导读:本文包含了浓核病毒论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:家蚕,病毒,蛋白,细胞系,寄主,抗性,单克隆抗体。
浓核病毒论文文献综述
苗迪,张亚慧,邓炎春,胡朝阳,于倩[1]（2019）在《家蚕二分浓核病毒的起源及进化》一文中研究指出家蚕二分浓核病毒(Bombyx moribidensovirus,BmBDV)是一种二分DNA病毒,主要侵染家蚕中肠组织的柱状细胞,引发家蚕浓核病。该病毒与细小病毒科的浓核病毒在病毒粒子和基因组结构上有很多相似之处,但是又具有编码DNA聚合酶以及分子质量较大的次要结构蛋白的功能。通过对BmBDV基因序列进行同源性分析以及对其功能进行预测,分析该病毒的可能起源。结果显示,BmBDV病毒基因组VD1链的非结构蛋白基因ns1和主要结构蛋白基因vp起源于细小病毒中的单义浓核病毒;VD1可能从真核生物自合成DNA转座子——波林顿转座子(Polintons)中获得了DNA聚合酶基因。VD2链的非结构蛋白基因ns3与杆状病毒中的颗粒体病毒(Granulovirus)和细小病毒的双义浓核病毒(Ambidensovirus)同源;次要结构蛋白基因mcp起源于双链RNA呼肠孤病毒。家蚕二分浓核病毒复杂的进化历程揭示了物种间基因转移对新病毒产生的重要性。(本文来源于《蚕业科学》期刊2019年03期）
刘培文[2]（2019）在《白纹伊蚊雄性决定基因AalNix功能的研究与非缺陷型重组蚊浓核病毒的构建和效果测试》一文中研究指出研究背景:伊蚊传播的疾病,如登革热,寨卡和基孔肯雅热,正在成为全球重大的公共卫生突发事件,而黄热病等旧的威胁也正在重新出现。白纹伊蚊作为一种重要的传病媒介,已经扩散到除南极洲以外的其他大陆,呈现全球扩散的严峻态势,已经成为最危险的100种入侵物种之一。由于缺乏安全有效的疫苗和特效药物,长期以来蚊媒种群防制是蚊媒传染病防控的关键部分,蚊媒种群防制主要有种群减少和种群替换。种群减少的主要手段就是通过施用化学杀虫剂来减少蚊媒种群或通过去除幼虫孳生地来防止蚊虫繁殖。然而随着化学杀虫剂的大量使用,蚊虫对杀虫剂抗性的相继升高,近年来蚊媒传染病的感染率逐年攀升,环境污染等问题也相继出现。由于蚊浓核病毒(Mosquitodensovirus,MDV)特异感染蚊类及其生活史的特性,让其具有成为高效安全生物杀蚊剂的潜力。发展MDV为新型生物杀蚊剂将为蚊媒传染病的生物防制提供一种新的思路。由于野生型MDV存在作用时间长,毒性弱的特点,对其进行基因重组,增强对蚊虫的致病性是一种可行的办法。前期的研究中,在MDV中引入了蝎毒基因和小干扰RNA以增强杀蚊效果,然而随着外源基因的引入,该病毒也丧失了自主复制能力,而这也是蚊浓核病毒发展为生物杀蚊剂的瓶颈。由于蚊媒传染病毒通过雌蚊吸血传播,控制雌蚊种群数量是蚊媒防制方法的核心,目前基于释放绝育转基因蚊减少野外蚊虫种群来控制登革热等蚊媒传染病的遗传策略已经进行了尝试并取得了成功。课题组前期研究已证实白纹伊蚊AalNix是雄性特异基因却具有复杂的基因结构,但是AalNix的功能还有待进一步研究。C6/36来自于雄性白纹伊蚊,然而C6/36细胞是否可作为性别决定机制研究的模型也尚不明确。目的:1.利用内含子内小RNA的表达策略,构建表达内源miRNA(Endengous miRNAs),miRNA 海绵(miRNA sponge)以及人工 miRNA(Artifitial miRNA,amiRNA)的MDV载体。重组MDV特异感染进入蚊细胞,分别诱导内源miRNA的过表达和沉默,以及诱导内源靶基因沉默。2.比较sgRNA在C6/36与白纹伊蚊胚胎中对AatNix的敲除效率;探究AalNix在C6/36细胞内是否参与调控性别决定通路,以明确C6/36细胞是否适合进行AalNix调控性别决定通路的研究;探究AalNix敲除是否导致雄性内生殖器的畸形和雌性化,进一步阐明AalNix在白纹伊蚊雄性发育中的功能。方法:1.利用内含子内小RNA的表达策略,分别构建表达miRNA,miRNA海绵和amiRNA的重组MDV载体。评估重组MDV中的人工内含子在蚊细胞内的剪接效率,并分别在蚊体内外验证重组MDV对内源性miRNA的过表达和沉默效果。透射电镜检测重组MDV病毒的完整性。PCR和DNA测序检测大肠杆菌stbl3株和C6/36细胞内重组MDV载体和重组MDV的遗传稳定性。qPCR检测重组MDV在C6/36细胞内以及白纹伊蚊幼虫孳生水体中的病毒增殖情况。2.针对AalNix外显子1设计sgRNA,构建同时表达相应sgRNA和Cas9的载体并转染入C6/36细胞测试各sgRNA的基因编辑效率。在AalNix中敲入RFP和Puromycin抗性基因,药筛和流式细胞术分选富集AalNix缺陷细胞,RT-qPCR检测aaldsxF和aalfruF的表达。体外合成的sgRNA与Cas9蛋白共注射白纹伊蚊胚胎,解剖性别表型异常成蚊观察其内生殖器形态,HRMA和测序验证AalNix的敲除效率,并分别检测doublesex和fruitless雌性和雄性剪接体的表达量。