邸禄芹, 张小兵, 吴萌, 闫静辉[1]2012年在《抗磺胺对甲氧嘧啶单克隆抗体的研制及其特性分析》文中认为目的制备针对磺胺对甲氧嘧啶的单克隆抗体,建立对该物质的免疫学检测方法。方法以BSA-磺胺对甲氧嘧啶为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠Sp-2/0骨髓瘤细胞融合后,经筛选和亚克隆,建立杂交瘤细胞株。结果获得2株能稳定分泌抗磺胺对甲氧嘧啶抗体的细胞株。对抗体进行了特性分析,抗体的效价分别为1∶400 000和1∶1 630 000,抗体类型及亚类都为IgG1。其中,单克隆抗体1H10的亲和力为1.4×109L/mol,利用该抗体采用竞争间接ELISA法检测磺胺对甲氧嘧啶的范围是1025～16μg/mL,最低检测浓度是8μg/mL。单抗1H10与其他6种磺胺药(SMM、SMZ、SM2、SD、Sulfaquinoxaline Sodium、Sulfametopyrazine)无交叉反应。结论单克隆抗体1H10可用于研制免疫学方法检测磺胺对甲氧嘧啶残留的产品。
彭会建[2]2003年在《磺胺对甲氧嘧啶单克隆抗体的制备及应用》文中认为磺胺类药物有广泛的抗菌特性，经常用于防治动物的疾病，这也导致了在可食用动物组织中的残留，最终对食品卫生和人类健康造成危害。 许多国家已经规定磺胺药在人类食用组织中的残留限量为0.1mg／kg。国内外已建立了很多理化方法检测动物性食品中残留的磺胺药。虽然有些方法比较灵敏精确，但由于花费大、时间长、技术要求高等原因而不适合大批量样品的筛选。作为一种快速、灵敏、特异的方法，酶联免疫吸附测定正逐渐应用于药物的残留检测。本研究通过抗原的合成和抗体的制备，建立了SMD的ELISA测定方法，并检测了实验条件下鸡和猪体内SMD的残留变化。 为了制备针对SMD的单克隆抗体，用戊二醛将SMD偶联到牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。用紫外分光光度计进行了扫描鉴定。本偶联方法是通过SMD的N~4端偶联到载体蛋白上，在这种情况下，特异的N~1端被免疫系统识别，这最终导致产生针对SMD的高特异性的抗体。 将100μl含50μg SMD-BSA偶联物的PBS与100μl的福氏完全佐剂制成乳剂，用其注入7周龄的BALB／c小鼠的腹部皮下。每隔2～3w后，用100μl含25μg SMD-BSA偶联物的PBS与100μl的福氏不完全佐剂制成乳剂进行增强免疫。经过3次增强免疫后，小鼠进行最后一次抗原冲击，3d后取其脾细胞。新鲜的脾细胞用来与骨髓瘤细胞进行融合。用间接ELISA和间接竞争ELISA来筛选阳性细胞。阳性孔的上清可与SMD-OVA反应，且这种反应可被SMD竞争。 用有限稀释法将阳性孔细胞进行克隆(重复叁次)。最终产生了叁株稳定分泌针对SMD抗体的细胞：3E8、4A7、2D2。将3E8细胞注入5只BALB／c小鼠的腹腔，制备出腹水。 建立起间接竞争ELISA的测定方法。以SMD浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，作标准曲线。用这种方法确定的检测限为1.766ng／ml，定量限为11.274ng／ml。为检验抗体的特异性，用SD、SMM、SQ等8种药物作为竞争抗原，做ELISA，结果显示与这8种磺胺药没有交叉反应。 为了验证实际检测效果，鸡和猪在给予一定剂量的SMD后，采集肝、肾、血清等样品，并进行了检测，结果显示，在鸡上，SMD的休药期至少为14d。
