猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒N蛋白交叉反应表位研究

论文摘要

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）同属于α冠状病毒属,两者均主要通过粪-口途径传播,并引起宿主产生相似的组织病理学特征和临床症状,其临床症状主要表现为:腹泻,呕吐和脱水。两者因在仔猪中引起高死亡率,造成全球畜牧业严重的经济损失。血清学诊断在区分两种病原起到关键作用。冠状病毒主要编码四种结构蛋白,分别是:纤突（S）蛋白、包膜（E）蛋白、膜（M）蛋白和核衣壳（N）蛋白。N蛋白在冠状病毒感染早期表达量丰富,具有良好的免疫原性。由于N蛋白缺乏糖基化位点,易于纯化,因此是PEDV与TGEV良好的诊断型抗原。而近年来,由N蛋白引起的交叉反应现象在冠状病毒中相继报道,不同病毒之间的交叉反应严重影响了病原体的特异性诊断。为了提高猪冠状病毒诊断的特异性,本研究以PEDV与TGEV作为研究对象,通过间接免疫荧光测定（IFA）和蛋白免疫印迹（Western Blot）方法分析猪冠状病毒的抗原关系。通过构建表达截短质粒,对PEDV与TGEV的交叉反应区域进行研究。在此基础上,通过一级序列与三级结构分析,针对交叉反应表位进行重点研究,期望为猪冠状病毒的特异性诊断提供理论指导依据。主要开展以下3个方面的实验内容:1.PEDV与TGEV抗原关系的研究。为了研究PEDV和TGEV病毒水平的交叉反应,使用针对PEDV或TGEV高免抗病毒血清和抗全长N蛋白多克隆抗体（PAbs）,对PEDV或TGEV感染的细胞进行IFA和Western blot检测。结果显示,抗TGEV高免血清、抗TGEV N蛋白PAb能检测到PEDV,抗PEDV高免血清、抗PEDV N蛋白PAb能检测到TGEV,表明两者在病毒水平存在双向的交叉反应;为了进一步确定N蛋白是否为交叉反应抗原,将表达PEDV或TGEV N蛋白的质粒瞬时转染到HEK-293T细胞中,收集细胞样品进行Western blot检测,发现两者N蛋白出现较强双向交叉反应。2.PEDV关键交叉反应区域的鉴定。基于预测的PEDV N蛋白的二级结构,构建了PEDV N蛋白不同长度的截短质粒。通过Western blot检测不同截短蛋白的交叉反应性。结果表明,抗TGEV N蛋白PAb能检测到PEDV N截短蛋白1-170aa与125-301aa,说明PEDV N蛋白N端区域与中间区域是重要的交叉反应区域。3.PEDV关键交叉反应表位的鉴定。基于序列比对结果与预测的PEDV N蛋白三级结构结果,找到PEDV N蛋白N端区域与中间区域位于结构表面且高度保守的氨基酸。将这些氨基酸在PEDV N蛋白全长基础上进行突变,使用针对抗全长PEDV或TGEV N蛋白PAb,通过Western blot检测不同突变体的交叉反应性。结果表明,与野生型PEDV N蛋白相比,58-RWRMRRGERIE-68、78-LGTGPHAD-85所对应的突变体与抗全长TGEV N蛋白PAb的结合能力大大减弱,与抗全长PEDV N蛋白PAb的结合能力无明显变化,说明PEDV N蛋白N端58-RWRMRRGERIE-68、78-LGTGPHAD-85是重要的交叉反应抗原表位。综上所述,本文对PEDV与TGEV的抗原关系进行了研究。在此基础上,进一步鉴定了PEDV N蛋白上两个交叉反应区域以及优势抗原表位,为猪冠状病毒的特异性免疫诊断提供新的依据。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 解文婷

导师: 彭贵青

关键词: 核衣壳蛋白,交叉反应,端表位

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

分类号: S852.651

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000445

总页数: 71

文件大小: 4378K

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