基于大孔吸附树脂为载体固定化脂肪酶的制备及表征

论文摘要

生物催化过程具有对环境友好,反应条件温和等优点,因此其在工业化应用所占比例显著增长。随着固定化脂肪酶在工业生产过程的应用日益增长,开发新的催化性能优异的固定化脂肪酶具有重要社会意义和经济价值。基于目前生物催化剂在工业生产中应用的发展趋势,涉及脂肪酶固定化新载体材料的设计和表征的研究也越来越多。因此本课题基于大孔吸附树脂为载体,开发脂肪酶固定化新方法,并对固定化脂肪酶的催化性能和应用进行研究。本论文从以下3个方面进行研究:1.论文首先建立了一种快速灵敏的脂肪酶酯交换活性的荧光测定方法。以叔丁醇溶剂中脂肪酶催化丁酸-4-甲基伞形酮（Bu-4-Mu）与甲醇的酯交换反应作为模型反应。通过检测反应体系在λex=330 nm和λem=390 nm处的荧光强度来确定产物4-甲基伞形酮（4-Mu）的生成量,以确定脂肪酶的酯交换活性。为了验证本检测方法的准确性,使用商品化固定化脂肪酶进行催化反应实验。通过计算脂肪酶催化Bu-4-Mu与甲醇之间的酯交换反应的转化情况,计算获得酶催化反应的表观米氏常数（Km）。本酶活性测定方法的主要优点包括灵敏度高,检测效率高、使用的试剂廉价和操作简单。2.论文开发了大孔树脂NKA吸附作用结合Lipozyme TL 100L交联酶聚集体（CLEA-TLL）的脂肪酶固定化方法。实验对固定化脂肪酶CLEA-TLL@NKA制备的关键影响因素（如有机溶剂类型,交联剂类型及浓度和树脂类型及添加量等因素）进行了研究。实验获得优化后的固定化酶制备条件,使用异丙醇作为沉淀剂,聚乙烯亚胺和戊二醛作为交联剂,制备的固定化酶酯化活性达到6.38U/mg。固定化酶的表面结构通过扫描电子显微镜表征,电镜图片显示CLEA-TLL酶复合物已均匀负载在大孔树脂NKA表层。实验将固定化酶CLEA-TLL@NKA应用于大豆除臭馏出物的甲酯化反应,对催化性能和操作稳定性进行了研究。经过20批固定化酶催化反应后,其酶活性保持在原始活性的90%以上。实验结果表明固定化酶CLEA-TLL@NKA具有高催化活性和良好的操作稳定性,因此在油脂加工领域具有良好的工业应用前景。3.论文开发了以金属有机骨架结构ZIF-8和大孔吸附树脂为载体固定化南极假丝酵母脂肪酶CAL-B的方法。金属有机骨架（ZIF-8）具有多孔性和稳定性等优点,作为酶固定化的载体可以提高固定化酶的稳定性和催化效率等性质。酶固定化优化后工艺如下:首先在2-甲基咪唑与硝酸锌的摩尔比例为40:1,酶蛋白浓度在1.75 mg/mL的条件下合成酶/MOFs（CAL-B-ZIF-8）复合物,然后加入D101大孔吸附树脂和交联剂对CAL-B-ZIF-8进行再固定化,通过真空干燥获得固定化酶CAL-B-ZIF-8@D101。实验对固定化酶CAL-B-ZIF-8@D101的催化性能和表面特性进行表征,结果表明本固定化酶具有很好的有机溶剂耐受性和催化活性。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第一章绪论

1.1 脂肪酶的概述

1.1.1 脂肪酶简介

1.1.2 脂肪酶的基本结构和催化反应机理

1.1.3 脂肪酶在有机相中的催化反应的特性

1.1.4 脂肪酶在有机相中催化酯化反应的主要影响因素

1.2 高通量筛选脂肪酶方法的简介

1.3 酶的固定化方法

1.3.1 吸附法

1.3.2 包埋法

1.3.3 共价法

1.3.4 交联法

1.4 金属有机骨架在固定化酶中的应用

1.4.1 金属有机骨架材料的发展

1.4.2 Enzyme/MOFs的制备方法

1.4.3 金属有机骨架材料在固定化酶中的应用前景

1.5 论文研究的意义和内容

第二章高通量荧光测定脂肪酶酯交换活性方法的建立

2.1 前言

2.2 实验材料

2.2.1 试剂与材料

2.2.2 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 反应模型及溶液配制

2.3.2 荧光检测方法

2.3.3 液相色谱检测方法

2.4 结果与讨论

2.4.1 荧光检测波长的确定

2.4.2 荧光强度与4-Mu浓度之间关系的确定

2.4.3 酶催化反应条件的优化

2.4.4 荧光高通量检测方法的验证实验

2.4.5 商品化脂肪酶动力学参数的测定

2.5 本章小结

第三章基于交联聚集体-大孔树脂吸附技术固定化脂肪酶的制备及其表征与应用

3.1 前言

3.2 实验材料

3.2.1 试剂与材料

3.2.2 实验仪器

3.3 实验方法

3.3.1 固定化酶CLEA-TLL@NKA的制备过程

3.3.2 固定化酶酯化活性的测定方法

3.3.3 CLEA-TLL@NKA的动力学参数及热稳定性测定方法

3.3.4 固定化酶催化SODD甲酯化反应过程

3.3.5 甲酯化率的计算方法

3.3.6 反应液中成分的GC–MS分析方法

3.3.7 扫描电子显微镜（SEM）的检测方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

第四章基于金属有机骨架和大孔树脂吸附技术固定化脂肪酶的制备及其表征

4.1 前言

4.2 实验材料

4.2.1 试剂与材料

4.2.2 实验仪器

4.3 实验方法

4.3.1 固定化酶的制备方法

4.3.2 酯化活性检测方法

4.3.3 扫描电子显微镜（SEM）的检测方法

4.3.4 X射线衍射（XRD）检测样品晶型的方法

4.3.5 动态光散射仪（DLS）检测粒度的方法

4.4 结果与讨论

4.4.1 固定化脂肪酶制备条件的优化

4.4.2 固定化脂肪酶动力学参数的表征

4.4.3 固定化脂肪酶的批次稳定性和热稳定性

4.4.4 有机溶剂耐受性

4.4.5 固定化脂肪酶的结构表征

4.5 本章小节

第五章总结和展望

5.1 总结

5.2 展望

参考文献

致谢

作者简介

1 作者简历

2 攻读硕士学位期间发表的学术论文

3 参与的科研项目及获奖情况

学位论文数据集

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 韦威

导师: 郑建永,汪钊

关键词: 固定化,脂肪酶,酯化活性,大孔吸附树脂,结构表征

来源: 浙江工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 浙江工业大学

分类号: Q814.2

DOI: 10.27463/d.cnki.gzgyu.2019.000293

总页数: 74

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