犬瘟热病毒单克隆抗体的筛选与双抗体夹心ELISA的建立

论文摘要

犬瘟热（canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）引起的一种病毒性传染病,在全世界范围内广泛发生。其传统宿主主要包括大部分食肉目动物。CDV感染犬科、猫科、浣熊科、鼬科、小熊猫科、大熊猫科已被多次报道。截至2013年年底,全国野生大熊猫种群数量达1864只,圈养大熊猫种群数量达到375只。2014年12月至2015年4月,陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心22只大熊猫中先后有6只CDV核酸检测阳性,并且5只抢救无效相继死亡。目前,RT-qPCR和胶体金试纸条是犬瘟热最常用的检测手段,但是RT-qPCR成本高、技术复杂、容易污染。而胶体金试纸条大多是针对感染犬的犬瘟热病毒,并没有针对犬瘟热的试纸条。因此,有必要建立一种敏感性强且特异性好的犬瘟热病毒检测技术,从而能够准确、快速地诊断感染大熊猫的犬瘟热病毒,对保护我国珍稀动物有着重大意义。本实验构建了犬瘟热病毒楼观台毒株F蛋白的原核表达质粒,表达了犬瘟热病毒融合蛋白胞外区,以此作为抗原,制备了针对犬瘟热病毒的单克隆抗体,然后用HRP标记单克隆抗体,建立了针对犬瘟热病毒双抗体夹心ELISA方法。其结果如下:1.犬瘟热病毒重组F蛋白的原核表达与纯化参照犬瘟热病毒楼观台毒株F蛋白的基因序列,构建了包含犬瘟热病毒F蛋白胞外区的重组质粒,转化大肠杆菌表达宿主菌BL21（DE3）,在37℃,1 mmol的IPTG的条件下诱导6 h,超声裂解大肠杆菌,然后经过Ni Resin亲和层析,通过SDS-PAGE与Western Blot分析,CDV-F蛋白成功表达,得到预期大小为40 Kda蛋白,并且表达的CDV-F蛋白具有良好的反应原性,用经纯化的CDV-F蛋白免疫小鼠,通过采集小鼠血清进行间接ELISA分析,小鼠血清的抗体滴度达到10-5,说明原核表达的CDV-F蛋白具有良好的免疫原性。2.单克隆抗体的制备、纯化与HRP标记用纯化的CDV-F作为抗原,免疫BALB/c小鼠,利用传统的细胞融合与亚克隆技术成功制备了三株单克隆抗体1A5,1A5和7D5,通过向腹腔注射杂交瘤细胞制备单克隆抗体,收集腹水通过Protein G亲和层析进行纯化,浓度分别为1.2 mg/mL,1.2 mg/mL,1.8 mg/mL。然后用氧化还原法标记HRP,直接ELISA方法检测三株抗体的效价为1∶100000-1∶1000000。3.犬瘟热病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立首先利用犬瘟热病毒作为抗原,通过竞争ELISA对单克隆抗体抗原表位进行分析,结果显示,三株单克隆抗体均识别不同的表位,通过捕获抗体与检测抗体的确定,结果显示1A5作为捕获抗体,7D5-HRP作为检测抗体时检测病P/N值最高,非特异性反应最弱,然后通过棋盘滴定法确定了双抗体夹心ELISA方法的最佳反应条件,其中捕获抗体包被量为800 ng/孔、HRP-7D5稀释比例为1∶100。4.敏感性评价:用现有的商品化试纸条与双抗体夹心ELISA方法分别犬瘟热病毒感染的vero细胞的上清。结果显示,两种方法均能检测到logTCID50=1.8的病毒样本,上述结果说明,建立的双抗体夹心ELISA方法的敏感性与现有的商品化试纸条相同。5.特异性评价:利用CPV（犬细小病毒）、ICHV（犬传染性肝炎病毒）、CPIV（犬副流感病毒）三种病毒感染细胞的上清来评价双抗体夹心ELISA方法的特异性。结果显示,CPV、ICHV、CPIV细胞培养的上清均不反生反应,因此本方法具有良好的特异性。6.与商品化试纸条一致性评价:13份临床大熊血清与30份临床犬血清分别用商品化试纸条与建立的双抗体夹心ELISA方法检测,临床大熊猫血清中均没有检到犬瘟热病毒,临床犬血清两种方法均检到6份阳性,两种方法的一致性为100%,说明双抗体夹心ELISA方法与现有的商品试纸条一致性高。综上所述,本课题建立了一种快速检测犬瘟热病毒的双抗体夹心ELISA方法,与商品化试纸条具有很高的一致性,可以用来检测犬瘟热病毒。

