张应华[1]2004年在《核基质结合区（MAR）调控的胰岛素样生长因子-1表达载体构建与转化甘蓝的研究》文中进行了进一步梳理胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是由70个氨基酸组成的单链多肽，主要由肝脏分泌。大量研究表明，IGF-1是一种多功能细胞增殖和调控因子，具有广泛的生物学功能，介导生长激素对细胞分裂和代谢的大部分作用。人体的几乎所有细胞都受IGF-1的影响，尤其是肌肉细胞、软骨细胞、骨细胞、心脏细胞、肾细胞、神经细胞、皮肤细胞和肺细胞。近年来IGF-1已用于治疗糖尿病、胰岛素抵抗综合征、侏儒症、某些神经系统疾病和某些顽症，临床效果令人鼓舞。由于IGF-1在人和动物体内含量非常低，靠分离天然物质无法满足基础研究和临床利用需要，因此，通过重组DNA技术生产具有生物活性的IGF-1就成为一种必然。IGF-1已在细菌和酵母表达系统中得到表达，但在这两种系统中，大多数重组蛋白不能正确折迭，常常以无活性的包涵体形式聚集。转基因动物和哺乳动物细胞培养体系也存在一些不利的因子，如存在人畜共患病传染的危险、表达产物妨碍宿主正常生长等。植物是一种IGF-1潜在的表达系统，它有可能用于重组IGF-1的规模化生产，但这方面的研究工作刚开始起步。 本项目根据甘蓝(Brassica oleracea var. capitata L. )基因密码偏爱性，对IGF-1基因DNA序列进行了修改，根据优化的序列，人工半合成了该基因。同时从烟草(Nicotiana tabacum L.)和甘蓝中各克隆了一段MAR分子，通过转基因测定分析，两段MARs均能显着提高转基因表达水平，因此，被用于构建IGF-1高效植物表达载体，并首次将IGF-1基因导入甘蓝，成功获得了IGF-1转基因甘蓝新材料，为将甘蓝开发成一种具有治疗作用的药用蔬菜开辟了道路。研究工作主要包括以下几个方面： 1 核基质结合区(Matrix attachment regions, MARs)的分离 核基质结合区(MAR)是能将染色质固定在核基质上(即能与核基质特异性结合)的一段DNA序列，长度通常为300～1000bp，广泛分布于真核生物基因组中，并将真核基因组在结构和功能上分成相对独立的1oop单位。MAR不仅使染色质形成了环形结构，还能作为DNA复制的起点，并能调节真核细胞中的基因表达。由于MAR在转基因动植物中能消除转基因沉默，提高转基因的表达水平，近年来已引起了人们极大的关注。本实验采用CTAB法提取了烟草和甘蓝基因组DNA。根据报道的烟草MAR序列，设计引物P1／P2，为便于表达载体构建，在引物P1的5′端引入了HindⅢ-EcoR Ⅰ酶切位点，通过PCR方法克隆这段MAR分子。为了比较不同来源MARs对转基因表达的影响。根据油菜基因组中短散布元件(SINE)序列设计了引物P3／P4，引物P3的5′端添加了EcoR Ⅰ-HindⅢ酶切位点，PCR方法分离该MAR片段。序列测定结果表明，来自烟草的MAR长度为688bp，AT含量为73.1％，而甘蓝MAR长度为527bD，AT含量为74.8％，两段序列均含有“90％AT box”及其它MAR的特征基序。 2 GUS表达载体的构建 为了分析和比较不同来源的MARs对转基因表达的效果，本实验构建了以CaMV 35S为西南农业大学博士学位论文，巴里早毕早毕里巴里口巴巴里口绝启动子，T-NOS为终止子，携带了MAR的和不携带MAR的GUS表达载体。构建过程中先用了劲，dlllz石沁oRI消化质粒pBllZI，切下表达盒，插入pBINPLUs的2去”dlll/EcoRI位点，得到新的植物表达载体pBGUs。通过单酶切，依次将烟草MAR插入pBGUS表达盒两侧的EcoRI位点和从力dnl位点，每次连接之前载体先进行去磷酸化处理，以防自连环化。