徐骥[1]2004年在《产海藻糖合成酶极地细菌的研究》文中指出本文对以麦芽糖为底物的海藻糖合成酶酶法生成海藻糖进行了研究。论文主要包括产海藻糖合成酶极地微生物的筛选、菌种鉴定、几种因素对粗酶反应的影响和发酵培养基初步优化四个部分。按照确定的筛选方法，从两极地区采集的土壤菌样83株和极地海洋菌20株中最终筛选到一株产海藻糖合成酶转化率最高的一株菌S1，转化率为75.2%。文章通过薄层层析、3,5-二硝基水杨酸测定还原糖和高效液相色谱法等方法对酶产物进行相关的确证实验。实验结果显示，酶反应结果生成海藻糖。并且通过实验发现菌株S1的海藻糖合成酶为胞内酶，酶活力为7.30 u/g菌体。为进一步研究，本文对菌株S1进行了鉴定。通过对菌株S1进行形态特征、培养特征和生理生化特征等实验，对照《伯杰氏细菌鉴定手册》（1984，第八版），确定该菌为假单胞菌属（Pseudomonas）。进一步对该菌采用16S rDNA进行系统发育学鉴定，最终确定为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida S1）。经过比较，在报道的同属菌中，该菌的酶活最高。为了确定酶活测定条件并为今后的酶反应工艺条件提供一定的参考，对影响酶反应的几种因素进行实验。最后确定将0.5mL粗酶液和0.5mL的4%麦芽糖混合置于20℃恒温水浴槽内，在25mM的磷酸缓冲液（pH8.1）中反应20分钟，在此条件下每分钟催化生成1μmol的海藻糖的酶量定义为1u。在发酵条件优化实验中，主要考察了发酵培养基的影响。通过对各种主要因素的实验以及采用神经网络和遗传算法对培养基进行优化计算，最终得到优化培养基组成为：葡萄糖 28.9 g/L，麦芽糖 12.4 g/L，蛋白胨 5.0 g/L，酵母粉 1.86 g/L，Na2HPO4·12 H2O 0.5 g/L，柠檬酸钠·2 H2O 0.5 g/L，pH 7.5。在固定发酵操作条件下，优化后细胞量从15.1 g/L上升到29.8 g/L，单位酶活从7.3 u/g细胞上升到8.42 u/g细胞。
段作营[2]2008年在《极地细菌Pseudomonas putida S1海藻糖合成酶的研究》文中进行了进一步梳理海藻糖是两分子葡萄糖以α-1,1糖苷键连接形成的一种非还原性双糖。作为生物体重要的抗逆应激物,对生命体、生物膜和生物大分子具有非特异性保护作用。它独特的结构和生物学功能使得它在食品工业、医药工业、化妆品工业和农业等领域具有广泛的应用前景。海藻糖合成酶通过分子内的转糖苷作用转化麦芽糖生成海藻糖,它是海藻糖生物合成的重要途径,也是有工业应用价值的酶法生产海藻糖的重要方法之一。目前有关海藻糖合成酶的研究主要集中在高温和中温微生物中,对低温微生物所产海藻糖合成酶研究较少。极地具有极端低温、高盐度及干燥等独特的地理及气候特征,是低温微生物的重要来源。本论文从极地微生物中分离筛选产海藻糖合成酶的低温菌,并对其进行微生物学、分子生物学和酶学研究。本论文研究的目的,一方面是为了拓宽海藻糖合成酶产生菌的来源,获得具有自主知识产权的海藻糖合成酶产生菌,并为利用该菌工业化生产海藻糖提供理论指导,奠定技术基础;另一方面,也为进一步理解海藻糖合成酶在不同微生物中的生理作用、系统进化等提供一定的分子生物学及酶学信息。经过一系列的初筛、复筛和对产物的进一步验证,从83株极地土壤细菌和20株极地海洋细菌中筛选到一株产海藻糖合成酶的极地海洋细菌菌株S1。该菌株具有较强的将麦芽糖转化为海藻糖的能力,其粗酶液转化率为70~76%,部分纯化酶约80~82%。结合菌体形态特征、培养特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果以及系统发育学特征,根据多相分类原则,将其鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida S1。对其生长特性的研究表明,该菌株为耐冷菌和耐盐菌。其所产的海藻糖合成酶属于低温碱性酶。在20℃培养20h后,对P. putida S1进行热激(25℃或30℃30min)或盐胁迫(加入0.5~0.6 mol/L的NaCl)处理,可以使其合成海藻糖合成酶的活性分别提高70~76%和90~92%。而对其进行冷激处理(5℃,0℃和-17℃,30min)未对菌株产海藻糖合成酶表现明显的促进作用。热激和盐胁迫协同处理未表现出明显的协同作用。