徐晓刚[1]2004年在《耐药革兰阳性球菌感染病原基因诊断研究》文中研究指明革兰阳性球菌是引起人类感染性疾病的重要病原。在过去的10多年里，革兰阳性球菌感染所占比例逐渐增加，目前凝固酶阴性葡萄球菌、金葡菌以及肠球菌已上升至医院获得血流感染病原的前叁位，同时革兰阳性球菌对临床常用抗菌药物耐药性日益严重，其中耐甲氧西林葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌以及青霉素不敏感肺炎链球菌在临床上分离率高，所致感染治疗困难，是当前最受关注的耐药革兰阳性球菌。由于耐药菌所致感染的病死率高于敏感菌，可选用的药物种类有限，而有效治疗的延误可导致病死率升高，故早期、准确的病原学诊断有助于提高感染性疾病的治疗水平，并可减少抗菌药物的滥用，进而减少不良反应的发生，延缓耐药性的发生与蔓延，并可减少医疗费用。由于常规病原学诊断方法包括标本中细菌培养、分离以及药敏，所需时间长(3～5天)，难以及时指导感染性疾病的治疗。而随着分子生物学与细菌基因组学的发展，快速、灵敏的核酸检测方法已用于耐药菌的检测，且逐渐被人们所接受。本课题在分析临床常见病原菌共有的23S rRNA基因以及革兰阳性球菌主要耐药基因的基础上，建立了可用于检测耐药革兰阳性球菌的快速基因诊断方法，有望为临床重症感染的早期病原诊断和及时正确的抗感染提供客观依据。 第一部分 临床常见病原菌分子生物学鉴定方法研究 核糖体核糖核酸(ribosomal RNA,rRNA)基因为所有生物体生存所必需的基因序列并且也是较保守的序列。细菌的rRNA基因由5S、16S以及23S rRNA基因叁部分构成。其中基因序列均含有保守区和多变区，多变区序列在不同种类细菌中各不相同，可提供区分不同细菌的重要信息，故多变区的序列可用于细菌的进一步区分和鉴定；利用基因序列保守区可设计通用引物，使同时扩增、检测多种细菌成为可能，以往应用16S rRNA基因检测细菌较多，近年来23S rRNA基因的应用有所增多。故本研究为明确23S rRNA基因用于临床常见致病菌鉴定的可行性，首先利用多变区两端保守序列设计的一对通用引物，对13种临床常见致病菌的23S rRNA基因部分序列进行了扩增及测序，序列采用DNAStar软件进行分析，结果显示13种临床常见致病菌的23S rRNA基因序列存在较多差异；在此基础上根据革兰阳性球菌与革兰阴性菌的序列差异设计了一条针对革兰阳性球菌的引物，联合原有通用引物扩增，建立了PCR-凝胶电泳检测法用于革兰阳性球菌与革兰阴性菌的鉴别，其中革兰阳性球菌经扩增可出现两条电泳条带，而革兰阴性菌仍只出现一条电泳条带，通过该方法不但可检测临床常见致病菌，而且可明确被测细菌为革兰阳性球菌抑或革兰阴性菌;随后根据不同菌株在该基因片段的特异序列，分别设计了相应探针，并在通用引物上标记地高辛，建立了PCR一反向杂交检测方法，该方法可将临床常见的致病菌鉴定到种，以上两种方法在临床分离株中进行了验证，具有良好的灵敏度、特异性以及可重复性。研究结果显示，235 rRNA基因可用于临床常见致病菌，如:金葡菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及肺炎克雷伯菌等的检测与鉴定。第二部分耐药革兰阳性球菌主要耐药基因检测方法研究 耐甲氧西林葡萄球菌(methieillin一resistant staPhylocoeei，MRS)、耐万古霉素肠球菌(vancomyein一resistant enieroeoeei，v既)以及青霉素不敏感肺炎链球菌(penieillin nonsuseeptible steptoeoeeus pneumoniae，pNSSp)是目前临床上最重要的耐药革兰阳性球菌，建立快速、特异、灵敏的检测方法对这类细菌所致感染的诊治具有重要意义。这些耐药菌的耐药机制己基本明确，由于mecA、va叭与vanB分别是MRS与VRE的耐药决定基因，上述基因的检出可以确定被测细菌为相应的耐药菌，故我们首先分析了meeA与vanA、vanB的基因序列，分别设计了mecA基因的特异性引物和va几A、vanB两种基因的通用引物，建立了可扩增mecA与vanA/B的PCR检测方法;PNSSP的耐药机制与上述2类耐药有所不同，是由于编码PBPs的基因，其中主要是PBPZb基因发生变异，它们的编码产物与青霉素的亲和力下降，从而导致肺炎链球菌对青霉素耐药。