设计P一355的卜游引物(Pp)和不NOS的上游引物(Pt)，插入MARs后用PCR方法鉴定其方向，选择MARs成顺式重复的转化子，经酶切和PCR鉴定为阳性克隆后，得到新的植物表达载体.命名为pBMGUSMI(MAR一p35s一GUS一TNOS一MAR)。用同样的方法，依次将甘蓝MAR插入pBGUS表达盒两端的去斤”dm位点和石七。Rl位点，选择MARs方向相同的重组质粒，酶切和pCR检测为阳性的，命名为PBMGUSMZ。3 Gus转基因烟草的获得及活性侧定 为检测和比较不同MARS对转基因植株中转基因表达的效果，将所构建的携带MAR和没携带MAR的3个GUs表达载体，用农杆菌介导的叶盘法转化烟草。在Ms十2.5m岁LBA+0.5m留L IAA+l oom泌kan.+25Om叭Cb.上筛选培养，形成不定芽后转到相同的筛选培养基上再次进行筛选，淘汰掉少数逃逸筛选的不定芽.为保证所获得的植株都是独立的转化体，每个外植体上只取一个芽.所获得的转化苗在Ms附加loom叭kan.的培养基中生根.按照Jefferson方法，以四甲基伞形酮p一D一葡萄糖普酸作底物，荧光分光光度计定量测定转基因烟草中的GUS表达活性。蛋白质含量按Bradford的方法，用分光光度计测定。为减少误差，每个植株均取距顶端第4片叶，每个转化群体各取25株，未转基因植株作对照，取10株。GUS活性以四甲基伞形酮(4一Mu)的纳摩尔数与总蛋白质含量及时间的比值(nmol Mu·mg一’protein，min’’)表示。结果表明，无论是来自烟草的MAR还是甘蓝的MAR，构建到表达框两翼后，均显着提高了GUs基因的表达活性。与pBGuS转化群体相比，来自甘蓝的MAR使GUS的表达活性平均提高了2倍;而构建了烟草MAR的表达载体，使GUS的表达活性平均提高了1.5倍。测定结果还表明，无论是来自甘蓝的MAR还是来自烟草的MAR都不能降低不同?
张应华, 王小佳[2]2004年在《用于转化甘蓝的胰岛素样生长因子Ⅰ的合成及MAR调控的表达载体构建》文中研究表明胰岛素样生长因子I(IGF-I)是一种多功能细胞调控因子,在神经损伤、糖尿病、生长迟滞、骨质疏松等疾病的治疗中具有广阔应用前景。IGF-I主要存在于人和动物血液中,但其含量很低,天然来源无法满足临床利用需要,利用基因工程方法生产IGF-I是解决这一问题的有效途径。我们根据甘蓝偏爱密码,对整个基因DNA序列进行了修改。并从烟草中克隆了一段核基质结合区(MAR),构建了MAR调控的
成晓静[3]2016年在《不同果实特异性启动子调控下的IGF-1基因对番茄遗传转化的研究》文中认为番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)是茄科(Solanaceae),番茄属的植物,是原产自南美亚热带地区,一年生植物,是世界各地广泛种植的一种重要蔬菜作物之一。在番茄上开展表达口服疫苗的研究,可大大提升番茄的应用价值。不同类型的果实特异性启动子在果实中的发育时期及调控机理不同,筛选理想的果实特异性启动子可为利用番茄作为载体来表达外源蛋白奠定前期基础。IGF-1是调节机体生长发育、生殖、免疫和机体代谢的关键因子,在治疗糖尿病、骨质疏松、肌营养不良性侧索硬化病等疾病具有广阔的应用前景。本研究以番茄为材料,构建了包含不同果实特异性的5个启动子表达载体,采用农杆菌介导法,将IGF-1基因导入番茄中,并进行了分子检测,获得了转基因番茄植株,为利用番茄特异表达外源蛋白提供技术和理论基础,也为利用番茄口服治疗糖尿病奠定材料基础。具体研究结果如下:(1)表达载体的构建:本研究构建了5个果实特异性启动子的植物表达载体:pCAP-IGF-1、pCAPG-IGF-1、pCAGP-IGF-1、pCATP-IGF-1和pCAOC-IGF-1。