结果:1.成功构建了非缺陷型MDV载体和表达荧光的重组缺陷型MDV载体。重组病毒载体转染C6/36后,人工内含子可发生高效的剪切,感染蚊幼虫后,病毒可在体内播散。内含子内miRNA表达策略的MDV成功在蚊体内外分别促进了miR-210和let-7的高表达。内含子内miRNA海绵表达策略的MDV在蚊体内外分别诱导了 miR-210和let-7的沉默。内含子内amiRNA表达策略的MDV在蚊体内外诱导了靶基因V-ATpase基因沉默。重组MDV透射电镜下检测到完整病毒,感染C6/36和幼虫后,增殖能力与野生MDV无差异。重组MDV载体和重组MDV具有遗传稳定性。2.成功构建了 5个sgRNA的表达载体,其中sgRNA1和sgRNA2对AalNix具有基因编辑活性,sgRNAl的突变率为10.00%(4/40),sgRNA2的突变率为17.50%(7/40)。C6/36敲除AalNix后,aaldsxF和aalfruF的表达量均呈升高趋势。sgRNA1,sgRNA2和Cas9蛋白共注射白纹伊蚊胚胎,检测到36只畸形和雌性化表型的成蚊,其中大多数个体的的内生殖器也发生了畸形和雌性化,将其中20只进行HRMA,检测到1只sgRNA1位点熔解曲线异常,15只sgRNA2位点溶解曲线异常。测序的9只表型异常蚊中sgRNA2位点均存在突变,而sgRNA1位点突变仅有3只。sgRNA2的敲除效率高于sgRNA1,这与C6/36细胞中的效果一致。AalNix敲除后,aaldsx和aalfru均呈倾向雌性特异剪接的趋势。结论:1.重组MDV可以诱导内源性miRNA的过表达和沉默,以及通过表达amiRNA在蚊体内外诱导有效的基因沉默。重组MDV具有野生MDV般的增殖和二次传播能力。本研究首次构建了一种非缺陷型重组MDV的miRNA传递系统,该系统可作为蚊类基因功能分析的工具,为应用病毒的转基因共生体(viral paratransgenesis)进行蚊媒防制奠定了基础。2.针对AalNix的sgRNA1和sgRNA2在C6/36细胞和白纹伊蚊胚胎中具有一致的基因敲除效率。C6/36细胞可应用于AalNix对性别决定通路调控的研究。AalNix对雄性内生殖器的发育至关重要,进一步证实AalNix是雄性发育所必需的。尽管白纹伊蚊和埃及伊蚊的分化距离达到七千万年,但是Nix是一个保守的性别决定因子。(本文来源于《南方医科大学》期刊2019-05-16）
李静[3]（2019）在《一株新的蚊浓核病毒AalDV-7的分离、鉴定和病原学分析》一文中研究指出研究背景:蚊虫传播的病毒性疾病(Mosquito-borne viral diseases,MBVDs)对全球公共卫生构成了严重威胁,严重危害人类生命健康,影响社会的稳定。蚊虫防制仍然是综合蚊虫管理(Integrate mosquito management,IMM)计划中的核心干预策略,以减少MBVDs的传播。传统的化学农药是目前使用最频繁和最广泛的控制蚊虫的方法,然而,化学农药对生态系统造成了严重的负面影响,蚊虫也出现了杀虫剂抗性(Insecticide resistance,IR)问题,这使得开发新的蚊虫防制方法至关重要。而生物杀虫剂的研究与应用将为蚊虫的防制提供新的策略。生物防制主要应用蚊虫真菌,细菌、病毒等病原体、天敌等来达到防治效果,对非靶标生物和有益生物无毒害,不危害生态系统,蚊虫对其不易产生抗性。蚊浓核病毒(Mosquitodensovirus,MDVs)属于蚊虫特异性病毒,特异性感染蚊类,可以在自然界中垂直传播和水平传播。高滴度病毒可以直接杀伤蚊类,低滴度可以影响蚊类寿命、产卵量、孵化率等,从而降低媒介种群数量。目前多种MDVs的全基因组己经成功构建为感染性克隆质粒载体,便于进行基因改造使其成为很好的基因转移载体和基因表达载体。因此,对MDVs进行分离和鉴定,分析MDVs的分子生物学和病原性特点,将为发展MDVs为生物杀虫剂和基因表达载体提供理论基础,为发展生物杀虫剂提供更多可替代的选择。目的:对野外白纹伊蚊(Aedes albopictuds)成蚊中分离出的一株蚊浓核病毒(Aedes albopictus densovirus-7,AalDV-7)进行鉴定,对其全基因组、转录本、蛋白进行分析,实验室初步测试该病毒对白纹伊蚊、埃及伊蚊(Aedesaegypti)和致倦库蚊(Culexququefasciatus)的幼虫的病原性,为发展MDVs为生物杀虫剂和基因表达载体提供理论基础。方法:通过超速密度梯度离心的方法,从广东省广州市野外采集的白纹伊蚊体内成功分离一株蚊浓核病毒,并将其命名为白纹伊蚊浓核病毒-7(AalDV-7)。我们通过克隆、测序分析了AalDV-7的基因组特征,并对叁个开放阅读框(ORF)的转录和翻译进行了分析。利用重组载体和野生病毒共转染细胞获得重组病毒感染幼虫后观察重组病毒在蚊幼虫体内的入侵部位和扩散。