方钲[3]2010年在《磺胺对甲氧嘧啶胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制》文中认为磺胺对甲氧嘧啶(Sulfametoxydiazine,SMD)是磺胺类药物的一种,其抗菌范围广、副作用小,乙酰化率低,且溶解度高。兽医临床上SMD常用于敏感菌所致的泌尿生殖道感染、呼吸道感染、消化道感染和皮肤软组织感染及作饲料添加剂。但大量或长期使用可使其在动物体内蓄积,造成药物残留,对人类的健康构成潜在危害。胶体金免疫层析技术具有方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点,因而特别适合于广大基层兽医人员用来大批量检测和大面积普查等,具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。本试验应用胶体金免疫层析技术,进行磺胺对甲氧嘧啶残留检测方法的研究,以期建立一种快速检测磺胺对甲氧嘧啶残留的方法。1、SMD单克隆抗体的制备及鉴定。本研究将杂交瘤细胞株接种到小鼠体内,采用体内诱生腹水法制备了单抗的腹水。用重氮法和戊二醛法将SMD偶联到牛血清白蛋白(BSA),制成了人工抗原SMD-BSA,并用紫外分光光度计进行了扫描鉴定。腹水经辛酸-硫酸铵法纯化后,单抗蛋白浓度为2.27mg/mL,用包被抗原SMD-BSA对单抗进行质量鉴定,抗体工作浓度为1：10000,抗原工作浓度为1：4000,用确定的最佳抗原抗体工作浓度进行CiELISA测定,标准曲线为Y=0.2962X+0.0684(R2=0.9952),计算出IC50为28ng/mL,LOD为1.91ng/mL,LOQ为8.63ng/mL，通过对其他六种磺胺类药物的交叉反应实验表明该SMD单抗特异性较好。2、SMD胶体金快速检测试纸条的研制。采用柠檬酸叁钠还原法制备24nm胶体金,鉴定后用胶体金标记纯化后的单克隆抗体,并将金标抗体吸附在玻璃纤维素膜上。将抗原SMD-BSA和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜上组装成试纸条。然后对试纸条的各个条件进行优化,确定了最佳条件。用该试纸条检测SMD标准液,检测限为100ng/mL。试纸条对SQ、SD、ST、SMZ、SDM、SA交叉反应较弱,特异性较好。经测试,不同批次间试纸条重复性较好,4℃条件下可保存10周。3、SMD胶体金快速检测试纸条的初步应用。对牛奶、鸡蛋、蜂蜜样本进行添加回收试验,经检测在牛奶中的药物添加回收率为85.3%～104.6%；鸡蛋中的添加回收率为：81.4%～113.1%；蜂蜜中的添加回收率为73.8%～89.2%。并用处理过的无SMD成份的牛奶、鸡蛋、蜂蜜样本添加SMD标准液,用试纸条进行检测,符合率分别为88%、84%、76%。实验表明,本实验所制试纸条可用于动物食品中磺胺对甲氧嘧啶残留的检测,也为其他兽药残留检测试纸条的研制提供了借鉴。
张梦[4]2015年在《磺胺氯吡嗪钠化学发光免疫分析方法的建立》文中研究表明磺胺氯吡嗪钠(sulfachlorpyrazine sodium,SPZ)是磺胺类药物的一种,在兽医临床上用来治疗家禽球虫病。若大剂量使用或不遵守休药期规定,药物易在动物体内蓄积,威胁人类健康。免疫学检测方法作为兽药残留大规模检测的主要方法,具有特异性强,灵敏度高等特点。目前国内外关于SPZ残留的酶联免疫检测方法(ELISA)的报道较少,未见关于SPZ的化学发光免疫分析(CLIA)检测方法的报道。本文制备了SPZ的单克隆抗体,在此基础上建立CLIA方法;同时对磺胺药物多残留快速检测技术进行探索,合成了药物的母核抗原-磺胺噻唑(TS)并制备其多克隆抗体,分别用ELISA方法和CLIA方法对抗体进行鉴定。1、SPZ单克隆抗体的制备及鉴定。本实验通过重氮化方法制备了完全抗原SPZ-OVA,免疫小鼠4次后,选取血清抗体效价较好的小鼠脾细胞进行细胞融合。经过筛选并将阳性克隆按有限稀释法亚克隆3次,得到稳定分泌抗体的细胞株。