并将5个植物表达载体导入农杆菌LBA4404菌株中。(2)番茄遗传转化体系的优化:试验采用AC++和1448两种番茄材料,分别进行再生体系的培养,结果表明:番茄材料AC++诱导分化的效果明显高于1448,进而确立了最佳再生体系培养的材料为番茄材料AC++。采用正交设计法,研究了不同的激素水平(IAA、ZT、AgNO3)对番茄再生体系的影响。确定了诱导愈伤组织及不定芽分化的最适宜培养基为:MS+ZT 2.0mg/L+IAA0.5mg/L+AgNO3 3.0mg/l;诱导生根的最适宜培养基为:1/2 MS+IAA 0.3mg/L。采用正交设计法,对影响转化效率的各参数(浸染液、乙酰丁香酮、浸染时间、共培养天数)进行优化,确定了最适宜的转化参数:以浸染液为MS的液体培养基,不添加乙酰丁香酮、浸染时间10 min、共培养天数2d为最佳转化条件。(3)抗性植株的PCR鉴定:经转化体系的培养,最终获得抗性苗共41株,其中AGPL1启动子获得抗性植株15株,黄瓜素启动子获得抗性植株12株,甜瓜ACO启动子获得抗性植株6株,PG启动子获得抗性植株6株,AP启动子获得2株抗性植株。对获得的抗性植株进行PCR分子检测,共21株阳性植株,阳性率达51.21%。证明外源基因IGF-1已成功整合进入番茄基因组中。其中AGPL1启动子最终获得阳性植株8株,黄瓜素启动子获得阳性植株6株,甜瓜ACO启动子获得阳性植株3株,PG启动子获得阳性植株3株,AP启动子获得1株阳性植株。
柴政[4]2016年在《一效膏促进慢性皮肤溃疡创面修复的研究》文中指出目的:通过观察皮肤破损、激素干预、异物植入3种因素对小鼠皮肤溃疡创面的影响,探讨最符合临床慢性皮肤溃疡特点的复合因素迭加造模方法,为进一步研究提供理想的动物模型。并在此基础上观察一效膏对慢性皮肤溃疡小鼠创面愈合的影响,探讨其促进创面愈合的作用机制。材料与方法:实验一:清洁级昆明种小鼠,50只,均为雄性,体重20-22g。随机数字表法随机分为:皮损+激素+异物组、皮损+激素组、皮损+异物组、单纯皮损组、空白组;每组各10只小鼠。皮损+激素+异物组与皮损+激素组小鼠连续3天股部肌注氢化可的松注射液4ml/kg,其余各组小鼠注射等量生理盐水。于造模第4天用4%水合氯醛麻醉后,剪去背部毛,在腰椎正中部减除部分皮肤,造成直径大约为1.2cm的圆形皮肤全层切口。皮损+激素+异物组、皮损+异物组小鼠于皮肤切开后同时用血管钳将皮肤组织分离至肌筋膜,然后用镊子轻轻拉开切口,将消毒的塑料环边缘埋入切口内,最后将紧靠塑料环边缘的皮肤缝合二针,以防环脱落。造模成功后观察小鼠一般状态、疮面形态、分泌物,定期称量小鼠体重,测量创面面积并计算创面愈合率,造模后14天处死小鼠,剪下创面新生肉芽组织及创周组织,行HE染色观察创面组织毛细血管新生及成纤维细胞增殖情况。实验二:清洁级昆明种小鼠40只,随机分为空白组、模型组、一效膏组、康复新液组,每组各10只,除空白组外,各组小鼠采用皮损+激素+异物组方法造模,各治疗组给予相应药物,模型组予生理盐水涂抹创面,各组均每日换药一次,以无菌纱布覆盖创面,空白组不予干预。治疗后定期肉眼观察小鼠创面大体情况,测量创面面积并计算创面愈合率,于治疗后第21天处死小鼠,取塑料环内肉芽组织,用电子天平称取肉芽肿湿重,然后以10%福尔马林溶液固定保存,HE染色进行形态学观察,免疫组化法检测创面组织中bcl-2、bax蛋白表达水平。实验叁:清洁级昆明种小鼠120只,随机分为空白组、模型组、一效膏组、康复新液组,每组各30只,每组在其基础上再分为一周组、二周组、叁周组3个亚组,每组各10只小鼠。各组小鼠于规定时间结束观察,处死后,取塑料环内肉芽组织,1/3浸入10%福尔马林溶液固定保存,做组织学观察、免疫组化法检测用。