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黄花棘豆抗逆转录因子OoABF2互作蛋白的筛选与鉴定

2020-12-02阅读(645)

黄花棘豆抗逆转录因子OoABF2互作蛋白的筛选与鉴定

论文摘要

近年来,草场退化现象不断加剧,严重影响了生态平衡和可持续发展,而黄花棘豆作为主要的草原毒害草之一,由于其自身极强的抗逆性和适应性而广泛蔓延。本课题前期对黄花棘豆在3种逆境胁迫（ABA,NaCl和PEG）处理下的转录组数据分析显示ABF2类转录因子可能参与黄花棘豆的抗逆反应,但其调控机理仍不清楚。因此,本研究以前期工作为基础,以黄花棘豆转录因子OoABF2为切入点,对其上游互作进行蛋白筛选与鉴定,为探明黄花棘豆抗逆性的分子机制提供理论依据。（1）本研究以OoABF2转录因子（accession number:KU877410.1）为切入点,结合课题组已有研究工作和国内外文献报道,首先确定SnRK2s蛋白激酶家族为目标基因,随后成功克隆出黄花棘豆中的所有8个SnRK2s激酶家族:暂时命名为OoSnRK2.1-OoSnRK2.8（accession number:MH636330-MH636337）。（2）通过T4 DNA连接酶分别将OoABF2和pGADT7连接,将OoSnRK2s与pGBKT7连接,构建真核重组质粒,利用酵母双杂交技术,在酵母细胞体内筛选鉴定出了与OoABF2转录因子相互作用的SnRK2激酶蛋白为OoSnRK2.1和OoSnRK2.6。（3）构建OoSnRK2.1-pSPYNE、OoSnRK2.6-pSPYNE和OoABF2-pSPYCE重组质粒,利用双分子荧光互补技术,在烟草表皮细胞内再次体内验证了OoABF2转录因子与OoSnRK2.1和OoSnRK2.6存在相互关系,且相互作用位点都在细胞核。（4）将OoSnRK2.1和OoSnRK2.6分别与pGEX-4T-1连接,将OoABF2和pET-32a连接,通过原核诱导表达出3个可溶性的目标蛋白,通过Pull-Down技术在体外进一步确证了OoABF2转录因子与OoSnRK2.1和OoSnRK2.6为互作蛋白。（5）综合利用各种生物信息学方法对OoSnRK2.1和OoSnRK2.6基因进行生物信息学分析,解析了这两个蛋白的基本理化性质,结果表明目标蛋白都是亲水性蛋白,都没有跨膜结构域和信号肽,都是核定位蛋白,都包括特定的保守结构域,都含有磷酸化位点。通过构建系统进化树发现OoSnRK2.1蛋白与蒺藜苜蓿（XP 003615157.1）以及鹰嘴豆（XP 004490378.1）蛋白的一致性最高;OoSnRK2.6蛋白也与蒺藜苜蓿（XP013456889.1）蛋白序列同源性最高。（6）在3种不利胁迫（ABA,NaCl和PEG）处理下,运用qRT-PCR技术对目标基因OoSnRK2.1和OoSnRK2.6进行表达谱分析,结果表明:两者都能够由ABA激活,并且同时在3 h处达到较高的转录水平,在NaCl和PEG的处理下,OoSnRK2.1和OoSnRK2.6也能够被诱导表达,结果表明二者可能主要通过依赖ABA信号途径参与抗逆反应。综上所述,本研究表明黄花棘豆OoABF2转录因子和其上游的OoSnRK2.1/OoSnRK2.6激酶家族通过依赖于ABA的信号通路在逆境胁迫中发挥了重要的作用,对于揭示和阐明黄花棘豆抗逆机制具有重要的意义。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 黄花棘豆研究现状
  •     1.1.1 化感作用
  •     1.1.2 化学成分
  •     1.1.3 毒性机理
  •     1.1.4 内生真菌
  •     1.1.5 本课题组前期研究基础
  •   1.2 ABA信号通路
  •   1.3 SnRK家族基因研究概况
  •     1.3.1 结构与分类
  •     1.3.2 SnRK2 活性与表达
  •   1.4 蛋白互作研究方法
  •     1.4.1 酵母双杂交技术
  •     1.4.2 双分子荧光互补技术
  •     1.4.3 Pull-Down技术
  •   1.5 本课题研究目的与意义
  •   1.6 本课题研究内容与技术路线
  • 第二章 OoABF2 互作蛋白的筛选与鉴定
  •   2.1 实验准备
  •     2.1.1 实验材料
  •     2.1.2 主要试剂
  •     2.1.3 实验仪器
  •     2.1.4 主要载体
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 各种溶液的配制
  •     2.2.2 引物设计
  •     2.2.3 总RNA提取
  •     2.2.4 c DNA合成
  •     2.2.5 聚合酶链式反应
  •     2.2.6 回收PCR产物
  •     2.2.7 PCR产物与pGEM-T Easy连接
  •     2.2.8 制备DH5α感受态细胞
  •     2.2.9 转化
  •     2.2.10 菌落PCR
  •     2.2.11 质粒提取与双酶切验证
  •     2.2.12 酵母双杂交筛选与OoABF2 互作的OoSnRK2s
  •     2.2.13双分子荧光互补实验
  •     2.2.14 体外验证OoABF2与OoSnRK2s蛋白的相互作用
  •     2.2.15 蛋白间相互作用预测分析
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 黄花棘豆总RNA样品质量检测
  •     2.3.2 蛋白间相互作用预测分析
  •     2.3.3 目的基因片段的筛选与克隆
  •     2.3.4 酵母双杂交实验结果
  •     2.3.5 双分子荧光互补实验再次验证互作
  •     2.3.6 Pull-Down实验结果
  •   2.4 讨论
  • 第三章 互作蛋白OoSnRK2.1与OoSnRK2.6 的生物信息学分析
  •   3.1 分析软件
  •   3.2 结果与分析
  •     3.2.1 蛋白基本理化性质
  •     3.2.2 蛋白亲/疏水性分析
  •     3.2.3 跨膜结构域分析
  •     3.2.4 信号肽预测分析
  •     3.2.5 磷酸化位点分析
  •     3.2.6 亚细胞定位分析
  •     3.2.7 不同物种目的蛋白序列多重性比较
  •     3.2.8 系统进化分析
  •     3.2.9 二级结构预测
  •   3.3 讨论
  • 第四章 非生物胁迫下互作基因的表达谱分析
  •   4.1 实验准备
  •     4.1.1 材料处理
  •     4.1.2 主要试剂
  •     4.1.3 实验仪器与设备
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 qRT-PCR引物设计
  •     4.2.2 合成c DNA
  •     4.2.3 基因目标的扩增
  •     4.2.4 qRT-PCR
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.2 目标基因引物的验证
  •     4.3.3 黄花棘豆OoSnRK2.1和OoSnRK2.6 基因的熔解曲线
  •     4.3.4 非生物胁迫处理下目标基因的表达谱分析
  •   4.4 讨论
  • 第五章 结论与展望
  •   5.1 结论
  •   5.2 后续研究展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读硕士学位期间取得的科研成果

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 牛斐

    导师: 尉亚辉,傅艳萍

    关键词: 黄花棘豆,酵母双杂交,双分子荧光互补

    来源: 西北大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,畜牧与动物医学

    单位: 西北大学

    分类号: Q943.2;S812.6

    DOI: 10.27405/d.cnki.gxbdu.2019.000254

    总页数: 81

    文件大小: 4710K

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