将登革热和寨卡病毒的主要媒介白纹伊蚊、埃及伊蚊和西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)媒介致倦库蚊的幼虫暴露于 1.00×10s、1.00×109、1.00×l010、1.00×1011geq/ml剂量梯度的病毒液中感染24 h后,每24 h记录幼虫的生存情况,以分析AalDV-7的病原性。另外,评估了 1.00×108geq/ml病毒浓度下,AalDV-7在宿主体内的感染率和病毒相对滴度,以探究其对蚊虫防制的潜力。结果:经过克隆和测序,AaIDV-7的完整序列己提交GeneBank(GeneBank:MK182384)。AalDV-7的基因组完整基因组长4,048 nt,含叁个重迭的ORFs。SDS-PAGE证明其可编码NS 1蛋白、VP蛋白。经RACE实验,VP的转录起始位点(Transcription initiation site,TIS)位于ATG上游 158 nt或 1 nt,NS1/NS2基因的TIS位于ATG上游6 nt而NS1和NS2基因共享一个TIS位点。NS与VP基因享有一个共同的转录终止位点(Transcription termination sites,TTS),位于VP基因翻译终止位点后60 nt。系统进化树分析表明,AalDV-7与MDVs聚类,其中大多数是从成蚊中分离出来的。AalDV-7感染伊蚊的初始部位主要为肛门乳头,第二常见部位是毛细胞基部,其次是肛门乳头基础部。感染致倦库蚊的初始部位仅出现在肛门乳头。重组病毒可分布于幼虫全身,包括前肠,中肠,后肠,肌肉组织等。AalDV-7对叁种蚊虫的致病性差异显着,当白纹伊蚊的幼虫暴露于1.00×Il010geq/ml的病毒液24h后,死亡率大于50%,LD50为109.48 geq/ml。暴露于1011ugeq/ml的病毒液24h后,死亡率为82%,LT50为7.72d。与埃及伊蚊和致倦库蚊相比,具有最低的半数致死浓度(Median lethal dose,LD50)和较短的半数致死时间(Median lethal time,LT50)。亚致死效应分析还表明,AalDV-7感染可降低化蛹率和羽化率。叁种蚊虫1-2龄幼虫均表现出100%的感染率,在致倦库蚊的1-2龄幼虫中观察到最高的相对滴度。结论:AalDV-7对叁种蚊虫的致病性差异显着。AalDV-7对白纹伊蚊致病性强,有望作为生物杀虫剂应用于蚊媒防制。另外,AalDV-7感染致倦库蚊后,有很高的感染率和病毒滴度,但对其致死性很弱,这使得AalDV-7有望成为致倦库蚊体内的基因表达载体,用于基因功能的研究。总之,对MDVs进行分离和鉴定,分析MDVs的分子生物学和病原学特征,丰富了蚊虫病原体病毒的资源,将为生物杀虫剂的发展提供更多的选择。(本文来源于《南方医科大学》期刊2019-05-01）
胡朝阳,刘伟,邓炎春,唐培培,姚勤[4]（2018）在《家蚕二分浓核病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及其特异性验证》一文中研究指出家蚕二分浓核病毒(Bm BDV) NS1蛋白是一个与病毒复制相关的多功能蛋白。为获得NS1蛋白的单克隆抗体,设计并合成了12条NS1蛋白的抗原表位肽段,分别免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,获得了18株能分泌抗体的阳性杂交瘤细胞。在大肠埃希菌中表达NS1作为抗原,通过Western blot对所获得的单克隆抗体进行验证。结果表明,由8/C278细胞株获得的单克隆抗体能特异识别重组的NS1蛋白,所用抗原表位序列为DIPPEEYRELRT。利用该抗体能检测到Bm BDV感染家蚕中肠组织中NS1蛋白的表达。该研究为深入探索NS1蛋白的功能打下了基础。(本文来源于《蚕业科学》期刊2018年05期）
苗迪[5]（2018）在《家蚕二分浓核病毒重组病毒的致病性及生物安全性研究》一文中研究指出家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,BmBDV)属于二分DNA病毒科二分浓核病毒属。BmBDV基因组由两个线性单链分子(VD1,VD2)组成。BmBDV主要在家蚕中肠细胞中复制,导致家蚕患浓核症类似症状。BmBDV基因组结构与细小病毒相似,复制方式与腺病毒类似。因此,BmBDV具有开发成兼具细小病毒与腺病毒特征的病毒载体的潜能。BmBDV通过重组外源基因,可以创建具有特定功能的病毒载体。如通过遗传改造开发成新型安全高效的生物杀虫剂。从东亚钳蝎中分离出的蝎毒素BmK ITa1是一种抑制型抗昆虫毒素,由65个氨基酸残基组成,具有对昆虫专一选择性的神经麻痹致死作用。在BmBDV重组病毒中引入蝎毒素BmK ITa1基因,是否能够增强BmBDV毒杀害虫的作用尚不清楚。本研究的主要内容包括:?构建重组BmK ITa1基因的BmBDV病毒载体;?重组BmK ITa1基因的BmBDV病毒对昆虫细胞和家蚕的感染性;?重组BmK ITa1病毒对哺乳动物细胞的感染性;(4)BmBDV病毒的基因与其它昆虫病毒基因的同源性。