导读:本文包含了鉴定培养体系论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:干细胞,鉴定,免疫,睾丸,体系,体外,单倍体。
鉴定培养体系论文文献综述
田稼,马珂,裴承斌,颜贝,马良宏[1]（2019）在《小鼠精原干细胞体外培养体系建立与功能鉴定》一文中研究指出目的构建小鼠精原干细胞(SSCs)体外培养体系,并对培养的SSCs进行功能鉴定。方法采用两步酶法消化小鼠睾丸组织制备单细胞悬液,CD90、CD49f免疫磁珠分选SSCs,采用Sertoli细胞共培养方法体外培养SSCs,并将培养的SSCs移植到受体小鼠曲细精管,定期观察移植后SSCs在受体小鼠曲细精管增殖分化情况。结果本次研究培养的SSCs在体外大量增殖,SSCs标记物检测显示,CD90、CD49f未分化SSCs标记物表达阳性率均>99%,而CD117分化SSCs标记物表达阳性率<1%,SSCs转染GFP慢病毒后移植到受体小鼠曲细精管内可以广泛定植并增殖分化,移植后12w在受体小鼠曲细精管内可见GFP~+精子细胞。结论本研究中建立的小鼠SSCs体外培养体系,不仅能够促进SSCs大量增殖,同时保持了其未分化SSCs干细胞特性。(本文来源于《中国性科学》期刊2019年11期）
袁波[2]（2019）在《胆囊良恶性肿瘤类器官培养体系的建立及鉴定》一文中研究指出第一部分胆囊良恶性肿瘤类器官培养体系的建立及鉴定研究背景及目的:胆囊癌(gallbladder cancer,GBC)是最常见的胆道恶性肿瘤,约占胆道癌的80%~90%。在消化系统常见恶性肿瘤中,胆囊癌占第六位。胆囊癌的发病率在不同地区存在差异,亚洲发病率较高,所以胆囊癌的防治在我国具有十分现实的意义。由于症状和体征均呈现非特异性,胆囊癌常在胆囊切除术后才明确诊断或长期误诊为良性胆囊疾病而未获得及时诊治,多数情况下发现时已处于中晚期。此外,由于靠近胆囊床的肝脏侧无浆膜包绕,胆囊癌易出现肝脏浸润及转移,且极易沿肝十二指肠韧带淋巴结转移,胆囊癌患者预后极差。据统计,胆囊癌患者的平均总生存期为6个月,而5年生存率仅为5%[1]。手术是目前可能治愈原发性胆囊癌的唯一手段[2]。但由于往往发现过晚,已出现转移,手术切除率低,而其他综合性治疗如化疗等,效果不肯定[3]。肿瘤分子靶向治疗代表着更有效、更有针对性的药物治疗的方向。现在多种分子靶向药物已广泛用于肿瘤治疗,并在部分肿瘤患者体内取得了显着的疗效。但由于可供使用的细胞模型和动物模型非常缺乏,针对胆囊癌的药物研发和筛选研究进展缓慢。因此寻找新的胆囊癌实验模型,已成为比较迫切的现实需求。类器官(Organoid)是一种叁维细胞培养体系,其与原代来源的器官相似度极高,是疾病机理研究和药物筛选的理想平台,也是极重要的前沿研究领域。肿瘤类器官是利用肿瘤患者细胞直接在体外构建成的叁维肿瘤。近几年,肿瘤类器官迅猛发展,为肿瘤治疗带来了新的曙光。目前已经成功从原发结肠癌、前列腺癌、胰腺癌获得类器官。将这些肿瘤类器官模型与个人化肿瘤基因组信息相关联将极大的加速肿瘤恶性演化、肿瘤研究药物敏感性等研究的进程[4]。目前,针对消化道肿瘤的类器官研究虽有少量报道,但仍存在肿瘤类器官例数少、稳定性差和不具有中国人群遗传特征等方面的问题。迄今为止,尚未有胆囊良恶性肿瘤类器官培养的相关报道。我们尝试利用胆囊良恶性肿瘤患者手术切除新鲜标本,构建胆囊良恶性肿瘤类器官的培养体系,并针对类器官进行形态、肿瘤标志物及基因组方面的鉴定,以期为进一步深入研究胆囊良恶性肿瘤的分子生物学机制,特别是由瘤至癌的演变,以及临床精准治疗,提供一个新的平台。研究方法:1、于2017年12月至2018年12月共纳入东方肝胆外科医院收治的胆囊腺瘤及胆囊癌患者共46例,收集患者手术切除的新鲜肿瘤组织,分成叁部分以完成类器官培养、冰冻组织供转录组测序以及病理石蜡切片作形态学鉴定。收集患者外周血以提取白细胞,供全基因组测序。2、肿瘤类器官培养主要步骤:新鲜标本充分洗涤、剪碎后,加入特定消化液,于37℃孵育消化30分钟至3小时,每2000-5000个细胞用DMEM/F12培养基25μl重悬,加入液态Matrigel,混匀后于37℃聚合,加入合适培养基,放入37℃无菌培养箱培养。传代:按1:2或1:3进行。冻存:先用细胞修复液融解Matrigel,再加入无血清细胞冻存液。复苏:从低温中取出冻存细胞快速溶解,再用Matrigel重新包被聚合,加入合适培养基培养。3、培养成功后,进行鉴定。(1)形态学鉴定:将类器官细胞予包埋、石蜡切片。显微镜下观察形态并与普通病理组织对比。(2)免疫荧光染色检测肿瘤标志物:类器官细胞免疫荧光染色后,激光共聚焦显微镜拍照。