证实具有很强的抗原性和免疫保护力的抗原。本课题在本室成功筛选和鉴定UreB多个Th细胞表位的基础上,选用UreB叁个优势性Th细胞表位(两个Th2,一个Th1表位)和文献报道UreB的一个B细胞表位、HpaA的一个B细胞表位以及分子内佐剂LTB,通过计算机辅助设计和分析对天然抗原表位进行分子设计、重组、优化、计算机分子结构模建等获得理论上最佳组合方式,按此组合方式构建了表达H.pylori五个表位多肽基因(HUepi)与ltB基因的表位疫苗融合蛋白,经抗原特性及各表位功能分析后,进行口服免疫治疗小鼠H.pylori感染的试验,观察H.pylori清除效果及相应的免疫应答过程,为H.pylori治疗性疫苗的设计与完善奠定基础。本课题的主要研究方法、结果与结论如下:1.治疗性幽门螺杆菌表位疫苗的设计选用UreB叁个优势性Th细胞表位(两个Th2,一个Th1表位)和文献报道UreB的一个B细胞表位、HpaA的一个B细胞表位以及分子内佐剂LTB,利用RANKPEP软件、DNAstar软件进行表位组合顺序分析和串联表位与分子内佐剂LTB之间连接linker的设计,获得理论上最佳组合方式,采用Robetta、Modeller和SPDB viewer软件进行表位融合蛋白叁级结构的模建,获得理论上最接近天然状态下的叁级结构。2.治疗性幽门螺杆菌表位疫苗融合蛋白抗原的构建、表达、纯化按照第一部分的设计,在本室成功构建表位融合蛋白Uepi的基础上,分别克隆了表位多肽基因HUepi和ltB基因,采用重迭延伸PCR的方法将两段基因按照预先设计的方向通过linker连接起来,获得表位多肽与ltB的融合基因(HUepi-ltB),通过限制性内切酶NcoⅠ、XhoⅠ分别构建原核表达载体pET22b-HUepi-ltB、pET22b-HUepi和原核表达工程菌株pET22b-HUepi-ltB/BL21、pET22b-HUepi/BL21,经IPTG诱导高效表达分子量分别为20.7 kDa(HUepi-LTB)和8.3 kDa(HUepi)的表位融合蛋白,分别采用不同的纯化方案对重组表位融合蛋白HUepi-LTB和HUepi进行纯化与鉴定,纯化后HUepi-LTB和HUepi的蛋白纯度分别为95.2%和97.6%。3.治疗性幽门螺杆菌表位疫苗融合蛋白抗原特性及各表位功能分析表位疫苗融合蛋白分别免疫家兔制备兔抗HUepi-LTB和HUepi抗血清,采用Western blot和ELISA检测表位疫苗融合蛋白特异性抗体与rUreB和rHpaA的免疫反应性及LTB组分GM1神经节苷脂的结合活性;通过尿素酶抑制实验、H.pylori与胃上皮细胞(GES-1)的粘附与粘附抑制实验,血凝与血凝抑制实验检测B细胞表位的作用;表位融合蛋白注射免疫小鼠,通过特异性淋巴细胞增殖实验检测Th细胞表位作用。结果表明:表位疫苗融合蛋白产生的特异性抗体能够与rUreB、rHpaA、rLTB反应,且融合蛋白中LTB组分保持了与GM1神经节苷脂结合活性;抗表位融合蛋白的特异性抗体在一定程度上能够抑制H.pylori尿素酶的活性,并可阻止H.pylori与胃上皮细胞的粘附和抑制H.pylori与红细胞的凝集反应;淋巴细胞增殖实验证实叁个Th表位肽能刺激表位疫苗免疫小鼠的淋巴细胞发生特异性增殖(SI>2),并且表位疫苗致敏的淋巴细胞在rUreB的刺激下可以增殖。实验证明表位融合蛋白具有良好的免疫原性、免疫反应性并且所包含的各表位发挥了各自的免疫效应。4.治疗性幽门螺杆菌表位疫苗免疫治疗BALB/c小鼠H.pylori感染效果评价及机制探讨1)表位疫苗治疗BALB/c小鼠H.pylori感染效果评价:采用H.pylori动物适应菌株SS1感染BALB/c小鼠,成功建立H.pylori感染动物模型,同时建立H.pylori定量培养方法,根据H.pylori 16S rRNA编码基因设计引物建立H.pylori感染的PCR检测方法。以表位融合蛋白HUepi-LTB和HUepi+rLTB每间隔7～10d,连续4次对感染H.pylori的BALB/c小鼠进行口服免疫治疗,于治疗38d后进行H. pylori定量培养检测、尿素酶实验、PCR检测评价表位疫苗的治疗效果。