研究结果如下;(1)构建重组BmK ITa1基因的BmBDV病毒载体。首先构建了BmK ITa1基因表达盒。将公司合成的两端携带酶切位点的BmK ITa1基因插入到杆状病毒立刻极早期基因启动子ie1和sv40加尾信号序列之间,构建成蝎毒素表达盒质粒pT-ie1-BmK ITa1-sv40。然后在BmBDV次要结构蛋白mcp基因中插入蝎毒素BmK ITa1表达盒,构建了重组蝎毒素病毒载体pVD2-mcp/BmK ITa1。(2)重组BmK ITa1基因的BmBDV病毒载体对昆虫细胞和家蚕的感染性。重组病毒pVD2-mcp/BmK ITa1与原病毒基因组(VD1,VD2)线性化后共转染Hi5昆虫细胞。与转染pUC119的对照相比,细胞在转染96小时后出现变圆,漂浮等症状,继续培养出现细胞破裂,与原病毒基因组(线性化的VD1,VD2)感染一致。使用特异性引物反转录PCR在病变细胞中检测到BmK ITa1基因的转录;使用His和VP单克隆抗体Western blot检测到蝎毒蛋白和病毒VP蛋白。将病变的Hi5细胞裂解液经桑叶涂布添食易感BmBDV家蚕幼虫,回感4天后幼虫出现厌食,痉挛,麻痹死亡等症状。表明重组的外源BmK ITa1基因能够在家蚕中肠中表达并增强BmBDV的毒力。(3)重组BmK ITa1病毒对哺乳动物细胞的感染性。重组病毒pVD2-mcp/BmK ITa1与原病毒基因组(VD1,VD2)线性化后共转染小鼠成纤维细胞L929,在转染后细胞生长状态正常,直至转染后10d与空白对照细胞无明显差异。使用反转录PCR未检测到蝎毒素基因的转录;Western blot也未检测到病毒VP蛋白的表达,说明在转染后L929细胞中没有病毒粒子产生,初步认为重组蝎毒素BmBDV载体不感染哺乳动物细胞。(4)BmBDV病毒的基因与其它昆虫病毒基因的同源性。使用Blast搜索序列相似蛋白,进化分析结果显示VD1的ns1和vp基因与浓核病毒的ns1和vp基因同源,DNA聚合酶polB与真核生物自合成DNA转座子(波林顿转座子)中的聚合酶基因同源,ns1和vp基因在同一条链,推测该病毒起源于一个原始的单义浓核病毒,通过基因转移从波林顿转座子中获得了DNA聚合酶基因,并以浓核病毒单义向双义进化机制,组装基因组;VD2的NS3蛋白与颗粒体病毒和双义浓核病毒NS3蛋白同源,次要结构蛋白mcp基因来源于双链RNA呼肠孤病毒,推测VD2起源于一个原始的双义浓核病毒。终上所述,研究表明重组BmK ITa1基因加速家蚕幼虫的死亡,增强了BmBDV致病性;BmBDV对小鼠成纤维细胞L929无感染性,具备哺乳动物生物安全性;进化分析发现VD1起源于单义浓核病毒,VD2起源于双义浓核病毒。本研究对进一步了解BmBDV的特性及其用于病毒载体的研究具有重要意义。(本文来源于《江苏大学》期刊2018-06-01）
张亚慧[6]（2018）在《家蚕二分浓核病毒结构蛋白与潜在受体蛋白的互作研究》一文中研究指出家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,BmBDV)是国际病毒分类委员会(ICTV)于2012年新设立的二分DNA病毒科中唯一的代表种。BmBDV特异性侵染家蚕中肠柱状上皮细胞,病蚕体呈现软化、中肠柱状细胞浓核症、中肠中后部变黄等症状。病毒基因组包含两条线性ssDNA分子(VD1和VD2),分别独立包装于病毒衣壳中。VD1编码的主要结构蛋白VP以及VD2编码的次要结构蛋白P133在BmBDV侵染家蚕的过程中发挥着重要的作用。前期研究表明,对BmBDV敏感的家蚕品系中肠细胞中表达一个含有12个跨膜结构域的氨基酸转运蛋白NSD-2。而在对BmBDV具抗性的家蚕品系的中肠细胞中所表达的NSD-2蛋白则缺失一段跨膜区域,由此推测NSD-2蛋白可能为BmBDV感染宿主细胞的潜在受体。本研究的主要目的包括:(1)构建稳定表达完整NSD-2蛋白的家蚕卵巢细胞系Bm N(+~(nsd-2));(2)体外表达BmBDV结构蛋白VP以及P133,在BmN(+~(nsd-2))细胞系中研究病毒结构蛋白VP与NSD-2蛋白的相互作用;(3)研究BmN(+~(nsd-2))细胞系作为BmBDV体外感染敏感细胞系的潜力。本论文研究内容可分为以下叁个部分:第一部分:构建稳定表达完整NSD-2蛋白的家蚕卵巢细胞系BmN(+~(nsd-2))。首先构建了表达BmBDV敏感性基因+~(nsd-2)的质粒pIZ-+~(nsd-2)并转染家蚕卵巢细胞BmN。利用pIZ-V5/His载体自带的Zeocin抗性筛选标记,对转染后的BmN细胞进行筛选。筛选传代30次后,获得稳定的家蚕细胞系BmN(+~(nsd-2))。通过western blotting和RT-PCR技术检测NSD-2蛋白的表达和+~(nsd-2)基因的转录,结果显示在BmN(+~(nsd-2))细胞中能够检测到NSD-2蛋白的表达以及+~(nsd-2)基因的转录;利用免疫荧光技术检测NSD-2蛋白在BmN(+~(nsd-2))细胞中的定位,结果显示NSD-2蛋白主要定位在BmN(+~(nsd-2))细胞的细胞膜上。