2/3放入冻存管内超低温冰箱保存,作real-timepcr检测用。观察指标:血管内皮生长因子(vegf),成纤维细胞生长因子(fgf),转化生长因子(tgf-β),cd34抗原,及成纤维细胞(fb)计数。结果:实验一:1.一般状态:造模1周后皮损+异物组、单纯皮损组小鼠活动状态较好,运动灵敏,进食良好,大便成形,体态与空白组相比略显瘦削。皮损+激素+异物组与皮损+激素组体态明显消瘦,进食量少,大便稀薄不成形,活动量明显减少,蜷缩,四肢及尾部冷。2.创面情况:单纯皮损组疮面于造模后第3天即出现鲜红肉芽组织,创面湿润,少量浆液性渗出,创面平坦,无明显结痂,愈合速度快。皮损+激素组疮面颜色暗淡,分泌物清晰,肉芽组织量少且不鲜嫩,创面愈合较单纯皮损组慢。皮损+异物组初期即有大量稠厚黄白色分泌物,分泌物下创面基底组织颜色鲜红,后期转为暗红,创面结痂较厚,愈合趋势不明显。皮损+激素+异物组,初期有大量清晰分泌物,中后期疮形散漫,平坦塌陷,色泽紫暗,肉芽苍白并被结痂覆盖,愈合趋势不明显。3.体重情况:造模当天各组小鼠体重无明显差异,造模后第1周各组体重比较,单纯皮损组体重增长最快,皮损+激素+异物组体重增长最慢。析因设计方差分析表明,激素注射与异物植入两种因素对小鼠体重变化均有影响。4.造模后各组小鼠创面愈合率比较,单纯皮损组愈合速度最快,皮损+激素+异物组最慢。5.组织学观察:单纯皮损组切片中可见较多新生排列整齐的毛细血管,伴有大量成纤维细胞,少量纤维母细胞及萎缩的炎性细胞,无明显水肿。皮损+激素组切片可见新生毛细血管及成纤维细胞排列较为稀疏,可见炎性细胞。皮损+异物组切片显示大量萎缩的炎性细胞,偶可见巨噬细胞及浆细胞,大小血管排列杂乱且部分破裂,红细胞溢出散落于组织间隙,并伴有水肿。皮损+激素+异物组切片可见毛细血管生成及成纤维细胞稀少,排列杂乱,可见炎性细胞。空白组皮下组织切片可见肌纤维排列整齐有序,无炎性细胞浸润。实验二:1.创面大体观察:一效膏组小鼠创面用药后第3-7天创面色泽由晦暗转红活,出现肉芽组织,创面湿润,较多稠厚分泌物,无明显结痂,触之较软,愈合趋势明显;康复新液组小鼠用药后第3-9天可见少量肉芽组织,色泽尚红活,表面较为干燥,分泌物清晰,少许结痂覆盖,愈合趋势较明显;模型组小鼠创面色泽晦暗,疮形散漫,平坦塌陷,愈合早期无明显肉芽组织,致中后期依稀可见少许苍白肉芽,表面被结痂覆盖,触之较硬,无明显愈合趋势。2.创面愈合率:治疗第5天,各治疗组与模型组比较,一效膏组、康复新液组创面愈合率明显提高(p<0.05)。治疗第10天,各治疗组与模型组比较,一效膏组、康复新液组创面愈合率明显提高(p<0.05);一效膏组与康复新液组比较,差异无统计学意义。治疗第17天,与模型组比较,一效膏组、康复新液组创面愈合率明显提高(p<0.05)。3.创面肉芽组织湿重:用药后21天,各治疗组与模型组相比,一效膏组与康复新液组小鼠创面塑料环内肉芽组织湿重明显提高(p<0.05)。4.创面bcl-2、bax蛋白表达:各治疗组与模型组相比,一效膏组与康复新液组小鼠创面肉芽组织内bcl-2表达明显升高(p<0.001),而bax表达明显降低(p<0.001)。5.组织学观察:正常组皮下组织切片可见肌纤维排列整齐有序,无炎性细胞浸润。模型组肉芽组织增生不明显,毛细血管数量稀疏,排列杂乱,内皮细胞与成纤维细胞数量稀少,可见炎性细胞,瘢痕增生明显。一效膏组肉芽组织增生较明显,毛细血管生成明显较模型组多,排列整齐,伴有大量成纤维细胞及少量纤维母细胞,偶可见少量炎性细胞,瘢痕增生不明显。康复新液组毛细血管生成、成纤维细胞情况与一效膏组相似,可见少量瘢痕组织。实验叁:1.成纤维细胞计数:各治疗组与模型组比较,用药后第7、14、21天,一效膏组与康复新液组成纤维细胞计数明显提高(p<0.05)。