2型猪链球菌05ZYH33表面蛋白SSU050630的功能研究

论文摘要

猪链球菌（Streptococcus suis）是一种重要的人兽共患病病原菌,目前共分为29个血清型,其中2型猪链球菌（S.suis serotype 2,SS2）的致病性最强,可导致猪和人的多种疾病和死亡,给养猪业和人类生命造成严重威胁,引起国内外学者的广泛关注。本文对2型猪链球菌05ZYH33表面蛋白糖苷水解酶SSU050630的功能进行了系统研究:通过SSU050630结构域分析、基因克隆、蛋白表达和纯化,获得了SsCBM、SsGH16、SsGH20和SsCBM+GH16四个结构域的蛋白,利用上述其中3种蛋白分别免疫日本大耳兔,制备了SsCBM、SsGH16和SsGH20结构域蛋白的多克隆抗体,抗体效价均达到了1:204800;应用信息肽GE9诱导片段转化和同源重组方法,构建了ssu050630基因缺失菌株,通过测定生长曲线和小鼠实验,对05ZYH33野生菌株（WT）和ssu050630Δ基因缺失株的生长特性和毒力进行了比较。结果显示,二者菌落形态、生长曲线及对小鼠致病力方面均无明显差别。为了验证SsGH20结构域蛋白具有β-1-2-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（β-1-2-N-acetylglucosaminidase,NAG）活性,以NP-GlcNAc为底物进行研究,结果显示SsGH20的活力为371 U/mg蛋白、最适反应温度为50℃、最适pH为5.5、Km值为0.69,且仅WT菌株表面具有NAG活性,而ssu050630基因缺失株丧失NAG活性,表明SSU050630是SS2 05ZYH33菌株表面唯一具有NAG酶活性的蛋白,进一步采用含有复杂N-聚糖结构的转铁蛋白为底物,证明SsGH20结构域蛋白能够外切水解复杂N-聚糖中的β-1-2-N-乙酰氨基葡糖糖残基。SsCBM+GH16和SsGH16结构域蛋白的酶活性分析表明,SsGH16不能水解昆布多糖酶底物Laminarin、β-D-Glucan from barley、β-1,3-Glucan from Euglena gracilis,因此不具有昆布多糖酶活性。但是,SsCBM+GH16结构域蛋白能够去除兔、牛和猪红细胞上的异种抗原决定簇αGal,清除率达到99.9%（猪）和98.7%（牛）,因此SsCBM+GH16结构域蛋白与GalC相同,是内切β-半乳糖苷酶。本文采用气相扩散悬滴法对SsGH16结构域蛋白进行了蛋白结晶的初步探索和优化,获得了0.21×0.17×0.33 mm左右的菱形晶体,晶体表面平整,三维立体明显,重复性较好。综上所述,本研究不仅加深了对SSU050630在SS2利用宿主N-聚糖的机制的理解,也为SSU050630在SS2致病中的作用及SS2逃避宿主免疫反应的机制研究奠定基础,同时对降低异源移植排斥提供了一种新的手段。

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摘要

英文摘要

1 文献综述

1.1 猪链球菌的概述

1.2 猪链球菌毒力因子

1.2.1 表面蛋白和分泌蛋白

1.2.2 酶类

1.2.3 转录因子和调节因子

1.2.4 其它新发现的毒力因子

1.3 宿主糖蛋白及病原菌糖苷水解酶

1.4 研究的目的和意义

0630 表达、纯化及多克隆抗体的制备'>2 SS205ZYH33 菌株SSU05₀630 表达、纯化及多克隆抗体的制备

2.1 材料

2.1.1 菌株、质粒与实验动物

2.1.2 培养基和主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 蛋白纯化相关溶液配制

2.2 方法

2.2.1 表达载体构建

2.2.2 蛋白的表达纯化

2.2.3 蛋白的浓缩

2.2.4 蛋白的除盐

2.2.5 动物免疫

2.2.6 ELISA检测抗体效价

2.3 结果

0630 结构域分析及克隆策略'> 2.3.1 SSU05₀630 结构域分析及克隆策略

2.3.2 基因的PCR扩增及重组质粒双酶切鉴定

2.3.3 蛋白的表达与纯化结果

2.3.4 蛋白的浓缩和除盐结果

2.3.5 兔多克隆抗体效价的检测结果

2.4 讨论

2.5 小结

0630 基因缺失株构建'>3 SS205ZYH33 菌株ssu05₀630 基因缺失株构建

3.1 材料

3.1.1 菌株、质粒

3.1.2 培养基和主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 引物设计与信息肽

0630 基因缺失片段的构建'> 3.2.2 ssu05₀630 基因缺失片段的构建

0630 基因缺失株ssu05₀630Δ的构建'> 3.2.3 ssu05₀630 基因缺失株ssu05₀630Δ的构建

0630Δ缺失株鉴定'> 3.2.4 ssu05₀630Δ缺失株鉴定

0630Δ菌株的生长特性'> 3.2.5 SS205ZYH33 野生菌株（WT）和ssu05₀630Δ菌株的生长特性

0630Δ菌株的毒力比较'> 3.2.6 SS205ZYH33 野生菌株（WT）和ssu05₀630Δ菌株的毒力比较

3.3 结果

0630 基因缺失片段的构建'> 3.3.1 ssu05₀630 基因缺失片段的构建

0630Δ缺失株鉴定结果'> 3.3.2 ssu05₀630Δ缺失株鉴定结果

0630Δ菌株的生长特性比较'> 3.3.3 SS205ZYH33 野生菌株（WT）和ssu05₀630Δ菌株的生长特性比较

3.3.4 动物感染实验结果

3.4 讨论

3.5 小结

0630 糖苷水解酶结构域功能探析及SsGH16 结构域蛋白结晶条件摸索'>4 SS205ZYH33 菌株SSU05₀630 糖苷水解酶结构域功能探析及SsGH16 结构域蛋白结晶条件摸索

4.1 材料

4.1.1 菌株、蛋白与实验动物

4.1.2 培养基和主要试剂

4.1.3 主要仪器

4.2 方法

0630 序列分析'> 4.2.1 SSU05₀630 序列分析

4.2.2 Ss GH20 结构域蛋白活性鉴定

4.2.3 Ss CBM+GH16 与Ss GH16 结构域蛋白活性鉴定

4.2.4 Ss GH16 结构域蛋白的结晶

4.3 结果

0630 序列分析'> 4.3.1 SSU05₀630 序列分析

4.3.2 Ss GH20 结构域蛋白活性测定

4.3.3 Ss CBM+GH16 与Ss GH16 蛋白活性测定

4.3.4 Ss GH16 蛋白的结晶结果

4.4 讨论

4.5 小结

全文总结

参考文献

致谢

个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈平

导师: 刘思国

关键词: 型猪链球菌,基因缺失,乙酰氨基葡萄糖苷酶,蛋白结晶

来源: 黑龙江八一农垦大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 黑龙江八一农垦大学

基金: “十三五”国家重点研发计划:“畜禽重要病原菌的病原组学与网络调控研究”项目(2017YFD0500200)子课题“病原菌毒力调控机制研究”(2017YFD0500203),国家自然科学基金青年项目(31500112),国家自然科学基金面上项目(31772757),黑龙江省科学基金面上项目(C2017075)

分类号: S852.61

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