以P. putida S1染色体DNA为模板,采用PCR技术,成功克隆了P. putida S1的海藻糖合成酶基因treS。基因序列分析结果显示,该基因开放阅读框大小为2067bp,编码的蛋白质分子含688个氨基酸残基,分子量约75.7KD。同Genbank数据库中已公开的海藻糖合成酶基因序列进行同源性比对分析结果表明,P. putida S1的海藻糖合成酶与Pseudomonas属细菌的海藻糖合成酶的基因序列和蛋白质序列同源性均在70%以上。但与其它已报道的一些海藻糖合成酶,如来自于Pimelobacter sp. R48和Thermus aquaticus的海藻糖合成酶同源性均低于30%。将菌株P. putida S1的treS基因与表达载体pQE30T连接并转化宿主菌E.coli M15,得到了过量表达P. putida S1 treS基因的重组菌E.coli M15/pQE30T-TS。该菌株经IPTG诱导表达后,其细胞裂解上清液中海藻糖合成酶活性高达18.1u/ml,比酶活为5.36u/mg蛋白,分别比原始菌株P. putida S1提高了50倍和120倍。该基因工程重组菌株显示出良好的应用前景。采用两次Ni-NTA亲和柱层析对重组海藻糖合成酶进行了纯化。对纯化的重组海藻糖合成酶的酶学性质研究结果显示,该酶最适作用温度25℃,酶在35℃以下稳定。最适作用pH为8.5,在pH7.5~9.0范围内稳定。1mmol/L的Hg2+,Cu2+, Fe3+,Zn2+对该酶活性有不同程度的抑制作用,Tris盐对重组海藻糖合成酶活性具有较强的抑制作用。重组海藻糖合成酶以麦芽糖为底物时,Km =10.2mmol/L,Vmax =27.0μmol/mg protein/min;而以海藻糖为底物时Km =87.5mmol/L,Vmax =26.0μmol/mg protein/min。表明该酶对麦芽糖的亲和性比对海藻糖的亲和性高。P. putida S1海藻糖合成酶在基因序列、蛋白质序列和酶学性质等方面与已报道的海藻糖合成酶均表现出一定的差异,表明该酶是一新酶。其基因序列已提交Genbank数据库,Accession Number:EU310374。
段作营, 徐骥, 毛忠贵, 陈波, 俞勇[3]2004年在《一株产海藻糖合成酶极地细菌的鉴定》文中研究指明从来源于极地的微生物中筛选得到一株产海藻糖合成酶的耐冷细菌S1,通过形态特征、培养特征、生理生化特征及 16SrRNA基因序列分析 ,初步鉴定该菌为恶臭假单胞菌 (Pseudo monasputida)。
俞勇, 李会荣, 陈波, 曾胤新[4]2005年在《一株产海藻糖合成酶南极海洋低温细菌的鉴定》文中进行了进一步梳理从南极普里兹湾海域海水中分离到一株产海藻糖合成酶的海洋低温细菌BSw10041,革兰氏阴性,杆状,有极生鞭毛,能运动,菌落半透明。进行了常规生理生化和BIOLOG GN2细菌鉴定系统测试,结果表明菌株BSw10041与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的表型特征非常相似。为了进一步确定菌株BSw10041的分类学地位,测定了其16S rDNA序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发育树,结果表明BSw10041与P．putida的亲缘关系最近。综合上述结果,菌株BSw10041可鉴定为Pseudomonas putida,定名为Pseudomonas putida BSw10041。
段作营, 姚林, 毛忠贵[5]2008年在《Pseudomonas putida S1海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的克隆表达》文中提出利用PCR和TA克隆方法扩增和克隆得到了恶臭假单胞菌Pseudomonas putidaS1的海藻糖合成酶基因treS。对其进行序列分析表明,其编码区含有2067bp,编码含688个氨基酸残基的蛋白质,其核苷酸序列和蛋白质序列与来源于其它假单胞菌属细菌的海藻糖合成酶的序列表现出了较高同源性。将该基因序列与表达载体pQE30T连接,构建重组质粒pQE30T-TS,并将其转化至E.coliM15菌株中。重组菌株经诱导表达后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示有明显的分子量约77.5kD的特异蛋白条带出现。经测定酶活力达19U/mL,约是原始菌株P.putidaS1的50倍。