2.cd34结果:各时间点,模型组cd34蛋白表达水平均明显高于空白组(p<0.01);与模型组相比,各治疗组cd34蛋白表达水平明显提高(p<0.01)。3.vegf结果:免疫组化:各时间点,模型组vegf蛋白表达水平均明显高于空白组(p<0.05)。与模型组比较,各时间点一效膏组vegf蛋白表达均水平均有所提高,其中第7、14天两组间比较差异有统计学意义(p<0.05),与模型组比较,各时间点康复新液组vegf蛋白表达均有所提高,其中第14天两组间比较差异有统计学意义(p<0.01)。rt-pcr:各时间点模型组vegfmrna表达水平均高于空白组(p<0.05)。与模型组比较,各时间点治疗组vegfmrna表达水平均有所提高(p<0.05)。4.fgf结果:免疫组化:各时间点,模型组fgf蛋白表达水平均明显高于空白组(p<0.01)。与模型组比较,各时间点一效膏组FGF蛋白表达均水平均有所提高,其中第14天两组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,各时间点康复新液组FGF蛋白表达均有所提高。RT-PCR:各时间点模型组FGF mRNA表达均高于空白组,其中第7天两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,各时间点,一效膏组FGF mRNA表达均有所提高(P<0.01)。与模型组比较,各时间点康复新液组FGF mRNA表达均有所提高。5.TGF-β结果:免疫组化:各时间点,模型组TGF-β蛋白表达水平均高于空白组(P<0.05)。与模型组比较,各时间点一效膏组TGF-β蛋白表达均水平均有所提高,其中第7、14天两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,各时间点康复新液组TGF-β蛋白表达均有所提高,其中第7、14天两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR:各时间点模型组TGF-βmRNA表达均高于空白组(P<0.05)。与模型组比较,各时间点一效膏组TGF-βmRNA表达水平有所提高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,康复新液组TGF-βmRNA表达水平有所提高,其中第14、21天差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论:1.皮肤缺损迭加激素注射与异物植入的复合因素造模方法,能有效维持创面慢性皮肤溃疡的状态,且符合中医外科阴症疮疡的证候特点。2.一效膏能有效促进慢性皮肤溃疡创面的愈合,提高创面愈合率,并能促进创面肉芽组织的生成,其作用机制可能与上调bcl-2表达水平,下调bax表达水平有关。3.一效膏能通过上调VEGF、FGF、TGF-β表达水平,促进创面毛细血管的新生和成纤维细胞的增殖,进而促进慢性皮肤溃疡创面的愈合。
参考文献：
[1]. 核基质结合区（MAR）调控的胰岛素样生长因子-1表达载体构建与转化甘蓝的研究[D]. 张应华. 西南农业大学. 2004
[2]. 用于转化甘蓝的胰岛素样生长因子Ⅰ的合成及MAR调控的表达载体构建[J]. 张应华, 王小佳. 农业生物技术学报. 2004
[3]. 不同果实特异性启动子调控下的IGF-1基因对番茄遗传转化的研究[D]. 成晓静. 云南农业大学. 2016
[4]. 一效膏促进慢性皮肤溃疡创面修复的研究[D]. 柴政. 辽宁中医药大学. 2016
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