李祥[1]2003年在《利用HSP70基因人工创造植物雄性不育系的研究》文中研究指明HSP70是一种分子伴侣，主要功能是参与细胞有关蛋白新生肽的折迭、亚基组装、细胞内运输、蛋白质降解及DNA损伤的修复，对线粒体结构和功能发挥重要作用，已有研究证明HSP70与动植物的发育有密切的关系，本研究将HSP70正、反义cDNA构建成表达载体，并运用基因枪和农杆菌介导法将HSP70正、反义cDNA导入烟草，试通过HSP70反义cDNA抑制hsp70基因的表达从而创造雄性不育株，以证明HSP70反义cDNA能创造雄性不育系。实验结果如下： 1．雄性不育表达载体的构建 人工合成HSP70正、反义cDNA，分别定向插入到pUC18、pUC19中，得到pSC和pAC。然后经过平板筛选和酶切分析证明HSP70正、反义cDNA插入到pUC18、pUC19。分别将从pSC、pAC回收纯化的HSP70正、反义cDNA与绒毡层特异表达启动子TA29及NOS终止子定向连接，然后插入到pUC18、pUC19中，构建成花药特异表达的TA29-HSP70 sense cDNA-NOS和TA29-HSP70antisense cDNA-NOS，分别称作650和651质粒。为了更好地对转化子进行筛选和检测，用HindⅢ和EcoR Ⅰ分别对650、651及3301质粒(含GUS报告基因和bar筛选标记基因)进行酶切，将从650和651回收纯化的目的片段与3301质粒进行连接，再对重组子进行平板筛选和酶切分析确定TA29-HSP70 sense cDNA-NOS和TA29-HSP70 antisense cDNA-NOS插入到3301质粒中，构建成3301+650和3301+651表达载体。 2．获得转基因雄性不育烟草 为了证实HSP70反义cDNA能创造雄性不育，我们将3301+650和3301+651质粒用基因枪和农杆菌介导法转化烟草无菌发芽的叶片，共207片(基因枪109片，农杆菌98片)。在含basta0.4mg／L的筛选培养基上进行筛选，得到抗性叶片181片(基因枪93片，农杆菌88片)。待抗性叶片分化出芽时，取幼嫩的叶片进行GUS染色检测，在195株抗性芽中，有79.5％的抗性芽GUS呈阳 性。 3．转基因植株的分子检测和田间生物学观察 将抗性芽长成植株后移栽到大田共得到30株转化植株。PCR和点杂交分析 表明，HSP70正、反义。DNA己经整合到烟草的基因组中。在进行田间生物学 性状观察时，30株转基因植株中有12株表现出完全不育，9株高度不育，3株 部分不育和6株可育；不育植株在雄蕊、株高和果实重量等方面都存在明显的差 异。石蜡切片分析表明，转基因不育植株的花粉囊的发育和结构与对照的可育植 株之间没有任何差异，只是花粉囊中的花粉在不育株中是不育的，而可育株是可 育的。由于线粒体和热激蛋白在植物的发育过程中起着重要的作用，为进一步分 析其不育机理，我们对花粉线粒体进行了常温和热激处理，提取其蛋白进行测定 和方差分析，结果表明：不育植株与对照的线粒体蛋白含量的差异在常温和热激 条件下均达到极显着水平o＜0．01，n＝10）；而不育植株在常温和热激条件下线 粒体蛋白含量差异不显着，说明转化株中hsp70基因的表达受到抑制，从而进一 步扰乱了线粒体的功能，最终导致转化株雄性不育，表明HSP70反义cDNA能 够通过抑制hsp70基因的表达导致植物雄性不育。
王俐, 章银梅, 陈建南[2]2001年在《基因工程创造新的植物雄性不育系研究的新进展》文中认为报道了利用基因工程方法创造植物雄性不育系、恢复系及不育系的筛选和保留的研究成果。