张丹丹[6]2017年在《南极菲尔德斯半岛土壤氮循环细菌的多样性及其特性研究》文中研究表明本研究对从南极菲尔德斯半岛动物聚集区、植物覆盖区和无动植物山坡区采集的14份土壤样品进行了一般可培养细菌、氮循环细菌的分离纯化、形态观察、计数和产酶状况测定;同时对这些分离菌株的氮循环功能活性、功能基因以及16S rDNA的系统发育多样性状况,结合采集土壤的理化性质进行了综合测定与分析。研究结果表明:(1)一般可培养细菌菌落计数结果显示:14份土壤样品中可培养细菌数量的顺序为:动物聚集区土壤(1.9~3.7×10~6CFU/g)>植物覆盖区土壤(7.0×10~5~1.7×10~6CFU/g)>无动植物山坡土壤(8.3×10~4~6.2×10~5CFU/g)。反映出土壤中动植物的存在与其中的细菌数量有一定关系,且不同类型的动植物对菌数影响也有所差异。MPN法氮循环细菌计数结果显示:14份土壤样品中氨化菌菌数(3.8×10~4~3.1×108MPN/g_(鲜土))>反硝化菌菌数(0~3.1×108MPN/g_(鲜土))>硝化菌菌数(0~3.5×10~5MPN/g_(鲜土))>固氮菌菌数(6.8×102~2.5×10~5CFU/g)。其中,动物聚集区土壤氨化菌菌数为1.1~6.9×107MPN/g_(鲜土),植物覆盖区土壤为6.7×10~6~1.7×108MPN/g_(鲜土),无动植物山坡土壤为3.8×10~4~3.1×108MPN/g_(鲜土);动物聚集区土壤反硝化菌菌数为0~6.4×10~4MPN/g_(鲜土),植物覆盖区土壤反硝化菌菌数为2.2×10~3~2.7×10~6 MPN/g_(鲜土),无动植物山坡土壤反硝化菌菌数为9.8×10~3~3.1×108MPN/g_(鲜土);动物聚集区土壤硝化菌菌数为1.9×102~2.4×10~3MPN/g_(鲜土),植物覆盖区土壤硝化菌菌数为1.2×102~3.4×10~4 MPN/g_(鲜土),无动植物的山坡土壤硝化菌菌数为0~3.5×10~5MPN/g_(鲜土);动物聚集区土壤中固氮菌的菌落数(6.8×102~2.5×10~5CFU/g)>无动植物山坡土壤(8.5×102~1.3×10~5CFU/g)和植物覆盖区(7.5×102~5.6×10~3CFU/g)。土壤理化性质测定结果显示:从土壤NH4+-N含量来看,动物聚集区和植物覆盖区的部分土壤样品(E1,E4,A1,A2)的NH4+-N含量较高,同时这些土壤的固氮菌和氨化菌含量也相对较高,表明氨化作用或固氮作用较强。从NO3--N含量来看,部分无动植物区样品(B1、B2、C1)的含量较低,而该区域的反硝化菌数量却相对较多。无动植物区土壤中的硝化菌数量有多有少,其含量与NO3--N含量并不很相符,这可能与该区NH4+-N含量较少有关。(2)形态观察结果表明:分离得到的157株一般可培养细菌、115株氨化菌具有比较高的颜色、菌落形态等多样性,而分离得到的101株固氮菌、67株硝化菌、137株反硝化菌菌落形态却比较单一。(3)一般可培养细菌产酶结果表明:157株分离菌中,有97.5%的菌株产黄原胶酶,81.5%菌株产过氧化氢酶,51.6%菌株产七叶苷酶,36.9%菌株产纤维素酶,22.3%菌株产脂肪酶和酪蛋白酶,8.9%菌株产氧化酶,4.5%菌株产淀粉酶。另外,所有菌株均不产几丁质酶、卡拉胶酶和明胶酶。这些特性菌为今后进一步的应用研究提供了菌株来源。(4)16S rDNA系统发育结果表明:经形态、序列初测等排重后的68株一般可培养细菌代表共分布在5纲(Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Bacilli、Actinobacteria、Flavobacteria)的13个属当中,表明有较大的系统发育多样性;其中Bacilli纲的Staphylococcus属和Gammaproteobacteria纲的Pseudomonas属为优势菌群,分别占68株可培养代表菌的14.7%、16.2%。