第二部分:体外表达BmBDV结构蛋白VP以及P133,在BmN(+~(nsd-2))细胞系中研究病毒结构蛋白与NSD-2蛋白的相互作用。利用昆虫表达载体pIB/pIZ-V5/His构建表达病毒主要结构蛋白VP以及次要结构蛋白P133的表达质粒,分别转染BmN(+~(nsd-2))细胞。制备了主要结构蛋白VP单克隆抗体,并依据VP蛋白的β桶结构构建了表达不同长度vp基因的质粒。运用western blotting检测VP和P133蛋白的表达,结果显示在BmN(+~(nsd-2))细胞中均能检测到VP蛋白、P133蛋白以及NSD-2蛋白的表达。为了研究NSD-2蛋白与BmBDV主要结构蛋白VP间的相互作用,使用VP单克隆抗体能够检测到VP与NSD-2-V5融合蛋白共沉淀;其次使用V5标签多克隆抗体,可以检测到NSD-2-V5融合蛋白与VP蛋白的共沉淀;结果表明VP与NSD-2蛋白在BmN(+~(nsd-2))细胞中具有相互作用。利用免疫荧光的方法检测到VP与NSD-2蛋白在BmN(+~(nsd-2))细胞中有共定位。这些研究结果显示NSD-2蛋白与BmBDV主要结构蛋白VP蛋白间存在相互作用。第叁部分:研究BmN(+~(nsd-2))细胞系作为BmBDV体外感染敏感细胞系的潜力。以纯化的BmBDV病毒悬液(浓度:中肠肠干20 mg/mL)侵染BmN(+~(nsd-2))细胞。利用荧光定量PCR技术和免疫荧光技术检测BmBDV基因的转录以及病毒主要结构蛋白VP的表达,分析BmBDV对BmN(+~(nsd-2))细胞的侵染性。然而,在侵染的BmN(+~(nsd-2))细胞中免疫荧光实验并没有检测到病毒的入侵以及VP蛋白的表达;实时荧光定量PCR技术也没有检测到vp基因以及ns1基因的转录;暗示着BmBDV可能不入侵BmN(+~(nsd-2))细胞或者不能在细胞内复制。综上所述,本研究成功构建了稳定表达BmBDV敏感性基因+~(nsd-2)的家蚕细胞系Bm N(+~(nsd-2)),潜在受体蛋白NSD-2与病毒主要结构蛋白VP间存在相互作用且在BmN(+~(nsd-2))细胞中共定位;BmBDV可能不侵染BmN(+~(nsd-2))细胞系,表明NSD-2蛋白是主要但并不是病毒的唯一受体。(本文来源于《江苏大学》期刊2018-06-01）
邓炎春[7]（2018）在《家蚕二分浓核病毒与宿主的互作以及病毒侵染抗性家蚕研究》一文中研究指出家蚕(Bombyx mori),作为鳞翅目模式生物,同时也是具有重要经济价值的驯化昆虫。家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,BmBDV)是对蚕业危害较为严重的家蚕病原微生物之一,该病毒感染具有宿主专一性和组织特异性,仅感染家蚕中肠上皮柱状细胞,使其细胞核膨大,被感染的家蚕并表现出典型的空头性软化病病症。该病毒粒子为二十面体非囊膜包裹结构,病毒基因组包含两个线性的单链DNA片段,一个是6.5 kb(VD1,Viral DNA 1),一个是6 kb(VD2,Viral DNA 2),并分别由各自的衣壳所包裹。该病毒归属于二分DNA病毒科二分浓核病毒属,是目前唯一自编码DNA聚合酶的单链DNA二分体病毒。但病毒的入侵机制和致病机理还未得到完全解析以及宿主对该病毒的抗性机制也未明了。本研究以敏感性家蚕华八_(叁五)和抗病毒的近等基因系华八_(BC7)为实验对象,首先通过RNA高通量测序分析BmBDV感染的敏感家蚕中肠组织的转录组,从转录组水平解析病毒与宿主的互作;然后我们研究了病毒是否能入侵抗性家蚕;最后,我们分析了病毒的基因组能否整合到宿主的基因组。本论文研究结果如下:1.为了准确分析BmBDV感染家蚕幼虫后的基因表达变化,我们首先对7种常见的内参基因:核糖体蛋白L3(RPL3)、28S核糖体RNA(28S rRNA)、肌动蛋白(Actin3)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、TATA盒结合蛋白(TBP)、α-微管蛋白(α-Tubulin)、泛素结合蛋白(UBQ)在感病和不感病条件下的中肠组织中的表达稳定性进行评估,应用geNorm、Normfinder和Bestkeeper叁种常规方法来筛选最佳的内参基因,鉴定出RPL3为最合适的内参基因,而UBQ是最不稳定的内参基因。以RPL3为内参,并通过qPCR评估了感染BmBDV的家蚕中BmSP142的相对表达水平,发现BmSP142的表达变化在抗性和敏感性家蚕中差异显着,表明BmSP142可能参与了抗病毒反应。2.为研究分析家蚕和Bm BDV的互作,我们选取BmBDV感染后0 h、6 h、24 h、48 h的敏感家蚕中肠后部,进行比较转录组学分析,我们发现BmBDV感染能够诱导家蚕的全基因组转录水平发生巨大变化。和健康家蚕对照相比,我们共鉴定到319个差异表达基因,其中138个表达上调,181个表达下调。