国内该方面研究较少，为明确国内PNSSP株PBPZb序列的变异区域，以便给后续PNSSP感染病原基因诊断方法的建立提供依据，我们对42株青霉素MIC在0.006一32mg几的肺炎链球菌临床分离株的PBPZb基因片段进行了限制性长度片段多态性分析(restriction fragment length polymo印hism，盯LP)，并对其中具有代表性的4株PNSSP以及1株PSSP临床分离株的PBPZb基因作了进一步的测序分析。结果显示PSSP分离株(编号02一12一犯6)的PBBZb基因序列与先前报道青霉素敏感株序列(登录号:X16022)相比，仅有3个核昔酸的改变，且无氨基酸序列变化。PNSSP临床分离株均有多变区域(1500一1540bp位置以X16022序列为参考)序列的改变，故重新设计新引物，建立了相应的PCR扩增方法。以上叁种PCR扩增方法经临床分离株、标准株以及其他非细菌基因组验证，显示了良好的灵敏度、特异性及可重复性，但叁者中，mecA基因的检出可判断被测细菌为MRS;夕 va川叼B基因的检出只能提示被检测细菌为VR
林东昉[2]2004年在《耐药革兰阴性杆菌感染病原基因诊断研究》文中提出革兰阴性杆菌是引起人类感染性疾病的主要病原之一。在感染性疾病的病原构成中占有重要的地位,同时,革兰阴性杆菌对临床常用抗菌药物耐药性日益严重,其中产超广谱β-内酰胺酶的革兰阴性杆菌在临床上分离率高,所致感染治疗困难,是当前最受关注的耐药菌。由于耐药菌所致感染的病死率高于敏感菌,可选用的药物种类有限,而有效治疗的延误可导致治愈率下降,重症感染病死率升高,故早期、正确的病原学诊断是提高感染性疾病治疗水平的关键,并可减少抗菌药物的滥用,进而减少不良反应的发生,延缓耐药性的发生与蔓延,同时可大幅度减少医疗费用。由于常规病原学诊断方法包括标本中细菌培养、分离以及药敏,所需时间长,难以及时指导感染性疾病的病原治疗。而随着分子生物学与细菌基因组学的发展,快速、灵敏的核酸检测方法已开始用于某些耐药基因的检测,且逐渐被人们所接受。本课题在分析临床常见病原菌共有的23S rRNA基因以及革兰阴性杆菌主要耐药基因的基础上,建立了可用于检测耐药革兰阴性杆菌的快速基因诊断方法,并应用于临床,此有望为耐药菌感染早期病原诊断和及时正确的抗感染治疗提供客观依据。 第一部分 临床常见病原菌分子生物学鉴定方法研究 核糖体核糖核酸(ribosomal RNA, rRNA)基因是细菌生存必需的基因序列,而且在进化过程中较为保守。细菌的rRNA基因由5S、16S以及23S rRNA基因叁部分构成。其基因序列特点为保守区和多变区相互间隔排列,多变区序列在不同种类细菌中各不相同,从而可提供区分不同细菌的重要信息,可用于细菌的进一步区分和鉴定;利用基因序列保守区可设计通用引物,使同时扩增、检测多种细菌相关基因序列成为可能。以往应用16S rRNA基因检测细菌较多,近年来23S rRNA基因的应用有所增多。此部分研究的目的是明确23S rRNA基因用于临床常见致病菌鉴定的可行性,首先利用多变区两端的保守序列使用一对通用引物,扩增13种临床常见致病菌的23S rRNA基因部分序列,包括:金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌属、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌,并对部分菌种先前未知序列测序,使用DNAStar软件进行分析同源性,结果显示13种临床常见致病菌的23S rRNA基因序列存在较多差异,根据不同菌株在该基因片段的特异序列,分别设计了相应探针,并固定于尼龙膜上;在通用引物上标记地高辛,建立PCR-反向杂交-地高辛显色检