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摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 犬瘟热病毒的生物学特征

1.2 犬瘟热在我国的流行情况

1.3 犬瘟热病毒感染大熊猫

1.4 犬瘟热病毒的检测、预防与治疗

1.5 本研究目的与意义

第二章犬瘟热融合蛋白重组质粒构建与原核表达

2.1 材料

2.1.1 质粒

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.1.4 主要试剂配制方法

2.2 实验步骤

2.2.1 PCR扩增

2.2.2 T-A克隆

2.2.3 表达载体的构建

2.2.4 原核表达

2.2.5 琼脂糖镍柱亲和层析

2.2.6 蛋白浓度测定

2.2.7 反应原性的鉴定

2.2.8 免疫原性分析

2.3 实验结果及分析

2.3.1 CDV-F基因片段和T-A片段的扩增以及阳性克隆验证

2.3.2 目的片段和载体双酶切鉴定

2.3.3 重组表达载体鉴定

2.3.4 重组质粒的原核表达和鉴定

2.3.5 蛋白纯化条件

2.3.6 Western Blot分析重组蛋白CDV-F的反应原性

2.3.7 小鼠血清抗体效价的测定

2.4 讨论

第三章犬瘟热F蛋白单克隆抗体的制备、纯化与HRP标记

3.1 材料

3.1.1 实验动物与细胞

3.1.2 主要设备与仪器

3.1.3 主要试剂

3.1.4 主要试剂的配制

3.2 方法

3.2.1 细胞融合

3.2.2 间接ELISA筛选阳性细胞株

3.2.3 亚克隆（有限稀释法）

3.2.4 腹水的制备

3.2.5 腹水的纯化

3.2.6 间接ELISA方法测定经纯化的单克隆抗体效价

3.2.7 单克隆抗体亚型鉴定

3.2.8 单克隆抗体的HRP标记

3.2.9 直接ELISA方法测定HRP标记单克隆抗体效价

3.3 实验结果及分析

3.3.1 阳性杂交瘤细胞系的筛选与鉴定

3.3.2 单克隆抗体间接ELISA效价

3.3.3 单克隆抗体的抗体亚型鉴定

3.3.4 三株单克隆抗体的免疫印记分析

3.3.5 HRP标记单克隆抗体直接ELISA效价的测定

3.4 讨论

3.5 小结

第四章双抗体夹心ELISA方法的建立

4.1 材料

4.1.1 血清

4.1.2 主要设备与仪器

4.1.3 主要试剂

4.2 方法

4.2.0 单克隆抗体的抗原表位分析

4.2.1 捕获抗体与检测抗体的确定

4.2.2 捕获抗体的包被浓度与检测抗体稀释比例的确定

4.2.3 双抗体夹心ELISA方法的建立

4.2.4 双抗体夹心ELISA方法的敏感性评价

4.2.5 双抗体夹心ELISA方法的特异性评价

4.2.6 双抗体夹心ELISA方法与胶体金方法的一致性比较

4.3 实验结果

4.3.1 单克隆抗体的抗原表位分析

4.3.2 最优抗体组合的确定

4.3.3 包被单抗1A5浓度与HRP标记7D5抗体浓度的确定

4.3.4 双抗体夹心ELISA特异性实验

4.3.5 双抗体夹心ELISA敏感性实验

4.3.6 双抗体夹心ELISA与现有商品化试纸条一致性比较

4.4 讨论

结论

参考文献

致谢

个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 徐刚

导师: 周恩民

关键词: 犬瘟热,单克隆抗体,双抗体夹心,抗原检测

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家重点研究计划(2016YFD0500706,2017YFD0501006)

分类号: S852.4

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