将细胞株扩大培养后,腹腔注射小鼠制备腹水。将腹水单克隆抗体D9纯化后通过间接ELISA确定包被原最佳浓度为0.01μg/m L,单抗的工作浓度为1:4×105,在最佳抗原抗体工作浓度下进行ci-ELISA实验,建立标准曲线,得到曲线线性方程为y=-0.3369x+1.347,R2=0.994,计算得抗体半数抑制浓度(IC50)为326ng/m L;与其他测试药物的交叉反应小于5%,表明单抗特异性良好。2、SPZ化学发光免疫检测(CLIA)方法的建立。在单克隆抗体Mab D9的基础上建立SPZ的CLIA方法,在0.02-4μg/m L的范围内,SPZ浓度的对数值与相对发光值呈线性关系,线性方程为y=-0.3602x+1.2874,R2=0.981,IC50值为151ng/m L;标准曲线的批内变异系数为7.02%,批间变异系数为8.5%;鸡肉样品最低检测限为36.3ng/g,样品添加回收率在75%-85%之间。3、磺胺类药物族特异性抗体的制备。首先合成磺胺母核结构TS,然后用碳二亚胺(EDC)法合成免疫原TS-BSA,将其免疫小鼠后,对抗血清进行筛选,得到两只小鼠血清效价分别为1:2.56×105和1:1.28×105;选用效价高的小鼠血清进一步检测。经ci-ELISA实验和CLIA实验测得抗体对TS的IC50值分别为33ng/m L和7.9ng/m L;与供试磺胺药物中含有五元杂环的药物有较强交叉反应(CR>26%);与部分六元杂环药物有一定的交叉反应(1%<CR<11%);与磺胺氯吡嗪钠(SPZ)和磺胺二甲嘧啶钠(SM2)无交叉反应(CR<0.01%)。实验表明抗体与多种R基结构的SAs可产生交叉反应。
郭延成[5]2010年在《磺胺类药物残留多联检试纸条快速检测技术研究》文中进行了进一步梳理磺胺类药物是一类人工合成的具有氨苯磺胺结构的广谱抗菌类药物,由于其疗效确切、价廉易得,被广泛应用于动物原虫病和细菌性疾病的预防和治疗。该类药物在动物临床上长时间低剂量或治疗时高剂量等不合理使用,容易造成在动物性食品中的残留,从而对人类健康造成潜在的威胁。目前,磺胺类药物残留检测的主要方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC)。但是这些检测方法操作烦琐,需要特殊仪器和专业人员操作,不适合于对大量样品的快速检测和筛选。胶体金免疫层析检测法(试纸条)是一种新型的快速检测方法,它具有易于保存,携带方便,操作简单、快速,分析结果易于判读,不需要专人操作和检测成本低等优点,非常适用于现场检测和对大量样品的筛选。本研究是在本实验室磺胺类药物单残留检测的基础上,通过筛选针对磺胺类药物特异性单克隆抗体和增加检测线条数建立了磺胺类药物多残留检测方法,并进行了初步应用研究,取得了如下结果。1.磺胺二甲基嘧啶(SM2)人工抗原的合成与单克隆抗体的制备利用重氮化法将磺胺二甲基嘧啶(SM2)与人血清白蛋白(HSA)和卵清白蛋白(OVA)相偶联,制成人工合成抗原HSA-SM2和OVA-SM2。通过可见光-紫外扫描对其进行鉴定,结果表明成功获得了上述偶联物。用HSA-SM2作为免疫原免疫BALB/c小鼠,用OVA-SM2作为包被原检测免疫效价与细胞培养上清,经细胞融合和五次克隆筛选得到8株抗SM2的特异性单克隆抗体株,其中以细胞株4D6和2G6所分泌抗的亲合力最强和效价最高,对上述2株单克隆抗体进行了详细的分析和鉴定。2.磺胺二甲基嘧啶(SM2)胶体金免疫层析快速检测试纸条的制备与初步应用利用单克隆抗体4D6标记胶体金作为示踪物,利用人工合成抗原HSA-SM2 (1:6)作为检测线,利用兔抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线,制备SM2胶体金免疫层析快速检测试纸条,并对其灵敏度,特异性进行鉴定。