刘同坤[3]2012年在《不结球白菜BcHSP81-4基因在Po1CMS中的表达分析及BcFLC基因的功能验证》文中认为细胞质雄性不育系是作物杂交育种的重要材料,也是研究花粉发育、细胞质遗传、核质互作以及时序性表达的理想材料。因此,对细胞质雄性不育分子机理的研究具有非常重要的意义。不结球白菜(Brassica campestris ssp. chienesis Makino)原产于中国,是我国南方普遍种植的大众化蔬菜,在蔬菜周年供应中起着举足轻重的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,对CMS的研究取得了较大的进展,但雄性不育的机理研究尚不清楚。故本研究以Pol胞质雄性不育系及其保持系为材料,从分子生物学方面入手,对不结球白菜Pol雄性不育系和保持系花期发育之间的差异表达基因进行了研究分析,有助于全面地了解高等植物中雄性不育发生的机理。同时,不结球白菜先期抽薹现象降低了产品的产量和质量,晚抽薹基因FLC的引入可避免该现象,但FLC对植物发育存在消极影响,因而,对抽薹和植物发育关系的研究具有重要意义。本文主要研究结果如下：1.不结球白菜Pol胞质不育系花期抑制性消减文库的构建以不结球白菜Pol胞质雄性不育系及其保持系为材料,采用抑制性消减杂交(supperssion subtraetive hybridization, SSH)技术,构建Pol胞质雄性不育系抑制消减cDNA文库。菌落PCR检测显示,有效重组率为91%,插入片段大小主要集中在100bp到1000bp之间。斑点杂交筛选得到32个阳性克隆,序列测定和同源性比对分析表明,15个克隆功能未知,其余涉及到激素信号转导、第二信使、光合作用、脂肪酸代谢及衰老等多个方面。2.不结球白菜BcHSP81-4基因的克隆及其在PolCMS中的表达分析从不结球白菜Pol胞质雄性不育系抑制消减cDNA文库中筛选出一条BcHSP81-4基因,经鉴定是热激蛋白家族的成员之一。从BcHSP81-4基因的氨基酸比对中,发现其与其他物种的HSP90家族具有很高的同源性。同时,本文还研究了BcHSP81-4在不同花发育时期和不同胁迫条件下的表达差异。结果表明,BcHSP81-4在35℃的热胁迫条件下,表达无显着差异,但是在盐胁迫和冷胁迫条件下,都能诱导表达。同时本文也发现BcHSP81-4基因在不育系的花蕾中高表达,因此,本研究推测BcHSP81-4基因在polCMS不育系中也可能起一定的作用。将BcHSP81-4基因片段连接到原核表达载体PGEX-4T-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,产生了预期大小的重组蛋白,进一步证明了该基因属于热激蛋白90家族。理化性质分析结果显示该蛋白含699个氨基酸,分子量为80.05KD,理论等电点pI值为4.95。TMpred跨膜分析结果显示,它含有1个显着的跨膜螺旋区,这个区域与ProtScale预测的疏水区基本对应。用TargetP server和WOLFPSORT server程序预测该蛋白为细胞质蛋白,二级结构以a-螺旋和随机卷曲为主。3.不结球白菜晚抽薹基因BcFLC过表达影响拟南芥的育性和抗寒性FLC在拟南芥中对开花是一个剂量依赖型抑制因子。本实验室从不结球白菜中克隆到一条FLC相关序列,命名为BcFLC,本研究将该基因在拟南芥中组成型过表达,结果发现,BcFLC可以显着延迟抽薹时间10天左右,表明BcFLC是抑制抽薹开花的一个基因。在BcFLC过表达植株中,花期的SOC1的表达量降低,但LFY和FT的表达量显着高于对照。因此本文认为BcFLC过表达植株比对照植株需要更多剂量的LFY和FT来促进开花。同时,本文还发现过表达BcFLC的拟南芥育性受到影响,主要是由于RGA和RGL等花丝抑制因子的表达量上升和SEP3等花和胚珠发育相关基因的下调造成的。