经排重后的49株固氮细菌代表分别分布在4纲(Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Bacilli)的5属之中,31株硝化细菌代表分布在5纲(Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Bacilli、Actinobacteria)的8属之中,43株反硝化细菌代表分布于Gammaproteobacteria纲的3属之中,40株氨化细菌代表分布于5纲(Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Sphingobacteriia、Actinobacteria、Bacilli)的8属之中,表明菲尔德斯半岛土壤中氮循环细菌具有不同程度的多样性。其中氨化菌和硝化菌的多样性最高,反硝化菌最低;另外,固氮菌、硝化菌、反硝化菌、氨化菌的优势菌群均为Gammaproteobacteria纲的Pseudomonas属。(5)氮循环各菌群功能活性的检测结果表明:67株硝化菌中71.6%有硝化活性(强硝化活性菌有4株),137株反硝化菌中42.3%有反硝化活性(强反硝化活性菌有1株),而115株氨化菌均具有氨化活性,其中强氨化活性菌株占15.7%。(6)氮循环功能基因的PCR检测结果表明:49株固氮分离菌中有37株可扩增出nif H目的条带(采用34F-491R、100F-100R两对引物PCR),除其中一株菌分布在Betaproteobacteria纲Janthinobacterium属外,其余的36株菌均分布在Gammaproteobacteria纲的Pseudomonas属。含nif H基因的菌株在动物聚集区、植物覆盖区、无动植物山坡区的9个样品中均有分布,而动物聚集区的E2样品、植物覆盖区的J4样品、无动植物山坡区的B1、B2、H3样品分离菌中没有nif H基因。31株硝化菌中仅有3株扩增出amo A基因目的条带(用amo A-F~amo A-R引物PCR),其中2株菌分布在Gammaproteobacteria纲的Pseudomonas属中,1株菌分布在Bacilli纲Bacillus属中;这3株菌分布在植物覆盖区的A2和无动植物山坡区的G1样品中。43株反硝化菌中有10株菌可扩增出nar G基因目的条带(用nar G-F~nar G-R引物PCR),它们存在于无动植物山坡区的A1、A2、B1、B2和动物聚集区的D1、E1样品中,且均分布在Gammaproteobacteria纲的Pseudomonas属中。(7)另外研究发现,有7株一般可培养菌、6株固氮菌、1株硝化菌、6株氨化菌与关系最近标准菌株的16S rDNA相似性在97%~98.65%。按照现有国际细菌分类标准,它们具备成为新种的潜在可能,值得采用多相分类手段对其进行详细的分类单元定位。从近几年的文献检索来看,对南极一般微生物的研究较多,而对硝化、反硝化、固氮、氨化等氮循环微生物的研究极少且不系统。本文对南极菲尔德斯半岛一般可培养细菌和氮循环细菌的多样性进行了较为系统的初步研究,不仅对前人的研究做了一定补充,而且为今后更为全面深入的研究提供了基础。
赵永坤, 于化泓, 杨萌[7]2007年在《微生物生物活性物质开发应用进展》文中认为微生物能够通过次级代谢产生很多有益的活性物质。微生物资源非常丰富,存在着很大的开发潜力。现就近年来微生物开发应用领域作一综述。
参考文献：
[1]. 产海藻糖合成酶极地细菌的研究[D]. 徐骥. 江南大学. 2004
[2]. 极地细菌Pseudomonas putida S1海藻糖合成酶的研究[D]. 段作营. 江南大学. 2008
[3]. 一株产海藻糖合成酶极地细菌的鉴定[J]. 段作营, 徐骥, 毛忠贵, 陈波, 俞勇. 工业微生物. 2004
[4]. 一株产海藻糖合成酶南极海洋低温细菌的鉴定[J]. 俞勇, 李会荣, 陈波, 曾胤新. 极地研究. 2005
[5]. Pseudomonas putida S1海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的克隆表达[J]. 段作营, 姚林, 毛忠贵. 工业微生物. 2008
[6]. 南极菲尔德斯半岛土壤氮循环细菌的多样性及其特性研究[D]. 张丹丹. 青岛科技大学. 2017
[7]. 微生物生物活性物质开发应用进展[J]. 赵永坤, 于化泓, 杨萌. 江西食品工业. 2007
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