结果显示表位融合蛋白能够显着降低小鼠胃粘膜H.pylori的定植数量,清除率分别为64.2%和61.5%。2)表位疫苗治疗BALB/c小鼠H.pylori感染保护机制探讨:H.pylori感染小鼠予以表位疫苗口服免疫治疗38d后,流式细胞术分析脾淋巴细胞亚群变化,淋巴细胞增殖实验检测脾和肠粘膜淋巴细胞的特异性增殖,ELISA检测脾和粘膜淋巴细胞细胞因子的分泌,RT-PCR检测脾和肠粘膜淋巴细胞IL-4和IFN-γmRNA表达水平,ELISA检测特异性抗体IgG、IgA的产生。结果显示:H.pylori超声上清可显着刺激表位疫苗免疫治疗小鼠脾淋巴细胞和肠粘膜淋巴细胞特异性增殖,与PBS组、佐剂组和单纯表位蛋白组差异显着(P<0.01);流式细胞术分析脾淋巴细胞亚群显示CD4~+ T淋巴细胞增殖明显;疫苗作用下脾淋巴细胞和肠粘膜淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-4水平较对照组显着升高(P<0.01),RT-PCR结果显示脾和肠粘膜淋巴细胞IL-4和IFN-γmRNA表达水平明显增高;体液免疫应答检测结果显示H.pylori表位疫苗可刺激机体产生血清特异性IgG抗体,刺激肠液、唾液及粪便中特异性sIgA水平显着升高(P<0.01)。因此,H.pylori表位疫苗口服免疫后可诱导产生局部粘膜和全身性体液免疫应答和Th1/Th2混合型细胞免疫应答,起到清除H.pylori感染的作用。
姚蕾[6]2006年在《幽门螺杆菌ureB基因及其片段的表达和免疫研究》文中研究指明幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种革兰氏阴性菌、呈螺旋形，是引起人发生慢性活动性胃炎、胃和十二指肠溃疡的主要病原菌，同时与胃腺癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)的发生也密切相关。临床现有的根除Hp的手段主要是联合应用抗生素，但由于该菌感染的普遍性、耐药菌株的不断增加、较高的花费以及病人的低依从性等，限制了抗菌药物的疗效，因此，迫切需要进行免疫防治研究工作。 幽门螺杆菌尿素酶是一种高亲和力、高活性和高分子质量的蛋白质。纯化尿素酶是由尿素酶A亚单位和B亚单位组成。尿素酶具有保护力、免疫原性、表面暴露和高度保守性，是幽门螺杆菌的主要抗原成分，尤其是尿素酶B亚单位(UreB)，已经被证明可以刺激机体产生免疫应答且具有较好的免疫保护性。但是，由于UreB分子较大，在大肠杆菌中不易重组表达，而且UreB的重组表达产物多为包含体形式，表达蛋白失去活性而且提取工艺复杂。因此，我们以本实验室构建的具有分泌表达系统的大肠杆菌基因工程菌，即转入ureB及其e、f、m叁个不同片段的大肠杆菌为研究对象，分析不同重组蛋白(rUreB、E、F、M)的表达和免疫性质。 1、借助生物信息学技术对重组蛋白理化性质、二级、叁级结构
张红欣[7]2006年在《幽门螺杆菌HspA、UreB基因的克隆及其在植物中的表达研究》文中指出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H．pylori)是寄居在胃粘膜的一种非侵袭性的革兰氏阴性微需氧螺杆菌。H．pylori感染呈全球分布，感染率之高仅次于龋齿，居第二位。在感染者中，大约有15％～20％的人最终会导致严重的胃部疾病。现有的治疗H．pylori感染的方法存在很多弊端。近年来，人们逐渐认识到直接粘膜免疫能在粘膜表面产生保护性作用。通过口服疫苗直接刺激胃肠道粘膜免疫系统激发特异性免疫应答，使机体获得持久性的疾病防御能力。H．pylori疫苗免疫接种所诱导的免疫途径属于Th2型，通过增加IgG1、IL-4和IL-5的产生而阻止H．pylori在胃粘膜的生存，起免疫保护作用。生产口服疫苗是预防和治疗H．pylori感染所致上消化道疾病的有效途径。 国内外学者对H．pylori疫苗的研究做了大量的工作，有关研究人员已将H．pylori抗原基因转入细菌基因组中进行表达，经提纯制成口服疫苗。动物实验表明该疫苗有较好的免疫效果。