主要标志物有胆系标志物CK7;干性标志物CD133;胆囊癌常见肿瘤标志物Erb B2,C-myc等。(3)类器官行转录组及全基因组测序。研究结果:1、总共收集46例手术标本,其中5例胆囊腺瘤,41例胆囊恶性肿瘤,包括38例胆囊腺癌,而胆囊鳞癌、胆囊淋巴瘤及胆囊腺癌-神经内分泌混合癌各1例。培养成功标准为细胞数量>1*106或可传代6代以上[5]。2、组织消化所需要消化液及消化时间的选择:消化液的组成为Collagenase II(1mg/ml)+Dispase II(0.3mg/ml)+DNAse I(100ug/ml)。消化时间:胆囊腺瘤消化时间控制在0.5小时-1小时。胆囊腺癌分两种情况,如为腺瘤癌变所致,消化时间可1小时-2小时,而其他类型腺癌则含多量纤维组织,消化时间可适当延长,但不宜超过7小时,否则容易组织坏死。3、在正式选取胆囊腺瘤及胆囊癌行类器官培养之前,我们尝试用正常胆囊上皮进行类器官培养,以优化培养体系和培养流程。确定了包括DMEM/F12培养基、Glutamax、Hepes缓冲液、N-acetylcysteine、nicotinamide、B27、N2、叁抗及Primocin为基本构成的培养基组分;良性肿瘤(腺瘤)类器官培养时,添加:Wnt3a、EGF、FGF10、Noggin、R-spondin-1、Gastrin、A8301、Foskolin、Dexamethasone等。恶性肿瘤(腺癌)类器官培养为全培养基去除Wnt3a、R-spondin-1等。4、胆囊腺瘤培养成功率60%(3/5)。2例送检后续类器官转录组及全基因组测序。培养基组分与正常胆囊上皮类器官相同。第1次传代为培养第7-10天,此后每10-15天传代1次,按1:2或1:3传代。镜下见胆囊腺瘤类器官为大小不一的3D椭圆形或类圆形结构,形态较为规则。5、胆囊恶性肿瘤培养成功率14.6%(6/41),另3例其他类型恶性肿瘤未能培养成功。3例腺癌类器官送检后续类器官转录组及全基因组测序。第1次传代为培养第7-23天,平均第15天,此后每10-20天传代1次,按1:2或1:3传代。镜下大体所见胆囊腺癌类器官为大小及形态均极度不规则细胞团,呈3D结构生长。6、肿瘤类器官培养过程中,为避免出现混入的正常上皮组织形成的生长优势现象,我们的处理:一是在取材中严格把握,尽量选取肿瘤组织而不附带正常胆囊上皮;二是在剪切前尽量去除可疑的正常上皮组织;叁是在培养过程中,如果有孤立的、巨大球形上皮类器官细胞团,可在显微镜下行上皮类器官穿刺抽吸以去除。7、Matrigel重聚合时机:一为类器官数量超过100-150/孔,应及时传代,同时即相应完成重聚合;二是Matrigel出现崩解;叁是显微镜下观察Matrigel出现消耗过度的情况。8、胆囊癌肿瘤类器官的形态学鉴定:类器官石蜡切片与原代组织石蜡切片比较,大体镜下形态相似,正常胆囊上皮、胆囊腺瘤及胆囊腺癌均与来源组织形态保持一致。9、类器官肿瘤标志物测定:类器官行免疫荧光染色提示相关标志物CK7,CD133、Erb B2及C-myc均有表达,提示类器官来自于胆系干细胞,且与胆囊癌常见肿瘤标志物表达一致。10、类器官转录组及全基因组测序结果显示,类器官与原代肿瘤组织之间基因表达谱、胚系突变及体细胞突变的相似度均比较好。研究结论:根据上述实验结果,我们初步构建了胆囊腺瘤及胆囊腺癌病人来源的类器官培养体系,明确了胆囊良恶性肿瘤类器官培养从新鲜标本收集、消化、Matrigel聚合以至传代、保存、复苏等整套流程,确立了针对良性及恶性肿瘤不同的培养基组分。在胆囊腺瘤中,类器官培养成功率达60%,胆囊恶性肿瘤类器官培养成功率达到14.6%。同时,针对培养出的类器官,分别进行形态、肿瘤标志物及基因组等方面的鉴定。胆囊癌类器官形态与原代肿瘤相似,且保留3D结构而非平面结构,表达胆系及干性、胆囊恶性肿瘤标志物,同时测序结果提示肿瘤类器官与原代肿瘤组织相似度较好。综上所述,我们成功构建胆囊良恶性肿瘤类器官模型,为后续胆囊癌的分子机制研究及药物筛选,提供了很好的平台。第二部分睫状神经营养因子受体通过MAPK/ERK通路抑制胆囊癌转移研究背景及目的:胆囊癌(GBC)是世界范围内最具侵袭性的恶性肿瘤之一,极易出现肝或邻近器官局部浸润、淋巴转移或腹腔转移,导致发现时已处于中晚期而失去手术机会。对于胆囊癌这种具有侵袭性生物学行为和预后不良的肿瘤,发现其转移的机制并确定潜在的治疗靶点以改善临床预后至关重要。肿瘤细胞侵袭和转移的过程及机制较为复杂,主要的影响因素包括:促进细胞黏附、降解细胞外基质等。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)是一类可以降解细胞外基质的蛋白酶,在肿瘤转移过程中十分重要。睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)是白介素-6家族成员,其受体为睫状神经营养因子受体(Ciliary neurotrophic factor receptor,CNTFR),包括CNTFR-α、LIFR-β和gp130叁种亚基,其中CNTFR-α是其核心亚基。长期以来,关于CNTF及CNTFR的研究,多集中于神经系统及运动系统损伤后修复方面。近年来,这两者在恶性肿瘤中的作用逐渐得到重视。但CNTFR及CNTF在胆囊癌中的表达情况,以及两者是否在胆囊癌的发生、发展过程中起作用,尚未有报道。我们在胆囊癌类器官培养过程中,转录组测序结果发现睫状神经营养因子受体CNTFR在胆囊癌及正常胆囊上皮中表达有显着差异,而CNTF表达无差异(未发表数据)。我们设想CNTFR在胆囊癌中可能发挥了一定作用。由此,在本研究中,我们进一步检测了胆囊癌及癌旁组织中CNTFR和CNTF的表达,并分析了其表达与胆囊癌患者临床特征和预后的关系。随后通过肿瘤细胞生物学及动物体内实验进一步对CNTFR在胆囊癌中的作用及分子机制进行研究。我们期望通过对CNTFR调控胆囊癌的分子通路的研究,为胆囊癌的临床干预,特别是抑制其侵袭转移,提供新的靶点。研究方法:1.收集胆囊癌及癌旁新鲜组织标本,检测癌及癌旁CNTF和CNTFR的m RNA、蛋白表达水平。2.收集152例有随访资料的胆囊癌患者肿瘤组织病理切片,通过免疫组化染色检测胆囊癌及癌旁组织中CNTFR及CNTF的表达情况。统计分析CNTFR及CNTF表达与患者临床特征和预后的关系,借以判断CNTFR及CNTF在胆囊癌的恶性进展中是否发挥作用。3.用慢病毒转染方法在NOZ及SGC-996两株胆囊癌细胞株中建立CNTFR过表达细胞系,体外检测CNTFR过表达后对胆囊癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响,并在脾注射肝转移模型中检测CNTFR对胆囊癌细胞转移能力的影响。4.将过表达CNTFR的两株细胞系作转录组测序,并分析CNTFR调控的关键信号通路或节点分子。5.通过Western Blotting等方法对相关激酶和蛋白进行检测,进一步验证CNTFR对胆囊癌细胞中信号通路的调控。6.使用抑制剂特异阻断关键信号通路,检测CNTFR对胆囊癌细胞的调控是否依赖于特定的信号通路。研究结果:1.在20例胆囊癌及癌旁新鲜组织标本中,CNTFR m RNA表达水平明显低于癌旁组织(P<0.01)。而CNTF m RNA表达水平与癌旁相比,没有显着性差异(P=0.108)。蛋白检测结果一致。2.152例胆囊癌石蜡病理切片的免疫组化结果表明CNTFR在胆囊癌组织中表达明显降低,而癌旁组织中有较高水平表达。CNTF在胆囊癌与癌旁组织中的表达没有明显差异。3.在152例胆囊癌患者的病理切片中,CNTFR的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度及TNM分期无关,而与淋巴结转移和远处转移密切相关。单因素生存分析提示CNTFR的表达与胆囊癌总生存率相关。多因素生存分析提示CNTFR表达与远处转移是胆囊癌预后的独立危险因素。4.CNTFR对胆囊癌细胞增殖无明显影响,但对癌细胞的迁移及侵袭能力有显着抑制作用。体内实验亦得出相同结论。5.测序结果发现丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路在两株细胞系的差异性通路排名中均靠前。WB结果显示P38、AKT及STAT3的磷酸化水平及总蛋白表达在对照及过表达CNTFR细胞中均无明显变化,而ERK蛋白磷酸化在过表达CNTFR细胞中明显受抑制。同时,MAPK调控的迁移转移相关蛋白MMP1及MMP10在过表达CNTFR细胞中亦明显下调。6.用ERK抑制剂SCH772984处理细胞后,对照细胞和过表达CNTFR细胞内ERK的磷酸化水平均下调,同时两种细胞的迁移侵袭能力亦被抑制,对照组细胞和过表达组细胞间无明显差异。这表明在胆囊癌细胞中CNTFR通过影响MAPK/ERK通路抑制细胞的侵袭转移能力。研究结论:1.胆囊癌中存在CNTFR及CNTF的表达。胆囊癌中CNTFR的表达明显比癌旁组织低。CNTF在癌及癌旁组织中表达无明显差异。2.CNTFR表达与胆囊癌患者的淋巴转移和远处转移密切相关,且CNTFR的高表达预示着胆囊癌患者的较好预后。CNTFR是潜在的胆囊癌预后判断分子。3.CNTFR对胆囊癌细胞的侵袭转移具有抑制作用,这一作用是通过抑制MAPK/ERK通路的磷酸化,进而抑制下游MMP1及MMP10这两种基质金属蛋白酶的表达来实现的。(本文来源于《中国人民解放军海军军医大学》期刊2019-05-23）