在BcFLC过表达植株中,CBF1,2,3和COR15a等抗寒相关基因的表达量上调,植株抗寒性增强,表明BcFLC的过表达激活了CBF1,2,3和COR15a抗寒基因的表达,从而提高植物的抗寒性。4.外源硝酸盐和NaCl胁迫对拟南芥开花的调节植物开花受到内源和外源信号的双重调节。很多植物在一定的逆境胁迫下(如低硝酸盐和盐胁迫)都能提前开花,但有关这些胁迫是如何调节植物开花的机理尚不清楚。本研究发现低浓度的硝酸盐和NaCl胁迫能够增强GA生物合成酶GA1的活性,激活GA的生物合成。从而使得CO和SOC1的表达量增强,促进开花。但是硝酸盐和NaCl对开花光周期途径的影响是不同的。光周期相关基因CCA1和LHY在低浓度NaCl胁迫下受到抑制；但在低浓度硝酸盐胁迫下却没有显着变化。先前的研究表明,SOC1介导开花所有的内源途径：春化,自主开花,长日照和GA途径。因此,本文推测SOC1基因在介导植物内外源信号调节植物开花中起着重要作用。
陈建南, 傅鸿仪, 路子显, 王东江, 汪迎春[4]1998年在《高粱细胞质雄性不育与HSC_(70)mRNA的关系》文中研究指明使用注射方法把HSP_(70)反义cDNA导入到高粱不育系(3A)和可育系(3B)幼穗中,并分别进行热激或常温处理.发现常温时3A花药细胞中是缺乏HSC_(70)mRNA的,此时3A为不育;当热激处理时,3A中出现了HSC_(70)mRNA,此时3A由不育变为可育.在3B花药细胞中,不论是常温还是热激条件下都出现HSC_(70)mRNA.对花药细胞线粒体总蛋白量测定表明,3A幼穗经热激处理后,它的线粒体总蛋白量是热激前的2.7倍(紫外测定值为3.0倍),与3B常温时含量相当.这表明,常温条件时3A花药细胞中线粒体总蛋白量减少和HSC_(70)mRNA缺乏与高粱不育性表现是一致的.
孙鑫博[5]2015年在《匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera L.)小热激蛋白基因的克隆与功能研究》文中研究表明匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera L.)是一种常见的多年生冷季型草坪草。它具有耐寒、耐盐、耐阴等优良特性。此外,其成坪速度快,质地良好,能够形成外观非常优美的草坪。因此广泛的应用在高尔夫球场,绿地网球场等。但由于其耐热性差,“夏枯”现象广泛存在,严重破坏了其草坪外观和质量,限制了其在气候温暖地区的广泛使用。而目前针对匍匐翦股颖耐热性机理以及对高温胁迫下的响应途径还尚不明确,因此这方面的研究成为了草坪研究者所关注的热点。本文在前人的研究基础上,通过RT-PCR的方法从匍匐翦股颖中克隆出叁个小热激蛋白的编码基因AsHspl 7、AsHsp26.8和AsHsp26.7及其启动子,通过生物信息学分析,转基因技术等对其在植株对高温以及其他环境胁迫的响应中的功能与作用进行了深入的研究,其结论如下：1.从匍匐翦股颖中克隆出了小热激蛋白AsHsp17基因,其开放阅读框为456bp,编码151个氨基酸。对其进行生物信息学分析和亚细胞定位预测显示,AsHspl7含有一个典型的Hsp20结构域/a-crystallin结构域(ACD),并且属于细胞质Class I小热激蛋白亚家族。AsHsp17能够被高温胁迫强烈诱导,在根部也能够被盐胁迫或ABA处理所诱导。AsHsp17基因启动子中含有HSE等热胁迫相关的顺式元件。异源过表达AsHsp17能够通过改变一些光合作用相关基因的表达降低转基因拟南芥在正常条件下叶绿素含量和光合速率,也能够通过改变一些胁迫相关基因的表达使转基因拟南芥对于高温,盐和ABA处理更加敏感。2.应用RT-PCR技术从匍匐翦股颖中克隆了小热激蛋白AsHsp26.8的编码基因,其开放阅读框为732bp,编码243个氨基酸。其氨基酸序列中含有一个典型的Hsp23结构域／a-crystallin结构域(ACD)。