该方法天内(Intra-day)变异系数在5.9%-8.4%之间；天间(Inter-day)变异系数在6.3%-9.3%之间,均小于15%。动物试验表明,本方法与高效液相色谱两种检测方法的阳性符合率为95.1%(21/22),阴性符合率为97.7%(42/43),总符合率为96.9%(62/64)。市场样品检测表明,两种检测方法的阳性符合率为90%(9/10),阴性符合率为99.7%(350/351),总符合率为99.4%(358/360)。3.磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺嘧啶(SD)与磺胺喹恶啉(SQX)残留叁联检胶体金免疫层析快速检测纸条的制备及初步应用利用单克隆抗体3A9制备SM2, SD和SQX残留叁联检胶体金免疫层析快速检测试纸条,并对其进行优化。该方法天内(Intra-day)变异系数在3.5%-7%之间;天间(Inter-day)变异系数在3%-8%之间,均小于15%。动物实验表明,本方法与高效液相色谱两种检测方法的阳性符合率为95.5%(21/22),阴性符合率为99.2%(122/123),总符合率为98.6%(142/144)。市场样品检测结果表明,两种检测方法的阳性符合率为93.3%(14/15),阴性符合率为99.8%(545/546),总符合率为99.6%(558/560)。4.磺胺类药物残留六联检胶体金免疫层析快速检测试纸条的制备及初步应用在叁联检试纸条的基础上,利用单克隆抗体2G6、SD4、SDL4、3A9制备磺胺类药物残留六联检胶体金免疫层析快速检测试纸条,并对其进行优化。该方法天内(Intra-day)变异系数在3.5%-9%之间；天间(Inter-day)变异系数在3%-10.2%之间,均小于15%。动物实验结果表明,本方法与高效液相色谱两种检测方法的阳性符合率为99.0%(95/96),阴性符合率为98.9%(89/90),总符合率为98.9%(182/184)。市场样品检测结果表明,本方法与高效液相色谱两种检测方法的阳性符合率为93.3%(14/15),阴性符合率为99.8%(545/546),总符合率为99.6%(558/560)。
徐乃丰[6]2015年在《水产品中叁类重要化学残留物快速检测方法的研究》文中研究说明水产养殖业近年来蓬勃发展,但同时面临着国际贸易技术壁垒的不断增强以及国内由于药物滥用而导致的各类水产品安全问题的巨大挑战。“打铁还要自身硬”。最彻底的解决办法还是建立合适的检测方法和监管体系加以防范,从根本上杜绝隐患。氯霉素、孔雀石绿、磺胺二甲基嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶作为水产品中残留问题较为突出的药物,建立更加严格的筛查办法已势在必行。酶联免疫分析法和侧流免疫分析法用于检测这叁大类化学残留物具有便捷快速,高效稳定等特点,适合水产品残留的现场检测。本课题从高效抗原的合成和筛选着手,经过细胞融合后,进一步筛查制备单克隆抗体,并开发相应的快速检测方法。首先从特征性功能基团着手,通过混合酸酐法和碳二亚胺法等方法,以不同的摩尔反应比合成多种氯霉素抗原,经过紫外和凝胶电泳法鉴定后免疫动物,通过ELISA检测筛选免疫效果最好的免疫原、对应的检测抗原和免疫小鼠。经过细胞融合和亚克隆,筛选出超灵敏的抗氯霉素单克隆抗体6F11。通过对主要影响因素的优化,确定了工作条件为:以CAP-OVA作为检测抗原,以0.01mol/L p H 6.5的PBS溶液稀释后进行包被,实验过程中调节洗液和抗体稀释液的p H至7.0,显色时间为15 min。在优化条件下,ic-ELISA方法的IC50为0.010 ng/m L,线性范围(IC20~IC80)为0.003 ng/m L~0.040ng/m L。