司丽慧,刘剑,许志光,许天敏[3]（2018）在《特异性细胞毒性T淋巴细胞体外培养体系的建立与鉴定及对卵巢癌细胞的影响》一文中研究指出目的探讨特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体外培养体系的建立与鉴定及对卵巢癌细胞的影响,为开发一种高效、安全的抑制杀伤卵巢癌细胞的免疫疗法提供依据。方法提取人外周血单个核细胞(PBMC),加入Cp G模体的寡脱氧核苷酸序列(Cp GODN),人参皂苷Rg1药物浓度分别为3.75μg/ml、7.5μg/ml、15μg/ml、30μg/ml、60μg/ml与不加药物的对照组比较,采用单一变量控制法,验证Cp GODN,人参皂苷Rg1和人类表皮生长因子受体α(HER2/neu)抗原肽的最佳比例。用流式细胞仪检测Cp GODN,人参皂苷Rg1和HER2/neu混合物刺激的PBMC表面标记物CD3、CD4和CD8,并检测细胞核型。用人参皂苷Rg1和HER2/neu混合物刺激的PBMC形成的CTL作用到SKOV-3细胞中,培养一段时间观察CTL的抑制作用。结果随着Cp GODN/人参皂苷Rg1药物浓度的增加,CTL作用显着增强,差异有统计学意义(P<0.05),当药物浓度达到30μg/ml时,抑制效果进入平台,药物浓度再增加,抑制效果不变。因此,以Cp GODN和人参皂苷Rg1有效浓度30μg/ml与HER2/neu抗原肽片段10μg/ml混合,加入到提取的PBMC中,培养34 d,建立CSR-CTL体系。流式细胞仪检测,随着培养时间增加CD3、CD4和CD8阳性细胞数量显着增多,差异有统计学意义(P<0.05)。CSR-CTL对卵巢癌细胞SKOV-3生长有显着的抑制作用,观察组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用Cp GODN,人参皂苷Rg1和HER2/neu抗原肽混合物刺激PBMC可建立安全、特异性高的细胞毒性T淋巴细胞体外培养体系CSR-CTL,并且CTL可抑制人卵巢癌SKOV-3的生长。(本文来源于《中国妇幼保健》期刊2018年11期）
徐舶,高霞,石凤翎,崔楠,乌日娜[4]（2018）在《黄花苜蓿花药培养再生体系的建立与单倍体鉴定》一文中研究指出花药组织培养再生体系的构建是单倍体育种的重要途径之一。本研究对呼伦贝尔黄花苜蓿(Medicago falcate‘Hulunbeier’)进行了花药组织培养研究并建立了花药组培再生体系。结果显示,液体悬浮培养基比固体培养基更适合呼伦贝尔黄花苜蓿花药愈伤组织的培养,其愈伤形成的培养条件为B5培养基+0.5 mg·L~(-1) 2,4-D+0.25 mg·L~(-1) 6-BA+0.4mg·L~(-1) NAA+3.0mg·L~(-1) KT;分化培养基为MS+1.0mg·L~(-1) 2,4-D+0.5mg·L~(-1) 6-BA+2%蔗糖+0.7%琼脂;生根培养基为1/2MS+0.1mg·L~(-1) NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂;获得的再生植株经流式细胞仪鉴定,其单倍体比例高达27%。(本文来源于《草业科学》期刊2018年05期）
骆礼华,姚刘斌,江龙[5]（2017）在《双重培养体系中AM真菌孢子的种类鉴定》一文中研究指出利用AM真菌单孢与烟草Ri-TDNA转型根建立了离体双重培养体系,该体系产生了大量孢子,通过孢子形态特征和18S r DNA AML1-AML2区序列的系统发育分析进行种属鉴定,鉴定出该菌种为珠状巨孢囊霉Gigaspora margarita。(本文来源于《贵州大学学报(自然科学版)》期刊2017年05期）
王连昭[6]（2017）在《司法鉴定专业人才培养体系研究——以华东政法大学为例》一文中研究指出培养司法鉴定专业人才是保障我国司法鉴定行业科学、健康、可持续发展的基础。华东政法大学作为全国唯一一所拥有司法鉴定硕士、博士点以及博士后流动站的高等院校,在司法鉴定办学实践中,对司法鉴定专业人才的知识结构、职业素质进行研究,构建了司法鉴定专业人才培养的课程体系,创建了具有特色的"4+1"司法鉴定专业人才培养模式,对司法鉴定专业人才培养的具体措施进行了概括和总结。(本文来源于《净月学刊》期刊2017年05期）