但是该工作操作复杂、成本高，尤其是在提纯过程中保持抗原的活性是非常困难的。这不适合大规模生产H．pylori疫苗。利用植物作为生物反应器生产人类所需要的各种重组疫苗和药用蛋白是当今生物技术研究中的热点之一。通过直接食用转基因植物疫苗的方式代替传统的注射疫苗，无需昂贵的发酵、提取加工和冷藏等设备，可以节约大量的费用，易于普及推广，对于发展中国家尤其具有深远的意义。本课题首次获得了可食用的幽门螺杆菌HspA-UreB双价胡萝卜疫苗候选株系，这将有助于在全球范围内普及对H．pylori感染性疾病的预防与治疗。 1．幽门螺杆菌HspA基因的克隆及其在烟草中的表达。本研究根据在GenBank检索得到的幽门螺杆菌HspA序列设计引物，P1：GAATCCGACATATGAAGTTTCCATT和P2：GAGCTCGAGGTGTTTTTTGTGATCAT，利用PCR技术从幽门螺杆菌基因组DNA中克隆了HspA基因，将HspA基因重组到克隆载体pGEM-T easy中，质粒DNA测序，用DNAMAN软件将这段HspA序列与GenBank中所注册的DNA序列比较，同源性高达97％。将HspA基因重组到植物表达载体pBI121中。利用冻融法将pBI121-HspA质粒DNA转入农杆菌LBA4404，
张卫军[8]2006年在《幽门螺杆菌外膜蛋白双价亚单位融合疫苗的实验研究》文中认为目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种可定植于人胃粘膜表面的革兰氏阴性菌,现已证实Hp感染与慢性胃炎、消化性溃疡和胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)发生密切相关。现行推荐的根除Hp感染的治疗方案(抗生素联合质子泵抑制剂或铋剂)虽然有效,但存在耐药菌株增加和药费昂贵等不可避免的问题。据文献报道,免疫接种对Hp感染同时具有预防和治疗的作用,因此,疫苗的研制己成为全球Hp研究的热点。在疫苗研究中,筛选有效的免疫抗原是关键性的环节。目前大多数疫苗采用的是与Hp致病相关的毒力因子作为抗原成分,如尿素酶(urease)、热休克蛋白(heat shock protein, Hsp)、空泡毒素(vacuolating cytotoxin, VacA)、细胞毒素相关抗原(cytotoxin associate antigen,CagA)、中性粒细胞激活蛋白(neutrophil-activating protein, NAP)等。革兰氏阴性细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性,这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标,可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用,是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。Lpp20、AhpC和UerB都是Hp的外膜蛋白成分,其编码基因具有高度保守性,也是Hp疫苗重要的免疫抗原。但一直令学者们遗憾的是每种抗原单独免疫动物时,获得的保护率均不是很高,而多种抗原联合免疫才能达到较好的效果。因此,本研究拟对Hp外膜蛋白Ahpc和Lpp20基因进行克隆表达,在此基础上,将这两个外膜基因分别与Hp保护性抗原成分尿素酶B亚单位的活性片段(UreB414)和粘膜佐剂-大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)构建融合基因。通过不同表达系统得到多亚单位的融合蛋白,分别观察在小鼠体内诱导的不同免疫应答和保护作用,为筛选有效的Hp疫苗抗原奠定基础。方法:1、采用PCR方法从Hp CQ9803基因组中扩增lpp20、ahpC基因片段并构建在原核表达载体pET-22b(+)中,通过酶切、测序鉴定阳性重组子。应用生物信息学软件DnaStar和Genbank数据库分别对已公布的Hp ahpC和lpp20基因序列进行相似性分