其对氯霉素叁种结构类似物(FFC、FFA和TAP)都没有交叉反应。通过牛奶阴性样本的添加回收实验,ic-ELISA方法的回收率在98.9%~106.8%之间,变异系数小于10%。为节约大批量样本的现场检测时间,研究并建立了一步法检测的标准曲线,单抗的IC50为0.025 ng/m L,线性范围为0.009 ng/m L~0.067 ng/m L。基于侧流免疫原理建立了氯霉素金标试纸条,金标抗体的工作条件为:1 m L胶体金溶液中,0.1mol/L K2CO3添加量为4?L,氯霉素单抗添加量为15?g,NC膜上包被氯霉素检测抗原CAP-BSA浓度为0.8 mg/m L。优化并检测了牛奶中的氯霉素残留,裸眼观察判断检测限为0.3 ng/m L,用T线的颜色深度值建立标准曲线的检测限为0.263ng/m L,线性范围为0.116 ng/m L~0.596 ng/m L。金标试纸条与ic-ELISA法检测结果相一致,可以满足牛奶中氯霉素残留的检测要求。检测鱼肉中的氯霉素残留,裸眼观察判断检测限为0.2 ng/g,检测灵敏度可达到0.1 ng/g,该方法也适于水产品中氯霉素残留的现场快速筛查。以同样的思路制备了高灵敏的抗孔雀石绿单克隆抗体2E10,并建立了鱼肉中孔雀石绿残留的ic-ELISA检测方法。通过对主要影响因素的优化,确定了工作条件为:以CEO50作为检测抗原,以0.01mol/L p H 6.5的PBS溶液稀释后进行包被,实验过程中调节洗液和抗体稀释液的p H至5.0,显色时间15 min。在此条件下,ic-ELISA方法的IC50值为0.057 ng/m L,线性范围为0.02 ng/m L~0.162 ng/m L。其对结晶紫的交叉反应率为90.4%,与其他叁苯甲烷类物质没有交叉反应。通过鱼肉样本的添加回收实验,此方法的回收率在98.5%~116.3%之间,变异系数小于10%。基于侧流免疫原理建立了孔雀石绿金标试纸条,金标抗体的工作条件为:1 m L 30 nm胶体金使用浓度为5 nmol/L,酶标二抗添加浓度为0.3 mg/m L,抗体添加浓度为0.2mg/m L,NC膜上包被4.5 mg/m L的检测抗原(CEB30)。通过添加回收建立鱼肉中叁苯甲烷类物质残留的检测方法,孔雀石绿总量和结晶紫总量的IC50分别为0.418 ng/g和0.532 ng/g,与孔雀石绿其他类似物无交叉反应。应用于水产品阳性样本检测,确定孔雀石绿的残留量为195 ng/g样本,实验重复性较好。筛选高效的完全抗原,进而制备高灵敏的抗磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体10D6,建立ic-ELISA法检测的IC50值为0.221 ng/m L,线性范围为0.074 ng/m L~0.667 ng/m L,将此方法应用于鱼肉中添加回收实验,平均回收率为79.6%~108.6%,变异系数小于10%。筛选高效的完全抗原,进而制备高灵敏的抗磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体6C11,优化实验条件后,所建立ic-ELISA法检测的IC50值为0.419 ng/m L,线性范围为0.158ng/m L~1.110 ng/m L将此方法应用于鱼肉中添加回收实验,平均回收率为96.3%~128.1%,变异系数小于10%,表明此方法检测水产品中药物残留的可行性。