邹颖[3]2014年在《多重耐药革兰阴性菌基因诊断与医院感染的临床、分子流行病学研究》文中进行了进一步梳理医院感染中革兰阴性菌约占60%-70%,是引起人类感染性疾病的主要病原之一。近年来全球各地细菌耐药监测数据表明,革兰阴性菌对临床常用抗菌药物耐药性日益严重,耐碳青霉烯类药物的肠杆菌科细菌、非发酵菌比例逐年升高,且对其他临床常用抗菌药物也呈现多重耐药,但是针对这部分“超级细菌”的抗菌药物研发明显落后,它所导致的感染治疗困难,病死率高,已成为医学界和公众都非常关注和担忧的问题。常规病原学诊断方法包括细菌培养、分离及药敏试验,所需时间长,难以及时指导感染性疾病的病原治疗。随着分子生物学与细菌基因组学的发展,快速、灵敏的核酸检测方法已开始用于病原学的快速诊断及某些耐药基因的检测。本课题在分析临床常见病原菌共有的23S rRNA基因及革兰阴性菌主要耐药基因的基础上,探索建立可用于检测多重耐药革兰阴性菌的快速基因诊断方法,并应用于临床,有望为耐药菌早期病原诊断、耐药性分析提供客观依据,从而及时、正确指导临床抗感染治疗方案的选择。预防重于治疗,医院感染中绝大部分患者系经过直接或间接接触感染,属于可控、可防的环节,切断传播途径有望减少医院感染的发病。因此对多重耐药革兰阴性菌导致的医院感染进行流行病学及临床研究可为控制耐药菌传播提供依据。本课题回顾性分析2005～2011年华山医院共6年期间血流感染、中枢神经系统感染患者的临床资料,总结院内不动杆菌感染的临床特点、菌株敏感性与预后关系。同时对2011年3月～2012年2月华山医院血液、脑脊液标本分离的革兰阴性菌进行超广谱p-内酰胺酶、碳青霉烯酶、甲基化酶筛查以明确上述耐药基因的流行情况。本课题共包括以下叁个部分：第一部分多重耐药革兰阴性菌基因诊断方法的建立基因芯片技术是近几年来快速发展的分子生物学技术平台,因其具有快速、灵敏、特异、高通量、样本用量少等特点而被广泛应用于生物学研究的各个领域,在细菌菌种鉴定、耐药基因检测、基因突变及多态性、基因表达谱分析等方面均有不少探索性研究,但能否应用于临床常规检测仍有不少争议。基于细菌核糖体核糖核酸(rRNA)基因序列中保守区和多变区相互间隔排列的特点,利用基因序列保守区设计通用引物,利用多变区设计特异性探针,使基因芯片快速鉴定细菌菌种成为可能。国内外先后有应用16SrRNA和23S rRNA基因检测细菌的报道,但对于菌株的耐药性无法得到明确的结果,难以正确指导临床抗菌药物的选择。目前临床上多重耐药革兰阴性菌中对健康威胁最大的产碳青霉烯酶菌株,此外甲基化酶可导致菌株对氨基糖苷类高度耐药,给治疗带来极大困难。本课题在前期利用23S rRNA基因快速鉴定菌种的研究基础上,设计了KPC、NDM、VIM、IMP型及OXA23、OXA5、OXA58组碳青霉烯酶耐药基因、armA和rmtB型甲基化酶耐药基因的PCR引物和探针,将耐药性检测的多对引物整合于1个PCR反应中,然后将所有探针固定于同一张基因芯片上,通过PCR产物与基因芯片杂交,可一次性明确菌株产常见碳青霉烯酶、甲基化酶情况,期望建立起能同步完成病原及耐药谱检测的基因诊断方法。结果证实基因芯片用于检测NDM、 IMP、KPC、OXA23、OXA51、OXA58型碳青霉烯酶耐药基因,armA型甲基化酶耐药基因杂交信号满意,可重复性好。但检测VIM型碳青霉烯酶和rmtB型甲基化酶耐药基因杂交信号不明显,重复性差,仍需进一步优化探针设计。第二部分多重耐药革兰阴性菌基因诊断方法的临床研究血流感染是临床常见的重症感染性疾病之一,具有较高的发病率及病死率,近年来发病率有上升趋势。由耐药菌导致感染的患者预后与能否及早针对病原选用敏感抗菌药物治疗密切相关。为进一步评估基因芯片检测多重耐药革兰阴性菌耐药基因携带情况的诊断价值,本课题收集了2011年3月～2012年2月华山医院血培养机器报阳标本356份,对其中119株革兰阴性菌采用基因芯片进行碳青霉烯酶和甲基化酶耐药基因检测,结果与PCR方法进行比较。结果显示基因芯片方法检测KPC型、NDM型碳青霉烯酶耐药基因、armA型甲基化酶耐药基因与PCR方法的符合率为100%,检测OXA23型、OXA51型碳青霉烯酶耐药基因和rmtB型甲基化酶耐药基因与PCR方法的符合率分别为90.0%、80.0%和58.3%。基因芯片诊断方法所需时间约6-8小时,较常规纸片法药敏试验在鉴定时间上缩短16～18小时,若同步进行菌种鉴定及耐药基因检测,则较常规细菌培养+药敏试验缩短2天以上,有助于指导临床血流感染抗菌药物方案的选择。第叁部分多重耐药革兰阴性菌医院感染的临床及分子流行病学研究肠杆菌科细菌和不动杆菌属是多重耐药革兰阴性菌医院感染的重要病原菌。本课题收集华山医院2005年1月～2011年12月共6年期间74例不动杆菌血流感染、90例中枢神经系统感染患者的临床资料进行回顾性分析,明确不动杆菌血流感染、中枢神经系统感染的临床特征、抗菌治疗与预后关系。