对差异转录本进行GO功能分析,筛选到包括抗菌肽和肽聚糖识别蛋白等5个免疫相关基因和9个防御及压力应答相关基因上调、4个几丁质生物合成相关基因下调,6个保幼激素相关基因显着下调。对差异转录本进行KEGG分析发现,这些差异基因主要参与物质代谢、N-聚糖生物合成和蛋白质合成与加工、细胞色素c P450代谢和异型自噬体形成途径等过程。同时通过对病毒转录本进行分析发现病毒基因的表达模式存在时序性,VD1编码的基因的表达早于VD2编码的基因,但并未发现病毒基因的可变剪切。3.比较分析了BmBDV处理的敏感家蚕和抗性家蚕中病毒基因组复制、病毒基因表达以及组织病理的差异,我们发现BmBDV可以入侵抗性家蚕,病毒的基因组能在抗性家蚕中持续地低水平复制,并能在抗性家蚕中表达病毒基因,但感染后期病毒基因的表达被阻断。通过Southern blot和FIPN-PCR进一步研究发现,病毒基因组可能并不整合到宿主基因组上。(本文来源于《江苏大学》期刊2018-06-01）
李玉英[8]（2018）在《桃蚜浓核病毒基因组特征及表达分析》一文中研究指出2003年,国际上首次从荷兰的桃蚜(Myzus persicae)分离获得桃蚜浓核病毒并测定了该病毒的部分基因组序列。目前,关于桃蚜浓核病毒的进化关系与侵染分子机理所知甚少。在早先获得桃蚜浓核病毒杨凌株系(MpDV-YL)基因组编码序列的基础上,我们又扩增获得了桃蚜浓核病毒云南株系的基因组编码序列(MpDV-YN),并分析了其序列特征及桃蚜浓核病毒进化关系。此外,我们检测了桃蚜浓核病毒在桃蚜及桃蚜寄主植物中的表达和复制情况,研究结果如下:1、根据已获得的MpDV-YL基因组序列设计重迭PCR引物。采用PCR从采自云南省昆明地区的桃蚜中扩增获得大小为5483bp的桃蚜浓核病毒片段。序列分析表明,该基因组与MpDV-YL基因组编码策略一致,即正义链含有两个ORF(ORF1和ORF2),预测编码非结构蛋白NS1和NS2,而反义链含有两个ORF(ORF3和ORF4),预测编码结构蛋白VP1和VP2,该结果进一步显示中国国内的桃蚜浓核病毒与桃蚜浓核病毒荷兰株系的编码策略不同;2、采用定量PCR检测MpDV-YL在桃蚜幼虫的头部、肠道、胚胎及表皮组织中的复制。结果表明,桃蚜浓核病毒在蚜虫肠道内的拷贝数极显着高于在其它组织中,揭示该病毒主要在蚜虫的肠道内复制;3、采用定量PCR检测MpDV-YL预测的NS1、NS2、VP1、VP2编码基因在蚜虫体内及幼蚜头部、肠道、胚胎及表皮组织中的转录水平。结果表明,VP1编码基因在蚜虫体内的转录水平极显着高于其它基因的表达水平;同时,各基因均在蚜虫肠道内存在较高的转录水平;4、为了检测桃蚜浓核病毒能否在桃蚜寄主植物体内转运,我们检测了感染MpDV-YL桃蚜取食寄主(辣椒和甘蓝)后这两种植物叶片、茎、根中MpDV-YL的复制情况。定量PCR结果显示,MpDV-YL在两种植物叶片中的基因组拷贝数显着高于其它组织;进一步分析表明,经DNase I处理后,两种植物叶片中MpDV-YL含量极显着降低,推测在桃蚜寄主植物叶片中存在的MpDV-YL可能来源于叶片表面蚜虫蜜露的污染;5、构建了的MpDV-YL VP1和VP2基因的瞬时表达质粒并转染草地贪夜蛾Sf9细胞。双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)检测结果表明VP1与VP2之间可能不存在相互作用;随后,构建了6×His融合的VP1和VP2瞬时表达质粒并转染Sf9细胞。Western blot检测结果表明,VP1和VP2在Sf9细胞中都表达了预期大小的蛋白,推测这两个蛋白未发生剪切。综上所述,国内存在的桃蚜浓核病毒基因组编码策略可能与已发现的桃蚜浓核病毒荷兰株系存在较大差异,而该类病毒在无脊柱动物细小病毒的进化中可能单独作为一个分支。桃蚜浓核病毒主要在蚜虫肠道内复制,该类病毒可能不能通过蚜虫取食而进入桃蚜植物组织并发生转运。上述结果为进一步研究桃蚜浓核病毒侵染机理奠定了一定基础。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2018-05-01）
石向辉,顾金保[9]（2017）在《亚致死量白纹伊蚊浓核病毒-3感染对白纹伊蚊吸血与生殖的影响》一文中研究指出目的研究亚致死量白纹伊蚊浓核病毒-3(AalDV-3)感染对白纹伊蚊吸血与生殖的影响。方法用低于半数致死量浓度(107copies/mL)的AalDV-3感染白纹伊蚊雌性成虫,统计感染组与对照组蚊虫的吸血率与吸血量,比较雌性饱血后产卵数与卵的孵化率以及雌蚊存活率的差异。结果 AalDV-3感染组吸血率为(70.67±8.08)%,平均吸血量(1.68±0.26)mg,平均产卵量为(43.00±8.84)粒/只,孵化率为(31.33±3.57)%;而对照组白纹伊蚊吸血率为(87.33±3.06)%,吸血量(2.10±0.27)mg,产卵量(69.53±10.69)粒/只,孵化率(51.00±3.61)%。与对照组相比,AalDV-3感染组白纹伊蚊的吸血率、平均吸血量、平均产卵量和孵化率均明显下降(P<0.05)。感染组雌蚊幸存率为(48.67±3.21)%,也低于对照组幸存率[(67.33±3.06)%,(P<0.05)]。结论 AalDV-3感染可降低白纹伊蚊吸血率、产卵率、孵化率和存活率,具有潜在的生物防制价值。(本文来源于《热带医学杂志》期刊2017年07期）