王刘花, 许杨, 郭杰标, 张泓, 何庆华[7]2010年在《磺胺嘧啶单克隆抗体的制备与鉴定》文中研究说明采用重氮法同时制备结合比分别为9.0、8.0、3.7的3种磺胺嘧啶免疫抗原,并将其免疫BALB/c小鼠,其中结合比为8.0的一组免疫效果最佳。获得一株稳定分泌抗磺胺嘧啶单克隆抗体的杂交瘤细胞(1F6),体内诱生法制备腹水。间接ELISA测定腹水效价为1:1.28×106,建立间接竞争ELISA标准曲线,其检测下限为10.4ng/mL,线性范围为14.8～421.5ng/mL,IC50值为79.1ng/mL,与磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶交叉反应率分别为0.3%、0.99%、4.5%,与磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉、对氨基苯甲酸、磺胺、对氨基苯磺酸未见有交叉反应。经鉴定,单克隆抗体免疫球蛋白为鼠IgG的2b亚类。
王啊娟[8]2015年在《磺胺对甲氧嘧啶—量子点免疫层析试纸条的研制》文中提出量子点作为一类半导体纳米材料,具有激发光谱宽、发射光谱窄且对称、荧光量子产率高、光耐受性强、荧光寿命长、斯托克位移较大等独特的光学性能,使其在生物医学、光电子学、物理学、材料学及重金属、农兽药残留检测等领域得到了广泛的应用。本文研究了CdTe和CdTe/ZnS核壳型量子点的制备及表征,并结合量子点技术与免疫层析技术研制了快速检测猪肉中残留的磺胺对甲氧嘧啶(SMD)免疫层析试纸条,为动物源性食品中磺胺对甲氧嘧啶残留的大批量快速检测提供了新方法。本文采用巯基乙酸(TGA)和谷胱甘肽(GSH)共同作为稳定剂,在水相中制备了高性能的亮黄色CdTe/ZnS核壳型量子点。首先探讨了反应条件对CdTe量子点光学性能的影响,在最佳的CdTe量子点合成条件下进一步探讨了包核反应时间、温度、pH值及反应体系各组分比例等参数对CdTe/ZnS核壳型量子点光学性能的影响。通过UV-vis、FL、TEM、XRD及FT-IR表征方法得出：[TGA]:[GSH]为1：1时,所制备的CdTe/ZnS核壳型量子点的荧光量子产率高达42%；该纳米粒子为立方晶系纤锌矿型,平均粒径约为3.5nm,分散性好,室温放置一个月后荧光强度反而增加了38%。本文通过EDC和NHS偶联剂的连接作用,将纯化后的CdTe/ZnS量子点标记SMD单克隆抗体,并将量子点标记的抗体喷涂在结合垫上。同时,在NC膜上标记好包被抗原(SMD-BSA)和羊抗鼠二抗IgG,分别作为检测线(T线)及质控线(C线),最后组装成试纸条,并对其各组成成分及层析条件进行优化,确定了最佳条件。使用该试纸条检测出SMD标准品的检测限为50ng/mL,仅与磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶有较弱的交叉反应,特异性和重复性好,可在4℃下保存九周以上。应用该试纸条检测猪肉样品中SMD的残留,检测限为100ng/g,样本符合率为86.6%。该试纸条检测灵敏度高、特异性强,可在8min内完成快速检测,适用于动物源性食品中磺胺对甲氧嘧啶残留的大批量快速检测。
杜玉玲[9]2013年在《磺胺类药物多残留ELISA快速检测试剂盒与胶体金免疫层析试纸条的初探》文中进行了进一步梳理实验中采用4-氨基苯甲酸甲酯(PBPA)和对乙酰氨基苯磺酰氯(ASC)为原料，经过亲和取代，酯的水解反应合成磺胺药物共有的母核结构苯甲酸对氨基苯磺酰胺(SH)，应用质谱法(ESI-MS)与核磁共振氢谱法(~1H-NMR)鉴定SH。质谱结果显示[M-]=291.03766，与理论值[M]=292相符，表明SH合成成功；核磁共振氢谱(~1H-NMR)的数据与SH化合物的结构相符。磺胺母核人工半抗原合成成功。实验采用混合酸酐法将本实验室合成的磺胺类药物母核结构物(SH)与卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白（BSA）相偶联，进而合成包被原OVA-SH和免疫原BSA-SH。