曲丽媛,朱媛,李先哲,胡强,王超艳[7]（2017）在《脐血间充质干细胞的分离培养及鉴定技术体系的建立》一文中研究指出干细胞是一类具有自我更新能力且同时具有分化潜能的细胞,在特定的条件下,它可以分化成多种功能细胞或组织器官,目前已从不同种属的受精卵、胚胎或成体等分离出多种来源的干细胞~([1])。该研究拟建立从脐血中分离培养鉴定细胞株的技术体系,或可为基础研究中创伤修复提供种子材料。1材料与方法1.1实验材料脐带血来自笔者所在医院手术室,获知情同意,并报院医学伦理委员会备案。分离液购自Beyondtime,培养基购自GIBCO BRL,抗体购(本文来源于《实用医药杂志》期刊2017年08期）
邓辰红,王飞,王文兰[8]（2017）在《兔骨髓基质干细胞的培养与鉴定体系的建立》一文中研究指出目的探讨兔骨髓基质干细胞的培养与鉴定体系的建立方法与效果。方法空气栓塞的方式处死SPF级新西兰大白兔6只,分离骨髓组织,利用贴壁培养分离纯化兔骨髓基质干细胞,多次传代后以流式细胞术检测细胞表面抗原;以Brd U标记骨髓基质干细胞,将骨髓基质干细胞注入兔颅内,分别于注射1、3周后取脑组织制作石蜡切片,进行免疫荧光染色。结果通过贴壁法培养幼年兔骨髓细胞可获得较纯化的骨髓基质干细胞。免疫细胞化学染色显示骨髓基质干细胞中CD44~+细胞率超过90%,细胞核未着色;流式细胞仪测定培养骨髓基质干细胞的CD90~+细胞率为94.5%,CD34~+细胞率为0.24%。Brd U标记显示得到了能够掺DNA合成期的骨髓基质干细胞,标记细胞所占的比例在40.0%以上。结论通过贴壁法培养幼年兔骨髓细胞呈多角短梭形,可获得骨髓基质干细胞,Brd U可作为体内示踪骨髓基质干细胞的标志物之一。(本文来源于《中国医药导报》期刊2017年20期）
于帅[9]（2017）在《猪睾丸间质干细胞的分离、鉴定及其短期培养体系的建立》一文中研究指出睾丸间质干细胞(stem Leydig cells,SLCs)是雄性动物睾丸中的一类成体干细胞,可定向分化为成熟睾丸间质细胞(adult Leydig cells,ALCs),调控精子发生。猪作为重要的经济动物和理想的哺乳动物模型,可代替小鼠等模式动物在辅助生殖领域发挥重要作用,然而此前并无猪SLCs的相关研究报道。因此,本研究以不同时期猪睾丸为研究对象,利用H&E染色、免疫组织化学和qRT-PCR等生物技术手段,旨在鉴定并分离猪SLCs,并探究其体外培养体系,为后续进一步研究其增殖分化调控的机制提供基础。本研究获得如下重要研究结果:1.猪SLCs的组织学鉴定PDGFRα+细胞主要分布在猪睾丸曲细精管管周和间质部分,部分为纺锤形,证明SLCs在猪睾丸中是存在的。PDGFRα+细胞在7 d睾丸间质中所占比例显着高于2 m睾丸间质中。同时,Nestin在7 d猪睾丸的mRNA表达量高于2 m猪的表达量,而CYP17A1在2 m猪睾丸的表达量最高,表明:相比于2 m与成年猪睾丸,7 d猪是分离SLCs最适宜的采样时间点。2.猪原代SLCs的分离与鉴定本研究采用胶原酶消化法分离得到7 d猪睾丸间质中的原代细胞。发现该原代细胞表达SLCs和干细胞的分子标记(Nestin、PDGFRα、Oct4和LIFR),但不表达精原干细胞的分子标记(PLZF)和支持细胞的分子标记(SOX9),提示本研究采用的分离方法可有效除去曲细精管内细胞。随后,LIFR和PDGFRα在原代细胞中的表达量显著高于在7 d猪睾丸组织的表达量,表明本研究可分离和富集猪SLCs。1.00 mg/mL EDS处理发现该原代细胞含约23.3%的已分化LCs。3.猪原代SLCs的体外短期培养本研究将猪睾丸组织液(porcine testicular fluid,pTF)添加在培养基中,以期实现对猪SLCs的体外培养。结果发现,在添加pTF的情况下,原代SLCs培养1周后,有细胞克隆形成,且形成克隆的细胞表达PDGFRα。而在不添加pTF的情况下,无细胞克隆形成,且这些细胞表达CY17A1,提示SLCs在普通培养条件下已自发分化成LCs。以上结果说明,添加pTF有助于SLCs的干细胞特性的维持,并可在体外进行短期培养。综上,本研究成功鉴定并分离出了猪SLCs,且pTF对猪SLCs干细胞特性的维持有支持作用,并以此为基础,建立了猪SLCs的体外短期培养体系。这些研究结果为进一步研究猪SLCs的增殖分化调控机制奠定了基础,为人SLCs的分离与培养研究积累了科学资料。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2017-05-01）