刘伟[10]（2017）在《家蚕二分浓核病毒NS1蛋白表达分析及其互作蛋白研究》一文中研究指出家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,BmBDV)归属于新设定的二分DNA病毒科二分浓核病毒属,是目前唯一一个编码DNA聚合酶的单链二分体DNA病毒。该病毒曾归属于细小病毒科浓核病毒亚科,与家蚕浓核病毒Ⅰ相似,病毒粒子为二十面体非囊膜包裹结构,主要感染家蚕中肠柱状上皮细胞,并引发家蚕浓核症。Bm BDV基因组包括两个节段的单链DNA分子VD1 6.6 kb和VD26.0 kb,独立包装。BmBDV NS1由VD1-ORF2编码,具有316个氨基酸残基,其理论分子量大小为36 KDa,等电点8.70,生物信息学结果表明Bm BDV NS1蛋白与细小病毒NS1蛋白同源。先前的研究发现NS1蛋白是一个多功能蛋白,具有ATPase、解旋酶及绑定特定DNA序列的活性。然而,该蛋白的表达模式及其与宿主或病毒蛋白的相互作用还未阐明。在本研究中,我们首先设计了12条含12个氨基酸的短肽抗原,制备NS1的单克隆抗体,其中一个抗体具有较高的特异性和效价,能特异识别大肠杆菌中表达的NS1和病毒感染的家蚕中肠中的NS1,抗原表位为DIPPEEYRELRT。然后分析了ns1基因在病毒感染的中肠组织中的表达模式,结果显示ns1在病毒感染的晚期表达,其转录本大小约1.1 kb,从感染后48小时(hpi)开始能检测到,到72 hpi转录本丰度最高,到96 hpi转录水平降低;NS1蛋白从72 hpi开被检测到,直到120 hpi,表达水平逐渐增加,NS1还具有磷酸化修饰形式。最后,我们利用制备的NS1单抗,通过免疫共沉淀方法在病毒感染的中肠组织中分离纯化了NS1的互作蛋白,质谱鉴定结果表明有23个宿主因子与NS1相互作用有关。在这些蛋白中,大多数是一些维持细胞形态结构的细胞骨架蛋白,结合NS1在病毒感染的晚期表达,推测NS1可能与细胞的退化裂解和子代病毒的释放有关。还有一些与物质和能量代谢,物质运输,翻译延伸,蛋白质降解及免疫相关的蛋白因子,暗示NS1可能与相应蛋白相互作用调控这些生物过程。(本文来源于《江苏大学》期刊2017-06-06）
浓核病毒论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
研究背景:伊蚊传播的疾病,如登革热,寨卡和基孔肯雅热,正在成为全球重大的公共卫生突发事件,而黄热病等旧的威胁也正在重新出现。白纹伊蚊作为一种重要的传病媒介,已经扩散到除南极洲以外的其他大陆,呈现全球扩散的严峻态势,已经成为最危险的100种入侵物种之一。由于缺乏安全有效的疫苗和特效药物,长期以来蚊媒种群防制是蚊媒传染病防控的关键部分,蚊媒种群防制主要有种群减少和种群替换。种群减少的主要手段就是通过施用化学杀虫剂来减少蚊媒种群或通过去除幼虫孳生地来防止蚊虫繁殖。然而随着化学杀虫剂的大量使用,蚊虫对杀虫剂抗性的相继升高,近年来蚊媒传染病的感染率逐年攀升,环境污染等问题也相继出现。由于蚊浓核病毒(Mosquitodensovirus,MDV)特异感染蚊类及其生活史的特性,让其具有成为高效安全生物杀蚊剂的潜力。发展MDV为新型生物杀蚊剂将为蚊媒传染病的生物防制提供一种新的思路。由于野生型MDV存在作用时间长,毒性弱的特点,对其进行基因重组,增强对蚊虫的致病性是一种可行的办法。前期的研究中,在MDV中引入了蝎毒基因和小干扰RNA以增强杀蚊效果,然而随着外源基因的引入,该病毒也丧失了自主复制能力,而这也是蚊浓核病毒发展为生物杀蚊剂的瓶颈。由于蚊媒传染病毒通过雌蚊吸血传播,控制雌蚊种群数量是蚊媒防制方法的核心,目前基于释放绝育转基因蚊减少野外蚊虫种群来控制登革热等蚊媒传染病的遗传策略已经进行了尝试并取得了成功。课题组前期研究已证实白纹伊蚊AalNix是雄性特异基因却具有复杂的基因结构,但是AalNix的功能还有待进一步研究。C6/36来自于雄性白纹伊蚊,然而C6/36细胞是否可作为性别决定机制研究的模型也尚不明确。目的:1.利用内含子内小RNA的表达策略,构建表达内源miRNA(Endengous miRNAs),miRNA 海绵(miRNA sponge)以及人工 miRNA(Artifitial miRNA,amiRNA)的MDV载体。重组MDV特异感染进入蚊细胞,分别诱导内源miRNA的过表达和沉默,以及诱导内源靶基因沉默。2.比较sgRNA在C6/36与白纹伊蚊胚胎中对AatNix的敲除效率;探究AalNix在C6/36细胞内是否参与调控性别决定通路,以明确C6/36细胞是否适合进行AalNix调控性别决定通路的研究;探究AalNix敲除是否导致雄性内生殖器的畸形和雌性化,进一步阐明AalNix在白纹伊蚊雄性发育中的功能。