紫外扫描(UV)与SDS-PAGE法进行确证。利用BSA-SH免疫Balb/C小鼠，间接ELISA和间接竞争ELISA法筛选细胞融合备用鼠；利用细胞融合杂交瘤技术建立了SH Mab细胞株，后体内诱生腹水法制备SHMab。对SH Mab的效价、特异性和敏感性等免疫学特性进行鉴定。结果显示BSA-SH人工抗原合成成功，SH与BSA的分子结合比约为11.6：1。5G_1、5G_2和8D_23株敏感特异性的杂交瘤细胞株被成功筛选。其细胞上清液效价分别为：1：6.40×10~2、1：1.28×10_3和1：3.20×10~2，腹水效价分别为：1：2.56×10_5、1：5.12×10_5和1：1.28×10_5。5G_2株所产腹水纯化后所得Mab对SH的半数抑制浓度(IC_(50))为82ng/mL。纯化后Mab对磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺对甲氧嘧啶（SMD）、磺胺甲基嘧啶（SM）、磺胺间二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺醋酰（SCT）、磺胺氯吡嗪钠（SCZ）、磺胺噻唑（ST）、磺胺甲恶唑（SMZ）、磺胺苯吡唑（SPH）、磺胺二甲嘧啶（SM_2）、氨苯磺胺（SSF）和磺胺喹恶（SQ）的交叉反应率分别为：108%、86%10_5%、85.6%、72%、26%、32%、54.6%、43%、4.6%、0.5%和76%。获得了抗磺胺母核SH高效价、敏感、特异的Mab。实验将卵清白蛋白（OVA）与磺胺母核人工半抗原（SH）采用混合酸酐法，按投料比1:2连接制备了包被原（SH-OVA），后将辣根过氧化物酶（HRP）与SH-OVA采用过碘酸钠法，按投料比2：1连接制备了酶标抗原（SH-OVA-HRP）。直接竞争ELISA方法通过药物竞争试验被确定，在0-1000ng/mL浓度范围直接竞争ELISA建立标准曲线方程程为：y=-0.4016x+1.2187，相关系数R~2=0.97，半数抑制浓度(IC_(50))为61.60ng/mL。SH酶联免疫检测试剂盒雏形初步研制成功。每2个月随机抽检其稳定性，4个月后稳定性良好。利用得到的Mab研制出了检测磺胺类药物多残留胶体金免疫层析试纸条雏形。试纸条用间接竞争法，选用20nm的胶体金，在pH7.8，单抗17μg/mL条件下制备金标抗体。检测线为SH-OVA，质控线用羊抗鼠IgM抗体，两条线都包被在硝酸纤维素膜上。随后对试纸条的使用材料、溶液和各种工艺进行了优化。
刘百红[10]2006年在《磺胺类药物残留ELISA快速检测试剂盒的研制》文中认为本研究通过单克隆抗体的纯化，直接竞争ELISA方法的确立，样品提取方法的优化，直接竞争ELISA标准曲线的建立，动物试验以及与国外同类试剂盒和仪器方法的比较，建立了检测食源性动物产品中磺胺嘧啶和磺胺类药物残留的两种ELISA检测方法，并在此基础上相应地研制出两个快速检测试剂盒。研究结果如下： 1、利用本实验室已有的抗磺胺嘧啶单克隆抗体细胞株(SD-4)经复苏、筛选、生产、纯化得到抗磺胺嘧啶单克隆抗体。用重氮化—偶联法将磺胺嘧啶(SD)与卵清白蛋白(OVA)按投料摩尔比2:1连接制备了包被抗原(SD-OVA)，用过碘酸钠法将SD-OVA与辣根过氧化物酶(HRP)按投料摩尔比1:2连接制备了酶标抗原(SD-OVA-HRP)。药物竞争试验确定了直接竞争ELISA方法；将常规包被与微波包被法从方法的灵敏度、包被时间、包被稳定性进行比较，确立微波包被法。直接竞争ELISA试验在1ng／mL～729ng／mL浓度范围建立标准曲线方程y=12.05x+2.2538，线性相关系数R~2=0.995，IC_(50)为41.7ng／mL。与磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺对甲氧嘧啶(SMD)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺二甲嘧啶(SM_2)、磺胺喹恶啉(SQ)及磺胺甲恶唑(SMZ)的交叉反应率分别为：1.7％、3.1％、＜0.01％、＜0.01％、＜0.01％、3.4％。建立了猪肉、鸡肉、鸡肝、鸡蛋、牛奶中SD提取方法，进而研制出SD酶联免疫检测试剂盒，在猪肉、鸡肉、鸡肝中定量限为20μg／kg，回收率70％～110％，批间变异系数＜26％；在鸡蛋、牛奶定量限为5μg／kg，回收率60％-120％，批间变异系数＜32％。与同类试剂盒比较，结果表明自制试剂盒与英国试剂盒准确度、精密度水平相当，灵敏度低于英国试剂盒。饲喂仔肉鸡含500mg／kg SD饲料7d，停药后连续检测5d，自制试剂盒测定鸡肉中SD残留量与高效液相色谱法(HPLC)测定结果相近。同时，饲喂蛋鸡含400mg／kg SD饲料5d，停药7d连续检测，自制试剂盒与国外试剂盒测定结果相符合。 以上结果表明，本研究研制的试剂盒能够满足猪肉、鸡肉、鸡肝、鸡蛋、牛奶中SD残留检测要求，试剂盒研制工作基本完成。 2、利用本实验室已有的抗磺胺类药物单克隆抗体的细胞株(SDL-4)采取与SD-4株细胞相同步骤得到抗磺胺类药物单克隆抗体。采用混合酸酐法将本实验室合成的磺胺类药物母核结构药物(SDL)与人血清白蛋白(HSA)按投料摩尔比2:1连接制备了包被抗原SDL-HSA，用过碘酸钠法将SDL-HSA与辣根过氧化物酶(HRP)按1:2连接制备了酶标抗原(SDL-HSA-HRP)直接竞争ELISA方法10ng／mL～2430ng／mL范围建立标准曲线方程y=14.571x+2.2619，R~2=0.987，IC_(50)为153.0ng／mL，与SMM、SMD、SQ、SDM、SD、SM_2、SMZ、磺胺甲氧嗪(SMP)和叁甲氧苄氨嘧啶(TMP)的交叉反应率分别为：166.8％、100％、105％、38.7％、11.9％、4.9％、＜0.01％、12.0％、＜0.01％。建立猪肉、鸡肉组织中SAs提取方法，进而研制出SAs酶联免疫检测试剂
参考文献：
[1]. 抗磺胺对甲氧嘧啶单克隆抗体的研制及其特性分析[J]. 邸禄芹, 张小兵, 吴萌, 闫静辉. 中国微生态学杂志. 2012
[2]. 磺胺对甲氧嘧啶单克隆抗体的制备及应用[D]. 彭会建. 扬州大学. 2003
[3]. 磺胺对甲氧嘧啶胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制[D]. 方钲. 扬州大学. 2010
[4]. 磺胺氯吡嗪钠化学发光免疫分析方法的建立[D]. 张梦. 中国农业科学院. 2015
[5]. 磺胺类药物残留多联检试纸条快速检测技术研究[D]. 郭延成. 华中农业大学. 2010
[6]. 水产品中叁类重要化学残留物快速检测方法的研究[D]. 徐乃丰. 江南大学. 2015
[7]. 磺胺嘧啶单克隆抗体的制备与鉴定[J]. 王刘花, 许杨, 郭杰标, 张泓, 何庆华. 食品科学. 2010
[8]. 磺胺对甲氧嘧啶—量子点免疫层析试纸条的研制[D]. 王啊娟. 中南林业科技大学. 2015
[9]. 磺胺类药物多残留ELISA快速检测试剂盒与胶体金免疫层析试纸条的初探[D]. 杜玉玲. 新疆农业大学. 2013
[10]. 磺胺类药物残留ELISA快速检测试剂盒的研制[D]. 刘百红. 华中农业大学. 2006
标签：畜牧与动物医学论文; 抗体论文; elisa论文; 磺胺类论文; 抗原抗体反应论文; 单克隆抗体技术论文; 磺胺论文; 药品论文; igg抗体论文;