郝雨蒙,赵锋,张娜,陈丹,李庆章[10]（2016）在《奶牛乳腺上皮细胞培养体系中疑似干/祖细胞的鉴定》一文中研究指出为了揭示奶牛乳腺干细胞在体外泌乳调控中的潜在作用,本研究根据成体干细胞具有BrdU标记滞留的特点检测了奶牛乳腺上皮细胞(DCMECs)中疑似乳腺干/祖细胞,同时分析了两种新发现的乳腺干细胞分子标志(FNDC3B和PROCR)的表达定位,验证了它们指示DCMECs的可行性。通过实时荧光定量PCR方法检测分析DCMECs体外培养过程中催乳素、生长激素、胰岛素样生长因子Ⅰ及其受体的基因表达变化。结果显示,连续培养25d后BrdU标记滞留细胞比例接近0.4%,极少数细胞呈FNDC3B或PROCR阳性,可以观察到不对称分裂细胞,原代和传代后DCMECs在激素、胰岛素样生长因子及其受体mRNA水平上差异极显着(P<0.01)。总之,在非诱导泌乳分化培养条件下,脱离泌乳生理环境的DCMECs自身具有的泌乳调控基因表达迅速受到抑制,但在一定培养时间内,DCMECs群体中能够保留一定比例疑似乳腺干/祖细胞,提示这些多能奶牛乳腺干/祖细胞在体外泌乳调控和乳腺腺泡重塑过程中可能发挥重要作用。(本文来源于《中国畜牧兽医》期刊2016年08期）
鉴定培养体系论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
第一部分胆囊良恶性肿瘤类器官培养体系的建立及鉴定研究背景及目的:胆囊癌(gallbladder cancer,GBC)是最常见的胆道恶性肿瘤,约占胆道癌的80%~90%。在消化系统常见恶性肿瘤中,胆囊癌占第六位。胆囊癌的发病率在不同地区存在差异,亚洲发病率较高,所以胆囊癌的防治在我国具有十分现实的意义。由于症状和体征均呈现非特异性,胆囊癌常在胆囊切除术后才明确诊断或长期误诊为良性胆囊疾病而未获得及时诊治,多数情况下发现时已处于中晚期。此外,由于靠近胆囊床的肝脏侧无浆膜包绕,胆囊癌易出现肝脏浸润及转移,且极易沿肝十二指肠韧带淋巴结转移,胆囊癌患者预后极差。据统计,胆囊癌患者的平均总生存期为6个月,而5年生存率仅为5%[1]。手术是目前可能治愈原发性胆囊癌的唯一手段[2]。但由于往往发现过晚,已出现转移,手术切除率低,而其他综合性治疗如化疗等,效果不肯定[3]。肿瘤分子靶向治疗代表着更有效、更有针对性的药物治疗的方向。现在多种分子靶向药物已广泛用于肿瘤治疗,并在部分肿瘤患者体内取得了显着的疗效。但由于可供使用的细胞模型和动物模型非常缺乏,针对胆囊癌的药物研发和筛选研究进展缓慢。因此寻找新的胆囊癌实验模型,已成为比较迫切的现实需求。类器官(Organoid)是一种叁维细胞培养体系,其与原代来源的器官相似度极高,是疾病机理研究和药物筛选的理想平台,也是极重要的前沿研究领域。肿瘤类器官是利用肿瘤患者细胞直接在体外构建成的叁维肿瘤。近几年,肿瘤类器官迅猛发展,为肿瘤治疗带来了新的曙光。目前已经成功从原发结肠癌、前列腺癌、胰腺癌获得类器官。将这些肿瘤类器官模型与个人化肿瘤基因组信息相关联将极大的加速肿瘤恶性演化、肿瘤研究药物敏感性等研究的进程[4]。目前,针对消化道肿瘤的类器官研究虽有少量报道,但仍存在肿瘤类器官例数少、稳定性差和不具有中国人群遗传特征等方面的问题。迄今为止,尚未有胆囊良恶性肿瘤类器官培养的相关报道。我们尝试利用胆囊良恶性肿瘤患者手术切除新鲜标本,构建胆囊良恶性肿瘤类器官的培养体系,并针对类器官进行形态、肿瘤标志物及基因组方面的鉴定,以期为进一步深入研究胆囊良恶性肿瘤的分子生物学机制,特别是由瘤至癌的演变,以及临床精准治疗,提供一个新的平台。研究方法:1、于2017年12月至2018年12月共纳入东方肝胆外科医院收治的胆囊腺瘤及胆囊癌患者共46例,收集患者手术切除的新鲜肿瘤组织,分成叁部分以完成类器官培养、冰冻组织供转录组测序以及病理石蜡切片作形态学鉴定。收集患者外周血以提取白细胞,供全基因组测序。2、肿瘤类器官培养主要步骤:新鲜标本充分洗涤、剪碎后,加入特定消化液,于37℃孵育消化30分钟至3小时,每2000-5000个细胞用DMEM/F12培养基25μl重悬,加入液态Matrigel,混匀后于37℃聚合,加入合适培养基,放入37℃无菌培养箱培养。传代:按1:2或1:3进行。冻存:先用细胞修复液融解Matrigel,再加入无血清细胞冻存液。复苏:从低温中取出冻存细胞快速溶解,再用Matrigel重新包被聚合,加入合适培养基培养。3、培养成功后,进行鉴定。(1)形态学鉴定:将类器官细胞予包埋、石蜡切片。显微镜下观察形态并与普通病理组织对比。(2)免疫荧光染色检测肿瘤标志物:类器官细胞免疫荧光染色后,激光共聚焦显微镜拍照。主要标志物有胆系标志物CK7;干性标志物CD133;胆囊癌常见肿瘤标志物Erb B2,C-myc等。(3)类器官行转录组及全基因组测序。研究结果:1、总共收集46例手术标本,其中5例胆囊腺瘤,41例胆囊恶性肿瘤,包括38例胆囊腺癌,而胆囊鳞癌、胆囊淋巴瘤及胆囊腺癌-神经内分泌混合癌各1例。