结果表明不动杆菌血流感染、中枢神经系统感染几乎全为医院感染,多发生于术后及重症患者。不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素耐药率较低,患者预后与不动杆菌对抗菌药物的敏感性密切相关。此外为了解临床分离革兰阴性菌中常见耐药基因携带情况,本课题对2011年3月-2012年2月华山医院自血液、脑脊液分离获得的170株革兰阴性菌应用PCR方法进行KPC、NDM、VIM、IMP、GIM、SPM、 OXA23、OXA24、OXA58型碳青霉烯酶耐药基因,SHV、TEM、CTX-M型超广谱β-内酰胺酶耐药基因和armA、rmtB型甲基化酶耐药基因检测。结果显示：58株纸片法对碳青霉烯类抗菌药物不敏感革兰阴性菌中有77.6%(45/58)菌株携带碳青霉烯酶耐药基因。产KPC、OXA型碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制。86株细菌纸片法对氨基糖苷类药物不敏感菌株中有38.4%(33/86)菌株携带甲基化酶耐药基因,甲基化酶耐药基因也主要存在与肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌中。所有170株革兰阴性菌中PCR检测到产SHV菌株26株、产TEM菌株24株、产CTX-M菌株69株,在分离前叁位革兰阴性菌中大肠埃希菌产ESBLs比例最高,为75.0%(27/36)。ERIC-PCR分析菌株同源性,23株产OXA型碳青霉烯酶耐药基因鲍曼不动杆菌可分为4个亚型。17株携带KPC型和4株携带NDM型碳青霉烯酶耐药基因的肺炎克雷伯菌、洛菲不动杆菌均可分为2个亚型,提示菌株存在同源性可能。
黄宗明[4]2009年在《胃肠减压对胃癌病人呼吸道菌群影响的实验研究》文中认为目的:研究胃肠减压对胃癌病人呼吸道菌群各菌株分布影响及耐药情况,对耐药原因进行初步的分析。方法:对2006年6月～2007年6月40例(男29例,女11例)宜春市人民医院住院胃癌患者术前未插胃管及术后留置胃管后(2 d、4 d及6 d )痰标本行细菌培养,使用生物梅里埃公司出品的VITEK全自动微生物鉴定及药敏分析系统判定细菌及敏感菌株。结果:40例胃癌病人术前未插胃管时痰标本分离到20个菌株,主要为草绿色链球菌和干燥奈瑟菌;术后留置胃管后分离到124个菌株(分别是:第2天56株、第4天45株和第6天23株)。其中术后留置胃管后第2天革兰阴性杆菌19.64%,主要为肺炎克雷伯杆菌,革兰阳性球菌占51.79% ,其中仍以草绿色链球菌为优势菌。留置胃管后第4天革兰阴性杆菌占66.67% ,排前叁位的为肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌;革兰阳性球菌占22.22% ,以草绿色链球菌、金黄色葡萄球菌为优势菌。留置胃管后第6天革兰阴性杆菌占56.52% ,以鲍曼不动杆菌为主;革兰阳性球菌占39.13% ,以表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌为优势菌。革兰阴性杆菌对亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、环丙沙星表现出较好的敏感性;革兰阳性球菌对亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、丁胺卡那霉素、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦有较好的敏感性。结论:胃癌术后患者留置胃管后会影响呼吸道菌群变化,留置时间≥4天后变化更明显,以多重耐药革兰阴性杆菌为主;临床上情况许可宜尽早拔除胃管,及时掌握病原菌及其耐药性的情况,为合理使用抗生素及早期经验用药尤为重要。
参考文献：
[1]. 耐药革兰阳性球菌感染病原基因诊断研究[D]. 徐晓刚. 复旦大学. 2004
[2]. 耐药革兰阴性杆菌感染病原基因诊断研究[D]. 林东昉. 复旦大学. 2004
[3]. 多重耐药革兰阴性菌基因诊断与医院感染的临床、分子流行病学研究[D]. 邹颖. 复旦大学. 2014
[4]. 胃肠减压对胃癌病人呼吸道菌群影响的实验研究[D]. 黄宗明. 南昌大学. 2009