导读:本文包含了非特异性脂转移蛋白论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:蛋白,异性,脂质,基因,甘薯,生物,角斑病。
非特异性脂转移蛋白论文文献综述
黄何彪[1]（2018）在《菜心非特异性脂转移蛋白基因（nsLTP）的克隆、表达与功能分析》一文中研究指出农田土壤中邻苯二甲酸酯(Phthalic acid ester,PAEs)的污染状况日趋严重,直接影响农产品质量安全,严重危害人体健康。课题组前期对筛选获得的高/低累积PAEs菜心(Brassica parachinensis L)进行转录组和蛋白组学分析,发现非特异性脂转移蛋白(nsLTP)基因在菜心高、低累积PAEs过程中差异表达十分显着。因此,为探讨nsLTP菜心在高/低累积PAEs差异特性形成中的作用,本研究通过RACE克隆获得了菜心nsLTP基因全长并对其进行序列分析,采用原核表达,亚细胞定位和分子模拟等实验手段研究其分子生理功能,为揭示不同基因型菜心高/低累积PAEs性状形成的分子生物学机制提供基础。本论文取得的主要研究结果如下:(1)本研究以菜心转录组数据为基础,经过RACE克隆获得了菜心nsLTP基因全长。该基因全长587 bp,开放阅读框(ORF)长297 bp。共编码97个氨基酸,蛋白分子量为10.36 KDa,根据蛋白质分子量分类,其属于nsLTP I型蛋白。通过基因序列比对分析发现与油菜(Brasscia nupus)nsTLP基因同源性最高,同源性高达97%,蛋白质多重比对以及进化树分析发现,与芜菁(Brasscia rapa)和油菜(Brasscia napus)差异最小,与芥蓝(Camelina sativa)差异最大。通过对蛋白氨基酸序列进行分析发现,该基因编码的蛋白质N端有一段29个氨基酸大小的信号肽,且具有与信号肽序列重迭的跨膜结构,对应的氨基酸序列疏水性明显。对菜心nsLTP蛋白二级结构和叁级结构预测发现,nsLTP基因编码蛋白具有8个半胱氨酸组成4对二硫键而形成的疏水腔空穴。(2)成功构建pET-32a-nsLTP原核表达载体,在IPTG诱导下可在短时间内(3h)获得了大量重组蛋白。该蛋白为可溶性蛋白,低温及提高诱导剂浓度有利于重组蛋白可溶性表达。通过His标签纯化获得了重组蛋白,Western Blot验证显示获得的蛋白为目的重组蛋白。nsLTP基因原核表达及蛋白纯化为进一步研究nsLTP蛋白功能提供了基础。(3)成功构建了亚细胞定位载体pBI-121-GFP-nsLTP,并转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞,侵染洋葱表皮细胞,通过激光共聚焦显微镜观察pBI-121-GFP-nsLTP融合蛋白绿色荧光信号在细胞中的分布情况。结果表明,GFP-nsLTP融合蛋白绿色荧光信号分布在细胞壁上,细胞核、细胞质、细胞膜中均未显示。为进一步确认融合蛋白荧光信号的分布,利用蔗糖溶液将洋葱细胞进行质壁分离,结果发现,原生质体明显皱缩,细胞质和细胞膜中无荧光信号,而细胞壁上发现了明显荧光信号,说明菜心中nsLTP蛋白定位在细胞壁上,与生物信息学预测结果一致。(4)利用分子模拟对DBP和nsLTP蛋白结合模拟分析,结果发现,DBP能紧密结合于nsLTP蛋白的H3和H5 α螺旋形成疏水性口袋中,并与H3 α螺旋上的半胱氨酸(Cys-37)通过氢键结合在一起,形成了 Cys-37:HN:DBP结构,键长为1.784 A。DBP分子被nsLTP蛋白分子中的Cys-65、Leu-36、Asn-64、Pro-63、Pro-34、Ser-62、Ala-61、Lys-33等氨基酯酸残基环绕。