方法:1.利用内含子内小RNA的表达策略,分别构建表达miRNA,miRNA海绵和amiRNA的重组MDV载体。评估重组MDV中的人工内含子在蚊细胞内的剪接效率,并分别在蚊体内外验证重组MDV对内源性miRNA的过表达和沉默效果。透射电镜检测重组MDV病毒的完整性。PCR和DNA测序检测大肠杆菌stbl3株和C6/36细胞内重组MDV载体和重组MDV的遗传稳定性。qPCR检测重组MDV在C6/36细胞内以及白纹伊蚊幼虫孳生水体中的病毒增殖情况。2.针对AalNix外显子1设计sgRNA,构建同时表达相应sgRNA和Cas9的载体并转染入C6/36细胞测试各sgRNA的基因编辑效率。在AalNix中敲入RFP和Puromycin抗性基因,药筛和流式细胞术分选富集AalNix缺陷细胞,RT-qPCR检测aaldsxF和aalfruF的表达。体外合成的sgRNA与Cas9蛋白共注射白纹伊蚊胚胎,解剖性别表型异常成蚊观察其内生殖器形态,HRMA和测序验证AalNix的敲除效率,并分别检测doublesex和fruitless雌性和雄性剪接体的表达量。结果:1.成功构建了非缺陷型MDV载体和表达荧光的重组缺陷型MDV载体。重组病毒载体转染C6/36后,人工内含子可发生高效的剪切,感染蚊幼虫后,病毒可在体内播散。内含子内miRNA表达策略的MDV成功在蚊体内外分别促进了miR-210和let-7的高表达。内含子内miRNA海绵表达策略的MDV在蚊体内外分别诱导了 miR-210和let-7的沉默。内含子内amiRNA表达策略的MDV在蚊体内外诱导了靶基因V-ATpase基因沉默。重组MDV透射电镜下检测到完整病毒,感染C6/36和幼虫后,增殖能力与野生MDV无差异。重组MDV载体和重组MDV具有遗传稳定性。2.成功构建了 5个sgRNA的表达载体,其中sgRNA1和sgRNA2对AalNix具有基因编辑活性,sgRNAl的突变率为10.00%(4/40),sgRNA2的突变率为17.50%(7/40)。C6/36敲除AalNix后,aaldsxF和aalfruF的表达量均呈升高趋势。sgRNA1,sgRNA2和Cas9蛋白共注射白纹伊蚊胚胎,检测到36只畸形和雌性化表型的成蚊,其中大多数个体的的内生殖器也发生了畸形和雌性化,将其中20只进行HRMA,检测到1只sgRNA1位点熔解曲线异常,15只sgRNA2位点溶解曲线异常。测序的9只表型异常蚊中sgRNA2位点均存在突变,而sgRNA1位点突变仅有3只。sgRNA2的敲除效率高于sgRNA1,这与C6/36细胞中的效果一致。AalNix敲除后,aaldsx和aalfru均呈倾向雌性特异剪接的趋势。结论:1.重组MDV可以诱导内源性miRNA的过表达和沉默,以及通过表达amiRNA在蚊体内外诱导有效的基因沉默。重组MDV具有野生MDV般的增殖和二次传播能力。本研究首次构建了一种非缺陷型重组MDV的miRNA传递系统,该系统可作为蚊类基因功能分析的工具,为应用病毒的转基因共生体(viral paratransgenesis)进行蚊媒防制奠定了基础。2.针对AalNix的sgRNA1和sgRNA2在C6/36细胞和白纹伊蚊胚胎中具有一致的基因敲除效率。C6/36细胞可应用于AalNix对性别决定通路调控的研究。AalNix对雄性内生殖器的发育至关重要,进一步证实AalNix是雄性发育所必需的。尽管白纹伊蚊和埃及伊蚊的分化距离达到七千万年,但是Nix是一个保守的性别决定因子。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
浓核病毒论文参考文献
[1].苗迪,张亚慧,邓炎春,胡朝阳,于倩.家蚕二分浓核病毒的起源及进化[J].蚕业科学.2019
[2].刘培文.白纹伊蚊雄性决定基因AalNix功能的研究与非缺陷型重组蚊浓核病毒的构建和效果测试[D].南方医科大学.2019
[3].李静.一株新的蚊浓核病毒AalDV-7的分离、鉴定和病原学分析[D].南方医科大学.2019
[4].胡朝阳,刘伟,邓炎春,唐培培,姚勤.家蚕二分浓核病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及其特异性验证[J].蚕业科学.2018
[5].苗迪.家蚕二分浓核病毒重组病毒的致病性及生物安全性研究[D].江苏大学.2018
[6].张亚慧.家蚕二分浓核病毒结构蛋白与潜在受体蛋白的互作研究[D].江苏大学.2018
[7].邓炎春.家蚕二分浓核病毒与宿主的互作以及病毒侵染抗性家蚕研究[D].江苏大学.2018
[8].李玉英.桃蚜浓核病毒基因组特征及表达分析[D].西北农林科技大学.2018
[9].石向辉,顾金保.亚致死量白纹伊蚊浓核病毒-3感染对白纹伊蚊吸血与生殖的影响[J].热带医学杂志.2017
[10].刘伟.家蚕二分浓核病毒NS1蛋白表达分析及其互作蛋白研究[D].江苏大学.2017
论文知识图
