福建茶树内生放线菌的分离、鉴定和活性分析

论文摘要

植物内生放线菌是新型天然活性物质（特别是抗生素）的潜在来源,具有丰富的物种多样性和功能多样性。已知茶树中包含丰富的代谢物,既具有营养价值,又具有药用价值。福建茶树品种资源丰富,为内生放线菌菌种资源的搜集提供了良好的条件。然而,目前对福建茶树可培养内生放线菌的资源尚缺乏系统全面的研究。因此,为了考察福建茶树内生放线菌的多样性、抗菌活性及促进植物生长的潜能,本试验利用7种分离培养基,对福建地区搜集到的16个茶树品种根、茎和叶进行菌种分离,并对这些菌进行了初步的活性筛选和抗菌物质研究。结果如下:通过培养观察获得的菌株形态特征进行初步鉴定,然后通过16S rRNA基因测序,共鉴定出46株放线菌,来源于9个茶树品种。它们的丰度和多样性在不同的茶树品种和组织中具有差异,其中肉桂、铁观音和福云6号分离到了最多的放线菌菌株,根和叶分离到了最多的放线菌菌株。这46株放线菌分属于11个科13个属,分别为Kribbella、Mobilicoccus、Piscicoccus、链霉菌属、马杜拉菌属、诺卡氏菌属、不动盖球菌属、赖氏菌属、微杆菌属、小单孢菌属、分枝杆菌属、拟诺卡氏菌属以及假诺卡氏菌属。其中优势菌株为链霉菌属,而Mobilicoccus和Piscicoccus作为稀有放线菌,首次分离于植物内生环境。此外,有6株放线菌与模式菌株的同源性低于98.6%,推测它们可能为潜在的新种。为了解茶树内生放线菌的活性潜力,本试验对聚酮合酶基因（pks-I和pks-II）和非核糖体多肽合成酶基因（nrps）进行PCR筛选,共有37株放线菌能够编码至少一个基因。然后进行抗菌（包括细菌和植物病原真菌）活性筛选,共有16株放线菌具有不同程度的抗菌活性。其中,链霉菌XY006能够拮抗大部分真菌,表现出良好的广谱抗真菌活性,XY191、XY192和XY208对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌表现出很强的抑制活性。该结果表明,茶树内生放线菌具有较好的产抗菌物质的潜能。此外,植物内生放线菌在植物促生方面也具有重要价值。因此,本试验测定了所有放线菌的IAA产量和ACC解氨酶活性,其中大多数放线菌（93.5%）能够产生IAA,产量为2.243.1μg/mL,21.7%的放线菌表现出显著的ACC解氨酶活性。有8株放线菌既能产生IAA,又具有ACC解氨酶活性。综上所述,这些结果表明茶树内生放线菌具有广泛的抗细菌、抗真菌和促进植物生长的活性。以抗真菌活性为指导,对具有广谱抗真菌活性的XY006进行活性物质分析。通过一系列的分离纯化步骤,包括有机溶剂萃取、ODS反相柱层析、半制备高效液相分析以及Oasis HLB柱层析,对XY006的粗提物进行纯化,最终获得了3个抗菌物质:化合物1的二级质谱碎片信息与大豆皂甙类物质类似,有待于进一步核磁解析结构。化合物2和3由于样品量较少,无法进行核磁共振解析结构,但通过比对MS/MS离子碎片信息,初步鉴定为环脂肽物质,分别是lipopeptin A和lipopeptin B,它们在结构上相差一个-CH2-。

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ABSTRACT

第1章绪论

1.1 植物内生放线菌的物种多样性

1.2 植物内生放线菌的功能多样性

1.2.1 抗细菌和抗病毒活性

1.2.2 抗肿瘤活性

1.2.3 对植物的促生与生物防治作用

1.2.4 其他活性

1.3 功能基因的研究

1.4 福建茶树内生放线菌的研究现状

1.4.1 茶树内生菌的研究

1.4.2 福建茶树内生放线菌研究现状

1.5 本试验目的及意义

第2章茶树内生放线菌的分离与鉴定

2.1 试验材料

2.1.1 茶树样品

2.1.2 培养基

2.1.3 试剂盒与克隆载体

2.1.4 酶类

2.1.5 抗生素

2.1.6 缓冲液

2.2 试验方法

2.2.1 茶树内生放线菌的分离与纯化

2.2.2 茶树内生放线菌的鉴定

2.3 结果与分析

2.3.1 茶树内生放线菌的分离

2.3.2 可培养茶树内生放线菌的多样性

2.4 讨论

第3章茶树内生放线菌的活性筛选

3.1 试验材料

3.1.1 供试菌株

3.1.2 培养基

3.1.3 抗生素

3.2 试验方法

3.2.1 PCR扩增活性基因筛选

3.2.2 内生放线菌发酵液的抗菌活性检测

3.2.3 内生放线菌产IAA的测定

3.2.4 内生放线菌ACC解氨酶活性的测定

3.3 结果与分析

3.3.1 茶树内生放线菌活性基因筛选

3.3.2 茶树内生放线菌的抗菌活性分析

3.3.3 茶树内生放线菌的促生潜能分析

3.4 讨论

第4章茶树内生放线菌Streptomyces sp.XY006 抗菌物质的分离纯化和性质分析

4.1 试验材料

4.1.1 供试菌株

4.1.2 培养基

4.1.3 主要试剂

4.1.4 主要仪器

4.2 试验方法

4.2.1 菌株的发酵培养

4.2.2 抗菌活性产物的分离纯化

4.3 结果与分析

4.3.1 培养条件的优化及有机试剂的萃取

4.3.2 抗菌化合物的分离纯化

4.3.3 化合物1 的结构鉴定

4.3.4 化合物2 的结构鉴定

4.3.5 化合物3 的结构鉴定

4.4 讨论

第5章总结与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

攻读学位期间的学术论文与研究成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 单文娜

导师: 俞晓敏

关键词: 植物内生放线菌,茶树,多样性,抗菌活性,植物促生潜能

来源: 福建农林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农作物

单位: 福建农林大学

分类号: S571.1;Q939.13

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福建茶树内生放线菌的分离、鉴定和活性分析

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