由于配体具有可旋转的原子,分子对接中的扭转能(Torsional Energy)为2.98 kcal/mol,配体和蛋白二者相互作用的分子间能量(Inermol Energy)为-7.44 kcal/mol,因此计算得到二者的结合能量(Binding Energy)为-4.46 kcal/mol(结合能=分子间能量+扭转能)。nsLTP蛋白能与DBP结合形成稳定复合物,在菜心吸收累积PAEs过程中具有重要作用。(本文来源于《暨南大学》期刊2018-05-01）
徐扬[2]（2018）在《非特异性脂转移蛋白NtLTP4作为正调控因子参与烟草对非生物和生物胁迫的响应》一文中研究指出作为固着生长的植物,不可避免的会遭遇到各种环境胁迫的影响。环境胁迫通常分为生物胁迫和非生物胁迫,前者包括细菌、真菌等病原微生物和昆虫等节肢动物,后者则代指高盐、干旱等不利因素,这些环境胁迫对作物的生长和发育都会造成严重影响,是导致粮食减产和品质降低的主要因素。经过长期的进化,植物体产生了一套精细、复杂的调控网络来应对环境胁迫,包括丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)级联途径的激活,胁迫相关基因的表达,保护性蛋白的合成等等。筛选并研究植物体中全新的胁迫响应基因,深入解析植物响应胁迫的分子机理,对植物的“抗逆抗病分子育种工作”具有重要意义。非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid transfer protein,ns LTPs)是植物中大量存在的一类富含半胱氨酸的小分子碱性脂质结合蛋白,先前研究表明ns LTP能跨膜转运多种脂类物质,并能够参与非生物和生物胁迫响应,但是具体的分子机理研究较少。我们在普通烟(Nicotiana tabacum,NC89)中克隆并获得功能未知基因NtLTP4,初步研究发现,过表达NtLTP4能增强烟草对干旱、高盐和青枯菌感染的耐受性。本研究对NtLTP4参与非生物和生物胁迫的分子机理进行了深入阐析。主要结果和结论如下:(1)NtLTP4响应多种胁迫诱导表达模式表明,NtLTP4受多种非生物胁迫(干旱、高盐和氧化胁迫)、生物胁迫(青枯菌)以及胁迫相关激素(脱落酸、茉莉酸、水杨酸和乙烯)等的显着诱导。诱导表达模式分析表明NtLTP4在植物生长发育及胁迫应答过程中发挥了重要且复杂的调控作用。(2)Nt LTP4是外分泌小蛋白用35S::NtLTP4-GFP转化烟草的亚细胞定位实验发现,转化烟草的荧光出现在细胞边缘,为确定该蛋白的具体定位,我们再次转化洋葱细胞并进行质壁分离实验,发现Nt LTP4主要定位于细胞壁和细胞外基质,说明NtLTP4是一种外分泌小蛋白,与其N端存在的分泌信号肽序列这一结果相互映证,表明Nt LTP4可能在细胞信号传导过程中发挥信号分子的作用。(3)NtLTP4作为正调控因子参与植物的非生物胁迫响应在高盐和干旱等胁迫条件下,与野生型对照组相比,NtLTP4的过表达株系表现出了极强的耐受性,种子萌发更快,幼苗根长更长,叶片失水更慢等。通过Na~+探针以及原子吸收法对Na~+含量进行检测发现,过表达NtLTP4明显降低了转基因烟草的Na~+含量,说明NtLTP4影响了植物体内Na~+的稳态。qRT-PCR检测发现,盐胁迫下,NtLTP4过表达株系中NHX1和HKT1两个关键Na~+转运体的表达量明显高于野生型,说明NtLTP4通过调控NHX1和HKT1促进Na~+向液泡的转运以及Na~+由地上向地下运输这两个过程,减弱了Na~+对植物细胞的毒害作用。