高灵敏全基因组DNA扩增方法的建立及其应用研究

论文摘要

最近几年,随着高通量测序、质谱等一系列高通量技术的发展,各种组学研究方法层出不穷。尤其是高灵敏度微量核酸扩增技术的发展,使得基因功能研究在单细胞水平上得到了一系列突破,为细胞异质性的研究提供了可能。许多重要的临床诊断上所能依赖的样品是极少量细胞、DNA或者RNA分子,所以,高灵敏度和特异性的全基因组扩增技术（WGA）的研究除了可以开拓科学研究领域并促进其发展,在临床诊断上也具有广泛的应用前景。在本研究中,我们建立并优化了三种目前比较常用的微量DNA扩增技术如多重链替换扩增、多次退火环状循环扩增,以及基于MMLV的逆转录扩增技术,并对微量细胞ATAC-seq的方法进行了探索。首先,我们对这些扩增技术的关键酶进行了克隆,并使用高度特异性的E.coli表达系统对这些重组蛋白进行了纯化。然后,我们使用这些关键酶构建了高度灵敏的全基因组扩增方法,并系统性地比较和优化了这些扩增方法。本研究得到如下结论:（1）这三种全基因组扩增方法会对系统中细菌基因组片段产生非特异性扩增,这些污染的细菌基因组片段来源于纯化的酶。这些体系中残留的少量大肠杆菌基因组片段会在目的基因组拷贝数少的情况下产生干扰。（2）三种基因组扩增方法对低浓度模板扩增时,均匀性都存在不同程度的偏差,尤其是在指数扩增之后。相比较而言Phi129-MDA的均匀性在三者中较好,灵敏度也较高,但其扩增效率没有其他两者高。（3）在败血症的扩增检测中,我们使用了BstL-MDA的方法,该方法在该项目的检测中突显了一系列的优势:操作简单、扩增效率较高、扩增时间相对较短,因为时间在细菌感染的败血症的临床诊断上至关重要。除此之外,我们对高灵敏度的RNA扩增方法进行了初步的探索,并构建了高效逆转录体系,该逆转录酶的温度耐受性较好。总的来说,我们构建了三种高效的WGA方法,并系统地比较了它们在研究和分子诊断上的潜力。后续也将不断优化这些方法,并将逆转录、基因组扩增技术以及微量细胞ATAC相结合,希望将这些方法用于单细胞相关的DNA和RNA分析上,为基础科学研究和临床应用提供有效的研究工具。

论文目录

摘要

Abstract

第一章前言

1.1 微量核酸扩增技术

1.1.1 全基因组扩增技术

1.1.2 逆转录扩增技术

1.2 微量核酸扩增技术的应用

1.2.1 胚胎植入前遗传学诊断

1.2.2 在微量DNA样品检测中的应用

1.2.3 染色质可接近性的检测

1.3 单细胞相关研究

1.3.1 单细胞研究的现状

1.3.2 单细胞研究的应用

1.4 本文研究目的及意义

第二章材料与方法

2.1 常用试剂与耗材

2.2 实验仪器

2.3 DNA相关实验方法

2.3.1 相关质粒载体和大肠杆菌菌株

2.3.2 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.3.3 质粒DNA的转化

2.3.4 质粒DNA的提取

2.3.5 目的基因的克隆

2.3.6 将目标基因克隆至表达载体的步骤总结

2.4 蛋白相关实验方法

2.4.1 目标蛋白的表达检测

2.4.2 目标蛋白的大量表达

2.4.3 目标蛋白的相关检测

2.4.4 目标蛋白的酶活性检测

2.5 细胞相关实验方法

2.5.1 细胞的复苏与冻存

2.5.2 细胞的传代

2.5.3 细胞基因组的提取

2.5.4 细胞总RNA的提取

2.6 基因组相关实验方法

2.6.1 全基因组扩增

2.6.2 转座酶作用于染色质的实验（ATAC）

2.7 转录组相关实验方法

2.7.1 RNA的逆转录

2.7.2 cDNA的荧光定量检测

2.8 基因组扩增产物相关检测方法

2.8.1 基因组扩增效率检测体系

2.8.2 基因组扩增污染检测体系

2.8.3 基因组扩增产物均衡性检测体系

2.8.4 ATAC扩增产物的检测

第三章结果与讨论

3.1 微量核酸扩增体系的构建

3.1.1 BstL扩增体系的构建

3.1.2 Phil29扩增体系的构建

3.1.3 Prim-pol体系的构建

3.2 微量DNA扩增技术的相关检测

3.2.1 扩增灵敏度检测

3.2.2 扩增产物污染检测

3.2.3 扩增产物均匀性检测

3.3 微量DNA扩增技术的应用

3.3.1 血斑相关实验

3.3.2 败血症相关实验

3.3.3 微量细胞ATAC实验

3.4 逆转录扩增技术的构建以及相关检测

3.4.1 MMLV扩增体系的构建

3.4.2 温度耐受性检测

3.4.3 不同模板起始量的灵敏度检测

3.5 讨论与展望

附录一: 图表索引

附录二: 缩略词以及中英文对照

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 边成林

导师: 张永有

关键词: 全基因组扩增,微量核酸,单细胞

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 厦门大学

分类号: Q78

总页数: 109

文件大小: 6601K

下载量: 20

高灵敏全基因组DNA扩增方法的建立及其应用研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