该序列还包括一个叶绿体靶信号肽,一个甲硫氨酸富集区和两个保守区域。通过对其进行生物信息学分析和亚细胞定位预测显示AsHsp26.8属于叶绿体小热激蛋白。AsHsp26.8基因能够被高温胁迫强烈诱导,而其他环境胁迫均不能诱导AsHsp26.8基因的表达。对其启动子进行分析发现其含有HSE、AT-rich element和TATA等热胁迫相关的顺式元件。此外,GUS组织染色表明AsHsp26.8基因启动子能够被高温胁迫诱导激活。异源过表达AsHsp26.8能够使转基因拟南芥对高温,盐或ABA处理更为敏感。3.从匍匐翦股颖中克隆了小热激蛋白基因AsHsp26.7,其开放阅读框为729bp,编码242个氨基酸。其氨基酸序列中含有一个典型的Hsp23结构域/α-crystallin结构域(ACD)。该序列还包括一个叶绿体靶信号肽,一个甲硫氨酸富集区和两个保守区域。通过对其进行生物信息学分析和亚细胞定位预测显示AsHsp26.7属于叶绿体小热激蛋白。AsHsp26.7基因受高温胁迫的强烈诱导,并且在根部受干旱胁迫的诱导。对其启动子进行分析发现其含有HSE、AT-rich element和TATA等热胁迫相关的顺式元件。通过GUS组织染色发现AsHsp26.7基因启动子能够被高温胁迫所诱导激活,并且在花药、花粉粒和柱头中GUS的表达最为强烈。AsHsp26.7转基因拟南芥在高温条件下的存活率要高于野生型拟南芥。本研究对匍匐翦股颖叁个小热激蛋白基因进行了表达模式和功能分析,为今后在匍匐翦股颖耐热性以及其它抗逆性方面的研究提供了依据。
申佩弘[6]2003年在《水稻种子蛋白启动子驱动下的ipt基因在转基因烟草中的特异表达》文中指出本研究首先利用PCR法获得了水稻种子专一性表达启动子(醇溶蛋白启动子与谷蛋白启动子)，将两启动子插入到植物表达载体pBI121上35S启动子的位置，构建了醇溶蛋白启动子与谷蛋白启动子驱动下的gus基因植物表达载体：随后用ipt基因取代gus基因，分别构建了醇溶蛋白启动子与谷蛋白启动子以及CaMV35S启动子驱动下的ipt基因的植物表达载体。将上述嵌合基因经过叁亲结合法，把重组质粒及原始载体pBI121导入根癌农杆菌(LBA4404)中，获得了分别含有上述六种质粒的农杆菌菌株，用于普通烟草的转化。将含外源基因的根癌农杆菌菌液与烟草幼叶共培养，并进一步继代和抗生素筛选获得相应的抗性植株。Gus组织染色表明Pp与Pg均有种子特异表达活性。通过PCR测序分析，证实外源ipt基因已经整合到烟草植株的基因组中。利用ELISA检测转基因植株种子中的iPAs(异戊烯基腺苷与异戊烯基腺嘌呤)的含量发现，转基因烟草种子中的iPAs的含分别增加了4.17和2.43倍。通过对种子重量分析发现转基因种子的重量与对照相比分别提高了12.14％和7.8％。
参考文献：
[1]. 利用HSP70基因人工创造植物雄性不育系的研究[D]. 李祥. 湖南农业大学. 2003
[2]. 基因工程创造新的植物雄性不育系研究的新进展[J]. 王俐, 章银梅, 陈建南. 生命科学. 2001
[3]. 不结球白菜BcHSP81-4基因在Po1CMS中的表达分析及BcFLC基因的功能验证[D]. 刘同坤. 南京农业大学. 2012
[4]. 高粱细胞质雄性不育与HSC_(70)mRNA的关系[J]. 陈建南, 傅鸿仪, 路子显, 王东江, 汪迎春. 科学通报. 1998
[5]. 匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera L.)小热激蛋白基因的克隆与功能研究[D]. 孙鑫博. 北京林业大学. 2015
[6]. 水稻种子蛋白启动子驱动下的ipt基因在转基因烟草中的特异表达[D]. 申佩弘. 广西大学. 2003