另外,失水率和气孔开度的测定实验发现NtLTP4过表达烟草叶片气孔开度小,蒸腾速率低,说明NtLTP4能够通过降低气孔开度和叶片蒸腾速率来增强植物对干旱胁迫的耐受能力。(4)NtLTP4作为正调控因子参与植物抗病防御反应青枯菌病斑检测实验表明,过表达株系叶片萎蔫程度较低,细菌含量较少,野生型叶片萎蔫程度较高且细菌含量较多,说明过表达NtLTP4能够增强对青枯菌的抗性。qRT-PCR检测发现,过表达烟草体内的病程相关蛋白(pathogenesis-related protein,PR)的转录水平明显高于野生型;DAB,NBT染色分析以及ROS含量测定发现,病原菌侵染后转基因烟草具有较低的ROS积累,ROS清除酶的活性和含量远高于野生型;进一步气孔开度观察发现,过表达NtLTP4能够促进烟草气孔闭合,减少水分散失,减缓青枯菌侵染引发的叶片萎蔫。综上结果表明,NtLTP4通过诱导PR的表达,增强活性氧的清除,降低气孔开度,从而增强烟草对青枯菌的抗性。(5)Nt LTP4位于WIPK信号下游,并且两者存在直接互作为了进一步分析NtLTP4参与抗病的分子机理,我们通过酵母双杂交技术筛选烟草cDNA文库,筛选到7个重要的候选蛋白。有研究表明,MAPK级联信号通路在植物响应非生物和生物胁迫中发挥着重要的作用,故选择MAPK家族成员wound-induced protein kinase(WIPK)作为深入研究的对象。荧光素酶互补实验(firefly luciferase complementation imaging,LCI),双分子荧光互补实验(bimolecular fluorescence complementation,BIFC)和免疫共沉淀实验(co-Immunoprecipitation,co-IP)进一步确定了Nt LTP4与WIPK的互作关系。为了深入分析NtLTP4与WIPK之间的调控关系,我们在ntltp4突变体中利用TRV下调WIPK,获得ntltp4/wipk双突。接种青枯菌发现,ntltp4/wipk双突比ntltp4单突和wipk单突对青枯菌的敏感性加剧,叶片ROS积累增多,气孔开度更大,表明NtLTP4与WIPK都能参与植物抗病防御过程。进一步在NtLTP4过表达株系中利用TRV下调WIPK,获得NtLTP4/wipk材料;接种青枯菌发现,NtLTP4/wipk的表型与NtLTP4过表达株系的表型相似,叶片青枯菌含量较少,活性氧含量低,气孔开度减小,对青枯菌的抗性提高。上述结果表明,Nt LTP4位于WIPK的下游,与WIPK共同提高植物的抗病性。(6)WIPK可维持NtLTP4的蛋白稳定性通过Western Blot对NtLTP4的蛋白含量检测显示,在wipk突变体中NtLTP4的蛋白含量远低于对照,而在WIPK过表达株系中,NtLTP4的蛋白含量却高于对照,说明WIPK能够促进Nt LTP4蛋白的积累。cell-free半体内实验得到相同结果。而qRT-PCR检测发现,不同实验材料中NtLTP4的转录水平是基本一致的,表明WIPK促进NtLTP4的蛋白积累并非是调控NtLTP4的转录水平实现的。上述结果表明,WIPK能够在蛋白水平维持Nt LTP4的稳定性,从而提高植物的抗病性。(7)NPK1-NtMEK2-WIPK-Nt LTP4信号级联通路参与植物抗病防御过程为建立一条完整的烟草MAPK级联信号通路,我们利用酵母双杂交技术逐一验证了WIPK与烟草中已知的MAP2K/3K成员之间的互作关系,鉴定出WIPK能与MAPKK成员NtMEK2互作,进一步发现NtMEK2可以与烟草MAPKKK组分NPK1互作,并最终建立了NPK1-NtMEK2-WIPK-NtLTP4信号级联通路,这一级联通路可能是烟草中重要的抗病信号通路之一。