徐灿[9]2004年在《幽门螺杆菌尿素酶B和黏附素A核酸疫苗的研究》文中认为幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是革兰氏阴性的微需氧菌。在世界范围内，其人群感染率达50％以上。H. pylori为胃、十二指肠溃疡的主要病原，与胃癌、胃黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤密切相关，已被世界卫生组织列为与胃癌发生相关的Ⅰ类病原。目前控制H. pylori的感染主要进行H. pylori根治性治疗，主要治疗方案为联合应用质子泵抑制剂和抗生素的疗法。虽然获得较好的疗效，仍然存在下列问题：如患者对药物的依从性、抗生素耐药菌株不断出现、再感染的发生及药物的不良反应如腹痛、恶心、呕吐，这都可能使临床药物治疗受到限制，另外，药物治疗仅针对有症状的患者，而无症状的H. pylori携带者仍存在发展为慢性胃炎甚至胃癌的危险性。如何在广大人群中有效控制H. pylori感染，并遏制感染后的一系列相关疾病的发生发展具有重要意义。有效的预防性和治疗性H. pylori疫苗可以克服上述药物根治治疗H. pylori的不足之处，被认为是控制H. pylori感染的最有前景的方法。 核酸疫苗分为DNA和RNA疫苗，主要指DNA疫苗。DNA疫苗是继减毒、灭活和亚单位疫苗之后的第3代疫苗，通常由编码病原或肿瘤细胞的质粒DNA分子构成。DNA疫苗接种后，机体细胞摄取DNA，并在细胞中表达所编码的抗原。DNA疫苗作为一项新型免疫技术和传统疫苗包括灭活、减毒和亚单位疫苗相比，具有显着的优势：和大多数亚单位疫苗不同，DNA疫苗可以刺激机体同时产生体液免疫及细胞免疫，而体液免疫和细胞免疫对获得免疫预防和免疫治疗作用至关重要。虽然传统的减毒疫苗也可刺激机体同时产生体液免疫和细胞免疫，但此疫苗存在安全隐患，可能由减毒状态回复至毒性状态，而DNA疫苗则无此危险性。DNA疫苗通过基因工程技术制造，可对基因进行修饰，制作相对简单，疫苗本身为具有热稳定性的重组质粒，无需特别纯化。另外，尚有报道DNA疫苗可刺激产生长久的免疫作用。 DNA疫苗已被广泛用于动物实验和非人类的灵长类动物，可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫反应。DNA疫苗免疫逐渐成为病毒、细菌和寄生虫等病原的极具前景的治疗方法。动物实验已经证实DNA疫苗对HIV病毒、流感第二军医大学博士学位论文中文摘要病毒、狂犬病毒、疟疾、结核杆菌等具免疫保护作用。临床实验也显示DNA疫苗的安全性和良好的耐受性。然而目前对H刃tori疫苗的研究还大多采用全菌超声裂解物或单个保护性抗原蛋白疫苗和佐剂如霍乱毒素或热稳定性大肠杆菌肠毒素，该类疫苗制作较复杂，免疫佐剂尚具较大的胃肠道毒性。 目前被广泛应用的免疫佐剂大多可刺激机体产生非特异性免疫反应，然而由于存在的较大毒性，使其难以用于人类临床。细胞因子如IL一2、IL一4、IL一12、IFN一Y已被证实可以调节免疫反应，一些研究证实，在疫苗接种的同时摄入细胞因子蛋白作为佐剂，或者接种表达细胞因子的质粒可以提高或调节机体对DNA疫苗的免疫应答，而至今，大多数研究都通过和病毒抗原或肿瘤相关抗原疫苗共同免疫来证实细胞因子的佐剂作用，而细胞因子佐剂在H Pylori.疫苗的免疫调节作用尚未见报道。 活的减毒细菌载体如减毒沙门氏菌系统被证实为有效的疫苗载体工具，体外研究表明该菌可把DNA疫苗运输到人体细胞，并在体内的感染和肿瘤动物模型被证实。减毒沙门氏菌可使疫苗通过豁膜表面接种，以勃膜相关淋巴组织中的抗原递呈细胞为靶细胞，最终刺激产生局部和全身免疫反应，使机体获得免疫保护。 本研究拟构建以减毒沙门氏菌为载体、UreB或HpaA为保护性抗原、IL一2为免疫佐剂的核酸疫苗，并检测其预防性和治疗性免疫保护作用。 1构成核酸疫苗的重组质粒的构建 目的:构建编码H刃tori ureB及饰aA基因及小鼠IL一2基因的核酸疫苗重组质粒。 