培养成功标准为细胞数量>1*106或可传代6代以上[5]。2、组织消化所需要消化液及消化时间的选择:消化液的组成为Collagenase II(1mg/ml)+Dispase II(0.3mg/ml)+DNAse I(100ug/ml)。消化时间:胆囊腺瘤消化时间控制在0.5小时-1小时。胆囊腺癌分两种情况,如为腺瘤癌变所致,消化时间可1小时-2小时,而其他类型腺癌则含多量纤维组织,消化时间可适当延长,但不宜超过7小时,否则容易组织坏死。3、在正式选取胆囊腺瘤及胆囊癌行类器官培养之前,我们尝试用正常胆囊上皮进行类器官培养,以优化培养体系和培养流程。确定了包括DMEM/F12培养基、Glutamax、Hepes缓冲液、N-acetylcysteine、nicotinamide、B27、N2、叁抗及Primocin为基本构成的培养基组分;良性肿瘤(腺瘤)类器官培养时,添加:Wnt3a、EGF、FGF10、Noggin、R-spondin-1、Gastrin、A8301、Foskolin、Dexamethasone等。恶性肿瘤(腺癌)类器官培养为全培养基去除Wnt3a、R-spondin-1等。4、胆囊腺瘤培养成功率60%(3/5)。2例送检后续类器官转录组及全基因组测序。培养基组分与正常胆囊上皮类器官相同。第1次传代为培养第7-10天,此后每10-15天传代1次,按1:2或1:3传代。镜下见胆囊腺瘤类器官为大小不一的3D椭圆形或类圆形结构,形态较为规则。5、胆囊恶性肿瘤培养成功率14.6%(6/41),另3例其他类型恶性肿瘤未能培养成功。3例腺癌类器官送检后续类器官转录组及全基因组测序。第1次传代为培养第7-23天,平均第15天,此后每10-20天传代1次,按1:2或1:3传代。镜下大体所见胆囊腺癌类器官为大小及形态均极度不规则细胞团,呈3D结构生长。6、肿瘤类器官培养过程中,为避免出现混入的正常上皮组织形成的生长优势现象,我们的处理:一是在取材中严格把握,尽量选取肿瘤组织而不附带正常胆囊上皮;二是在剪切前尽量去除可疑的正常上皮组织;叁是在培养过程中,如果有孤立的、巨大球形上皮类器官细胞团,可在显微镜下行上皮类器官穿刺抽吸以去除。7、Matrigel重聚合时机:一为类器官数量超过100-150/孔,应及时传代,同时即相应完成重聚合;二是Matrigel出现崩解;叁是显微镜下观察Matrigel出现消耗过度的情况。8、胆囊癌肿瘤类器官的形态学鉴定:类器官石蜡切片与原代组织石蜡切片比较,大体镜下形态相似,正常胆囊上皮、胆囊腺瘤及胆囊腺癌均与来源组织形态保持一致。9、类器官肿瘤标志物测定:类器官行免疫荧光染色提示相关标志物CK7,CD133、Erb B2及C-myc均有表达,提示类器官来自于胆系干细胞,且与胆囊癌常见肿瘤标志物表达一致。10、类器官转录组及全基因组测序结果显示,类器官与原代肿瘤组织之间基因表达谱、胚系突变及体细胞突变的相似度均比较好。研究结论:根据上述实验结果,我们初步构建了胆囊腺瘤及胆囊腺癌病人来源的类器官培养体系,明确了胆囊良恶性肿瘤类器官培养从新鲜标本收集、消化、Matrigel聚合以至传代、保存、复苏等整套流程,确立了针对良性及恶性肿瘤不同的培养基组分。在胆囊腺瘤中,类器官培养成功率达60%,胆囊恶性肿瘤类器官培养成功率达到14.6%。同时,针对培养出的类器官,分别进行形态、肿瘤标志物及基因组等方面的鉴定。胆囊癌类器官形态与原代肿瘤相似,且保留3D结构而非平面结构,表达胆系及干性、胆囊恶性肿瘤标志物,同时测序结果提示肿瘤类器官与原代肿瘤组织相似度较好。综上所述,我们成功构建胆囊良恶性肿瘤类器官模型,为后续胆囊癌的分子机制研究及药物筛选,提供了很好的平台。第二部分睫状神经营养因子受体通过MAPK/ERK通路抑制胆囊癌转移研究背景及目的:胆囊癌(GBC)是世界范围内最具侵袭性的恶性肿瘤之一,极易出现肝或邻近器官局部浸润、淋巴转移或腹腔转移,导致发现时已处于中晚期而失去手术机会。对于胆囊癌这种具有侵袭性生物学行为和预后不良的肿瘤,发现其转移的机制并确定潜在的治疗靶点以改善临床预后至关重要。肿瘤细胞侵袭和转移的过程及机制较为复杂,主要的影响因素包括:促进细胞黏附、降解细胞外基质等。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)是一类可以降解细胞外基质的蛋白酶,在肿瘤转移过程中十分重要。睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)是白介素-6家族成员,其受体为睫状神经营养因子受体(Ciliary neurotrophic factor receptor,CNTFR),包括CNTFR-α、LIFR-β和gp130叁种亚基,其中CNTFR-α是其核心亚基。