综上所述,NtLTP4能够通过调控HKT1以及NHX1的转录增强烟草对Na~+的清除,减少植物因Na~+积累造成的毒害作用,从而提高盐胁迫的耐受性,并通过降低蒸腾速率和气孔开度增强对干旱胁迫的耐受性。另外,NtLTP4还能够通过增强活性氧的清除和降低气孔开度来提高转基因烟草对青枯菌的抗性。更深入地研究表明,Nt LTP4能够与MAPK级联组分WIPK互作。并且通过NPK1-NtMEK2-WIPK-NtLTP4级联信号通路稳定Nt LTP4蛋白来参与抗病防御过程,从而增强对非生物和生物胁迫的耐受性。本研究首次揭示了,烟草中MAPK级联通路与非特异性脂转移蛋白结合调控植物响应非生物和生物胁迫的分子机理,具有重要的创新意义。(本文来源于《山东农业大学》期刊2018-04-10）
ALAA,GAMAL,MOHAMED,FERIG,ABOUSHANAB[3]（2017）在《番茄非特异性脂质转移蛋白的鉴定与表达分析》一文中研究指出在植物中,非特异性脂质转移蛋白(nsLTPs)是一类小的碱性蛋白(6.5至10.5KD),由多基因家族编码,它们参与多种生理生化过程。脂质转移蛋白(LTP)具有转移或结合不同类型的疏水性分子例如脂肪酸,磷脂,脂肪酰基-Co A,糖脂和角质单体的能力,NsLTPs通常包含ECM结构域。我们通过数据库和基因组分析,利用Blast搜索,我们在番茄中鉴定了仅含有编码ECMS域,并且没有其他可识别的功能结构域的非特异性脂质转移蛋白,总共38个基因被鉴定为nsLTPs。我们进一步研究了该基因家族的基因结构,染色体位置,功能注释和进化关系。此外,我们分析了这些基因的顺式元件,研究了在不同非生物逆境和激素处理条件下的表达谱情况。这些对SlnsLTPs基因家族的研究为揭示它们潜在的功能提供了一个线索。(本文来源于《华中农业大学》期刊2017-06-01）
李雪丹,魏昌赫,邵欢欢,吴燕,张义正[4]（2016）在《甘薯非特异性脂质转移蛋白基因克隆与表达分析（英文）》一文中研究指出非特异脂质转移蛋白(ns LTP)是植物界普遍存在的一类涉及多种胁迫反应的可溶性蛋白。为了阐明甘薯中非特异性脂质转移蛋白基因IbLTP1和IbLTP2在盐胁迫反应中的功能,本研究运用PCR技术,对IbLTP1和IbLTP2基因进行了克隆,并通过生物信息学方法分析了序列结构、蛋白质保守结构域和系统进化关系;利用q RT-PCR方法检测了这两个基因在不同组织中的表达模式以及盐胁迫条件下的表达差异;将IbLTP1和IbLTP2基因克隆到大肠杆菌的原核表达载体p ET32a中,对重组菌BL21(p ET32a-LTP)的耐盐性进行分析。序列分析表明:IbLTP1和IbLTP2编码区均不含内含子并都具有等位基因。IbLTP1和IbLTP2基因的蛋白质序列分别包括114和94个氨基酸残基并且不含色氨酸残基,蛋白序列N端含有信号肽序列。保守结构域和系统进化分析结果表明:IbLTP1和IbLTP2均含有ns LTP蛋白的保守结构域,IbLTP1属于TypeⅠ而IbLTP2属于TypeⅡ。实时荧光定量PCR分析表明:IbLTP1在幼叶中表达量最高,根中表达量最低;而IbLTP2在茎中表达量最高,成熟叶中表达量最低。在Na Cl胁迫条件下,IbLTP1和IbLTP2表达量在根中基本无变化而在茎和叶中上调。大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达IbLTP1和IbLTP2基因能够提高转基因菌株对Na Cl的耐受性。因此,本研究推测IbLTP1和IbLTP2基因可能在甘薯盐胁迫反应中发挥了作用。(本文来源于《植物科学学报》期刊2016年04期）