方法:抽提HPylori基因组DNA，应用PCR技术分别扩增ureB及hPaA基因片断;从重组质粒pCIneo一工L一2扩增IL一2基因，分别克隆入puCmT载体，检测ureB、hpaA、IL一2基因序列，经过酶切、连接反应将测序后的上述基因片断其克隆入真核表达载体PIRES，并导入感受态大肠杆菌DHS“，筛选阳性克隆，通过PCR和酶切反应鉴定。 结果:分别扩增出约一700bp的ureB基因、75obp的hpaA和slobp的IL一2，测序结果表明扩增出的ureB、hpaA、IL一2基因与基因库公布的序列一致，PCR和酶切鉴定结果证实上述基因克隆入真核表达载体PIRES，成功构建了核酸疫苗的重组质粒pIRES一ureB、PIRES一ureB一IL一2、PIRES一hPaA一IL一2。第二军医大学博士学位论文中文摘要 结论:构建了编码H刃lori ureB和hPaA基因及小鼠IL一2基因的重组质粒，为进一步探索其体内外免疫性奠定了基础。 2重组质粒体外免疫原性的检测 目的:检测重组质粒pIRES一ureB、pIRES一ureB一IL一2、pIRES一hpaA一IL一2体外的免疫原性。 方法:采用Qiagen Plasmid Midi Kits大量抽提重组质粒pIRES一ureB、pxREs一ureB一IL一2、pIREs一hpaA一IL一2，通过脂质体Lip。feetam一neTMZ000把重组质粒转染体外培养的COS--7细胞，采用聚丙烯酞胺凝胶电泳和免疫印迹法检测pIRES一ureB、pIRES一ureB一IL一2、p
王峰[10]2013年在《幽门螺杆菌感染非抗生素治疗研究进展》文中研究说明自1982年幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori或Hp）首次从人胃黏膜组织中分离并培养出以来，国内外学者对其进行了近30年的研究，现已证实Hp感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织（mucosa-associated lymphoidtissue, MALT）淋巴瘤和胃癌的主要致病因素，近年来研究发现Hp感染与某些胃肠外疾病如缺铁性贫血、原发性血小板减少性紫癜、冠心病、儿童和胎儿发育生长迟缓、胆石症、牙周病等疾病具有一定的关系，国内外研究证据表明根除Hp具有诸多益处，如可促进溃疡愈合、显着降低溃疡复发及并发症率、治疗低级别胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、长期缓解功能性消化不良及降低了胃癌的患病率等，因此Hp感染处理问题一直是Hp研究领域研究的重点和热点之一。近些年国内外流行病学调查显示，Hp对克拉霉素和甲硝唑耐药是导致标准叁联方案的Hp根除率越来越低的主要原因，某些地区标准叁联疗法根除率远低于80％，为此国外多个地区已经修订并颁布最新的Hp感染处理共识/指南，2012年我国第四次Hp感染共识推荐四联疗法作为Hp根除治疗的一线方案，面对Hp耐药的压力，各国学者积极寻求根除率更高的疗法，研发抗Hp耐药的药物，本文就将近年相关研究，从最新Hp感染共识、中医药治疗、抗生素联合益生菌或依卡贝特钠、生物活性蛋白、Hp疫苗等方面作一简单综述。
参考文献：
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[4]. 幽门螺杆菌多亚单位融合疫苗的实验研究[D]. 袁小澎. 第叁军医大学. 2004
[5]. 治疗性幽门螺杆菌表位疫苗的实验研究[D]. 周维英. 第叁军医大学. 2007
[6]. 幽门螺杆菌ureB基因及其片段的表达和免疫研究[D]. 姚蕾. 浙江工商大学. 2006
[7]. 幽门螺杆菌HspA、UreB基因的克隆及其在植物中的表达研究[D]. 张红欣. 山东大学. 2006
[8]. 幽门螺杆菌外膜蛋白双价亚单位融合疫苗的实验研究[D]. 张卫军. 第叁军医大学. 2006
[9]. 幽门螺杆菌尿素酶B和黏附素A核酸疫苗的研究[D]. 徐灿. 第二军医大学. 2004
[10]. 幽门螺杆菌感染非抗生素治疗研究进展[D]. 王峰. 华中科技大学. 2013
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