长期以来,关于CNTF及CNTFR的研究,多集中于神经系统及运动系统损伤后修复方面。近年来,这两者在恶性肿瘤中的作用逐渐得到重视。但CNTFR及CNTF在胆囊癌中的表达情况,以及两者是否在胆囊癌的发生、发展过程中起作用,尚未有报道。我们在胆囊癌类器官培养过程中,转录组测序结果发现睫状神经营养因子受体CNTFR在胆囊癌及正常胆囊上皮中表达有显着差异,而CNTF表达无差异(未发表数据)。我们设想CNTFR在胆囊癌中可能发挥了一定作用。由此,在本研究中,我们进一步检测了胆囊癌及癌旁组织中CNTFR和CNTF的表达,并分析了其表达与胆囊癌患者临床特征和预后的关系。随后通过肿瘤细胞生物学及动物体内实验进一步对CNTFR在胆囊癌中的作用及分子机制进行研究。我们期望通过对CNTFR调控胆囊癌的分子通路的研究,为胆囊癌的临床干预,特别是抑制其侵袭转移,提供新的靶点。研究方法:1.收集胆囊癌及癌旁新鲜组织标本,检测癌及癌旁CNTF和CNTFR的m RNA、蛋白表达水平。2.收集152例有随访资料的胆囊癌患者肿瘤组织病理切片,通过免疫组化染色检测胆囊癌及癌旁组织中CNTFR及CNTF的表达情况。统计分析CNTFR及CNTF表达与患者临床特征和预后的关系,借以判断CNTFR及CNTF在胆囊癌的恶性进展中是否发挥作用。3.用慢病毒转染方法在NOZ及SGC-996两株胆囊癌细胞株中建立CNTFR过表达细胞系,体外检测CNTFR过表达后对胆囊癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响,并在脾注射肝转移模型中检测CNTFR对胆囊癌细胞转移能力的影响。4.将过表达CNTFR的两株细胞系作转录组测序,并分析CNTFR调控的关键信号通路或节点分子。5.通过Western Blotting等方法对相关激酶和蛋白进行检测,进一步验证CNTFR对胆囊癌细胞中信号通路的调控。6.使用抑制剂特异阻断关键信号通路,检测CNTFR对胆囊癌细胞的调控是否依赖于特定的信号通路。研究结果:1.在20例胆囊癌及癌旁新鲜组织标本中,CNTFR m RNA表达水平明显低于癌旁组织(P<0.01)。而CNTF m RNA表达水平与癌旁相比,没有显着性差异(P=0.108)。蛋白检测结果一致。2.152例胆囊癌石蜡病理切片的免疫组化结果表明CNTFR在胆囊癌组织中表达明显降低,而癌旁组织中有较高水平表达。CNTF在胆囊癌与癌旁组织中的表达没有明显差异。3.在152例胆囊癌患者的病理切片中,CNTFR的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度及TNM分期无关,而与淋巴结转移和远处转移密切相关。单因素生存分析提示CNTFR的表达与胆囊癌总生存率相关。多因素生存分析提示CNTFR表达与远处转移是胆囊癌预后的独立危险因素。4.CNTFR对胆囊癌细胞增殖无明显影响,但对癌细胞的迁移及侵袭能力有显着抑制作用。体内实验亦得出相同结论。5.测序结果发现丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路在两株细胞系的差异性通路排名中均靠前。WB结果显示P38、AKT及STAT3的磷酸化水平及总蛋白表达在对照及过表达CNTFR细胞中均无明显变化,而ERK蛋白磷酸化在过表达CNTFR细胞中明显受抑制。同时,MAPK调控的迁移转移相关蛋白MMP1及MMP10在过表达CNTFR细胞中亦明显下调。6.用ERK抑制剂SCH772984处理细胞后,对照细胞和过表达CNTFR细胞内ERK的磷酸化水平均下调,同时两种细胞的迁移侵袭能力亦被抑制,对照组细胞和过表达组细胞间无明显差异。这表明在胆囊癌细胞中CNTFR通过影响MAPK/ERK通路抑制细胞的侵袭转移能力。研究结论:1.胆囊癌中存在CNTFR及CNTF的表达。胆囊癌中CNTFR的表达明显比癌旁组织低。CNTF在癌及癌旁组织中表达无明显差异。2.CNTFR表达与胆囊癌患者的淋巴转移和远处转移密切相关,且CNTFR的高表达预示着胆囊癌患者的较好预后。CNTFR是潜在的胆囊癌预后判断分子。3.CNTFR对胆囊癌细胞的侵袭转移具有抑制作用,这一作用是通过抑制MAPK/ERK通路的磷酸化,进而抑制下游MMP1及MMP10这两种基质金属蛋白酶的表达来实现的。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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