李雪丹,吴燕,张义正[5]（2015）在《甘薯非特异性脂质转移蛋白基因克隆与表达分析》一文中研究指出非特异性脂质转移蛋白(nonspecific lipid transfer protein,nsLTP)是植物体普遍存在的一类分子量小(通常6.5-10.5 kDa)、碱性(pI通常为8.5-12)、表达量高、涉及多种胁迫反应的可溶性蛋白质,因其在体外对各种脂质体具有广泛的亲和作用,所以被称作为非特异性脂质转移蛋白。本研究首先从本实验室构建的甘薯品种徐薯18转录组库中筛选到2条非特异性脂质转移蛋白基因(IbnsLTP1和IbnsLTP2),利用PCR(本文来源于《遗传多样性：前沿与挑战——中国的遗传学研究（2013-2015）——2015中国遗传学会大会论文摘要汇编》期刊2015-08-14）
李蔚,曲春浦,许志茹,刘春,刘关君[6]（2015）在《西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白基因PsnsLTP的功能分析》一文中研究指出通过在农杆菌介导下,利用西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白基因(植物表达载体:pROKII-PsnsLTP)对烟草进行遗传转化,经卡那霉素抗性分化筛选及PCR鉴定,获得6个转基因烟草株系。接种烟草炭疽病病菌和猝倒病病菌后观察转基因植株和野生型的表型差异,在Na Cl、Cd Cl2、7.5%PEG6000的胁迫下进行表型观察和生理指标的测定。结果显示:与野生型烟草相比,T1代转基因植株已具有较强的耐烟草炭疽病和猝倒病的能力;其超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性显着增强,丙二醛(MAD)含量显着降低,且幼苗具有较好的生长性状。由此证明,西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白PsnsLTP增加了转基因烟草抵御生物胁迫和非生物胁迫的能力,这些工作为深入研究PsnsLTP基因的抗逆机制提供了参考。(本文来源于《植物研究》期刊2015年04期）
王海波,邹竹荣,龚明[7]（2015）在《小桐子非特异性脂质转移蛋白A的基因克隆及其表达和功能分析》一文中研究指出基于我们最近获得的小桐子低温驯化转录组和数字基因表达谱数据,本工作研究了低温驯化条件下差异表达变化较大的非特异性脂质转移蛋白A基因Jcns LTPA。克隆到该基因的c DNA序列全长833 bp,开放阅读框长度513 bp,编码170个氨基酸,存在ATT_LTSS典型保守功能基序。其启动子区域中鉴定到了TATA框、CAAT框、CATA框、W框等顺式作用元件以及CRT/DRE低温响应元件。半定量RT-PCR分析表明,该基因在茎、根、叶中都有表达,以茎中表达量最高、且受低温诱导最显着。同时,酵母表达Jcns LTPA也提高了重组酵母菌的抗低温能力。这些结果充分说明了小桐子Jcns LTPA是与抗冷性密切相关的基因,可以用于小桐子的抗冷性遗传改良。(本文来源于《植物生理学报》期刊2015年01期）
金大伟,杨军,李锋,王燃,罗朝鹏[8]（2015）在《烟草非特异性脂质转移蛋白基因的克隆与表达分析》一文中研究指出为了阐明非特异性脂质转移蛋白基因Nt LTP1.1在烟草抗病抗逆反应中的功能,用c DNA末端快速扩增技术(Rapid-amplification of c DNA ends,RACE)从普通烟草中克隆了该基因全长,并通过生物信息学方法分析了c DNA序列结构、蛋白理化性质、保守基序、叁级结构以及系统进化关系;利用q RT-PCR检测了该基因在不同组织中的表达模式以及胁迫条件下的表达差异。结果表明:Nt LTP1.1基因全长615 bp,编码蛋白含有129个氨基酸,为一种小分子碱性可溶性蛋白。蛋白序列N端含有信号肽,预测其可能定位于分泌途径中。Blast比对结果显示,烟草非特异性脂质转移蛋白与番茄ns LTP1序列相似性最高,含有8CM保守基序(8个半胱氨酸残基组成的保守基序)。蛋白叁级结构预测表明,Nt LTP1.1具有ns LTP典型的叁级结构,包括4个α-螺旋,4对二硫键,1个可结合和容纳脂质分子的疏水腔。多重比对结果显示,Nt LTP1.1 8CM结构域模式为C1-X9-C2-X13-C3C4-X19-C5XC6-X22-C7-X13-C8。系统进化分析结果表明,ns LTP进化形成5类,Nt LTP1.1属于Type I。表达模式分析显示,Nt LTP1.1基因主要在烟草叶片中表达,具有明显的组织表达特异性。在低温胁迫条件下表达受到抑制,在水杨酸诱导条件下表达上调。因此,推测Nt LTP1.1基因可能在烟草防御反应中发挥作用。(本文来源于《烟草科技》期刊2015年01期）
孟令波,刘关君,李淑敏,徐丹丹,秦智伟[9]（2013）在《黄瓜非特异性脂质转移蛋白基因的序列分析及细菌性角斑病菌浸染下的表达》一文中研究指出非特异性脂质转移蛋白(nsLTP)是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白,具有抗菌防御功能。分析黄瓜非特异性脂质转运蛋白基因nsLTP的序列特征及其在细菌性角斑病菌浸染过程中的表达模式,对其应用于黄瓜等农作物转基因工程,增强作物抗病性具有重要意义。在黄瓜叶cDNA文库中,获得非特异性脂质转移蛋白(nsLTP)cDNA序列,命名为CsnsLTP;该基因全长566 bp,编码121个氨基酸残基;序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有nsLTP家族共有的典型保守区域,属nsLTP家族基因。实时荧光定量PCR分析表明,CsnsLTP在黄瓜叶中有表达。在黄瓜细菌性角斑病菌浸染下,该基因在黄瓜叶中表达增高,并随浸染时间的延长而增强,明显受黄瓜细菌性角斑病菌的诱导,推测该基因在抵御黄瓜细菌性角斑病菌浸染时具有重要作用。(本文来源于《东北农业大学学报》期刊2013年01期）
冯冬林,赖燕,何水林[10]（2012）在《辣椒非特异性脂质转移蛋白基因CaLTP1的克隆及表达分析》一文中研究指出非特异性脂质转移蛋白(nsLTPs)是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白,具有多种生物学功能。从辣椒cDNA文库中筛选得到1个nsLTPs基因,命名为CaLTP1;序列分析结果表明:该基因全长cDNA序列为1 211 bp,推测编码1个包含129个氨基酸残基的前体蛋白。CaLTP1蛋白含有典型的脂质转移蛋白N-端信号肽,保守的AAI结构域和半胱氨酸位点。预测CaLTP1蛋白含有多种功能位点,包括3个CK2磷酸化位点,3个N-豆蔻酰化位点和1个PKC磷酸化位点。实时荧光定量分析组织特异性表达模式表明,CaLTP1在辣椒茎、叶、花中表达量升高。(本文来源于《热带作物学报》期刊2012年10期）
非特异性脂转移蛋白论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
作为固着生长的植物,不可避免的会遭遇到各种环境胁迫的影响。环境胁迫通常分为生物胁迫和非生物胁迫,前者包括细菌、真菌等病原微生物和昆虫等节肢动物,后者则代指高盐、干旱等不利因素,这些环境胁迫对作物的生长和发育都会造成严重影响,是导致粮食减产和品质降低的主要因素。经过长期的进化,植物体产生了一套精细、复杂的调控网络来应对环境胁迫,包括丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)级联途径的激活,胁迫相关基因的表达,保护性蛋白的合成等等。筛选并研究植物体中全新的胁迫响应基因,深入解析植物响应胁迫的分子机理,对植物的“抗逆抗病分子育种工作”具有重要意义。非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid transfer protein,ns LTPs)是植物中大量存在的一类富含半胱氨酸的小分子碱性脂质结合蛋白,先前研究表明ns LTP能跨膜转运多种脂类物质,并能够参与非生物和生物胁迫响应,但是具体的分子机理研究较少。我们在普通烟(Nicotiana tabacum,NC89)中克隆并获得功能未知基因NtLTP4,初步研究发现,过表达NtLTP4能增强烟草对干旱、高盐和青枯菌感染的耐受性。本研究对NtLTP4参与非生物和生物胁迫的分子机理进行了深入阐析。主要结果和结论如下:(1)NtLTP4响应多种胁迫诱导表达模式表明,NtLTP4受多种非生物胁迫(干旱、高盐和氧化胁迫)、生物胁迫(青枯菌)以及胁迫相关激素(脱落酸、茉莉酸、水杨酸和乙烯)等的显着诱导。诱导表达模式分析表明NtLTP4在植物生长发育及胁迫应答过程中发挥了重要且复杂的调控作用。(2)Nt LTP4是外分泌小蛋白用35S::NtLTP4-GFP转化烟草的亚细胞定位实验发现,转化烟草的荧光出现在细胞边缘,为确定该蛋白的具体定位,我们再次转化洋葱细胞并进行质壁分离实验,发现Nt LTP4主要定位于细胞壁和细胞外基质,说明NtLTP4是一种外分泌小蛋白,与其N端存在的分泌信号肽序列这一结果相互映证,表明Nt LTP4可能在细胞信号传导过程中发挥信号分子的作用。(3)NtLTP4作为正调控因子参与植物的非生物胁迫响应在高盐和干旱等胁迫条件下,与野生型对照组相比,NtLTP4的过表达株系表现出了极强的耐受性,种子萌发更快,幼苗根长更长,叶片失水更慢等。通过Na~+探针以及原子吸收法对Na~+含量进行检测发现,过表达NtLTP4明显降低了转基因烟草的Na~+含量,说明NtLTP4影响了植物体内Na~+的稳态。qRT-PCR检测发现,盐胁迫下,NtLTP4过表达株系中NHX1和HKT1两个关键Na~+转运体的表达量明显高于野生型,说明NtLTP4通过调控NHX1和HKT1促进Na~+向液泡的转运以及Na~+由地上向地下运输这两个过程,减弱了Na~+对植物细胞的毒害作用。另外,失水率和气孔开度的测定实验发现NtLTP4过表达烟草叶片气孔开度小,蒸腾速率低,说明NtLTP4能够通过降低气孔开度和叶片蒸腾速率来增强植物对干旱胁迫的耐受能力。(4)NtLTP4作为正调控因子参与植物抗病防御反应青枯菌病斑检测实验表明,过表达株系叶片萎蔫程度较低,细菌含量较少,野生型叶片萎蔫程度较高且细菌含量较多,说明过表达NtLTP4能够增强对青枯菌的抗性。qRT-PCR检测发现,过表达烟草体内的病程相关蛋白(pathogenesis-related protein,PR)的转录水平明显高于野生型;DAB,NBT染色分析以及ROS含量测定发现,病原菌侵染后转基因烟草具有较低的ROS积累,ROS清除酶的活性和含量远高于野生型;进一步气孔开度观察发现,过表达NtLTP4能够促进烟草气孔闭合,减少水分散失,减缓青枯菌侵染引发的叶片萎蔫。综上结果表明,NtLTP4通过诱导PR的表达,增强活性氧的清除,降低气孔开度,从而增强烟草对青枯菌的抗性。(5)Nt LTP4位于WIPK信号下游,并且两者存在直接互作为了进一步分析NtLTP4参与抗病的分子机理,我们通过酵母双杂交技术筛选烟草cDNA文库,筛选到7个重要的候选蛋白。有研究表明,MAPK级联信号通路在植物响应非生物和生物胁迫中发挥着重要的作用,故选择MAPK家族成员wound-induced protein kinase(WIPK)作为深入研究的对象。荧光素酶互补实验(firefly luciferase complementation imaging,LCI),双分子荧光互补实验(bimolecular fluorescence complementation,BIFC)和免疫共沉淀实验(co-Immunoprecipitation,co-IP)进一步确定了Nt LTP4与WIPK的互作关系。为了深入分析NtLTP4与WIPK之间的调控关系,我们在ntltp4突变体中利用TRV下调WIPK,获得ntltp4/wipk双突。接种青枯菌发现,ntltp4/wipk双突比ntltp4单突和wipk单突对青枯菌的敏感性加剧,叶片ROS积累增多,气孔开度更大,表明NtLTP4与WIPK都能参与植物抗病防御过程。进一步在NtLTP4过表达株系中利用TRV下调WIPK,获得NtLTP4/wipk材料;接种青枯菌发现,NtLTP4/wipk的表型与NtLTP4过表达株系的表型相似,叶片青枯菌含量较少,活性氧含量低,气孔开度减小,对青枯菌的抗性提高。上述结果表明,Nt LTP4位于WIPK的下游,与WIPK共同提高植物的抗病性。(6)WIPK可维持NtLTP4的蛋白稳定性通过Western Blot对NtLTP4的蛋白含量检测显示,在wipk突变体中NtLTP4的蛋白含量远低于对照,而在WIPK过表达株系中,NtLTP4的蛋白含量却高于对照,说明WIPK能够促进Nt LTP4蛋白的积累。cell-free半体内实验得到相同结果。而qRT-PCR检测发现,不同实验材料中NtLTP4的转录水平是基本一致的,表明WIPK促进NtLTP4的蛋白积累并非是调控NtLTP4的转录水平实现的。上述结果表明,WIPK能够在蛋白水平维持Nt LTP4的稳定性,从而提高植物的抗病性。(7)NPK1-NtMEK2-WIPK-Nt LTP4信号级联通路参与植物抗病防御过程为建立一条完整的烟草MAPK级联信号通路,我们利用酵母双杂交技术逐一验证了WIPK与烟草中已知的MAP2K/3K成员之间的互作关系,鉴定出WIPK能与MAPKK成员NtMEK2互作,进一步发现NtMEK2可以与烟草MAPKKK组分NPK1互作,并最终建立了NPK1-NtMEK2-WIPK-NtLTP4信号级联通路,这一级联通路可能是烟草中重要的抗病信号通路之一。综上所述,NtLTP4能够通过调控HKT1以及NHX1的转录增强烟草对Na~+的清除,减少植物因Na~+积累造成的毒害作用,从而提高盐胁迫的耐受性,并通过降低蒸腾速率和气孔开度增强对干旱胁迫的耐受性。另外,NtLTP4还能够通过增强活性氧的清除和降低气孔开度来提高转基因烟草对青枯菌的抗性。更深入地研究表明,Nt LTP4能够与MAPK级联组分WIPK互作。并且通过NPK1-NtMEK2-WIPK-NtLTP4级联信号通路稳定Nt LTP4蛋白来参与抗病防御过程,从而增强对非生物和生物胁迫的耐受性。本研究首次揭示了,烟草中MAPK级联通路与非特异性脂转移蛋白结合调控植物响应非生物和生物胁迫的分子机理,具有重要的创新意义。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
非特异性脂转移蛋白论文参考文献
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