地衣芽孢杆菌BM 2709的组学分析及应用研究

论文摘要

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）BM 2709是本室保存的一株高产碱性蛋白酶的重要工业菌株,产量可达到12000 U/mL±197 U/mL。但是该菌株存在碱性蛋白酶产酶周期较短的弊端,即在产酶后期阶段发酵产量大幅度下降。为了对该菌株进行遗传修饰,延长蛋白酶生产周期以及提高蛋白酶产量,对B.licheniformis BM 2709进行组学分析及应用研究。首先对B.licheniformis BM 2709这株重要的高产碱性蛋白酶工业菌株进行全基因组测序,得到了长4,341,076 bp,GC含量为45.85%的BM 2709基因组序列。预测到编码基因5166个,tRNA81个,rRNA80个。利用Ori-Finder和GC-skew预测BM 2709基因组复制起始位点OriC的信息。为该菌株的改造及优化提供了清晰的遗传背景。其次以测得的BM 2709基因组为参照,用高通量RNA-Seq测序技术对BM 2709发酵过程中的三个阶段（12 h,48 h,60 h）的全基因组转录情况进行分析。根据生物信息学分析数据FPKM值分析,得出48 h对比12 h的差异表达基因中上下调基因分别有267个和173个;60 h对比48 h的差异表达基因上下调基因分别有182个和16个。从这些差异表达基因中筛选并完成了 24个候选基因启动子的克隆,挖掘基因表达调控元件（诱导型启动子）。使用穿梭载体pWH1520,以克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因alk为报告基因,以不同的启动子区为表达调控元件,构建重组表达载体,并电转化至B.licheniformis Δ2709-BM 2709中,以空载体alk-pWH1520为对照。最终成功筛选获得两种新型诱导型启动子p707和p1004。发酵性能检测结果显示,启动子p707和p1004的启动强度是对照的8.3倍。由此可见,组学分析手段是遗传改造与元件挖掘等生物学中的有力工具。最后,为了研究外源基因在BM 2709基因组位置及整合方向对基因表达的影响,我们构建一个由启动子p43控制表达的kan基因表达盒（即p43Kan）,将其插入到距基因组OriC不同距离的几个位点,以穿梭质粒pWH1520为载体,将所有调控元件构建于该载体上,所述调控元件包括由pS启动子控制的筛选标记基因upp、由p43启动子控制的kan基因,以及上、下游同源臂序列,其电转化转入B.licheniformiΔupp-BM 2709中,通过同源重组方法进行整合置换,也许是破环了某些操纵子结构等原因,最终只得到同一位置不同方向的2株重组基因工程菌。对其进行抗生素抑菌实验,实验结果显示此位置基因方向不同的表达并没有明显影响,然而,此论点还需要更多的实验来证明是否具有普遍规律。

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摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 地衣芽孢杆菌测序的发展现状

1.1.1 测序技术发展概述

1.1.2 地衣芽孢杆菌基因组研究进展

1.1.3 地衣芽孢杆菌转录组学研究进展

1.2 芽孢杆菌的表达元件

1.2.1 芽孢杆菌的启动子

1.2.2 芽孢杆菌的σ因子

1.3 外源基因在染色体上表达研究现状

1.4 碱性蛋白酶生产菌

1.5 本课题的研究意义与内容

1.5.1 本课题的研究意义

1.5.2 本课题的研究内容

2 材料与方法

2.1 菌株和质粒

2.2 试剂与仪器

2.2.1 主要试剂和设备

2.2.2 主要培养基和抗生素

2.2.3 主要溶液与缓冲液

2.3 BM 2709的组学测序及分析

2.3.1 BM 2709的全基因组测序的样品制备

2.3.2 BM 2709基因组ori的预测与注释

2.3.3 BM 2709的产酶活力测定

2.3.4 BM 2709转录组测序样品的制备

2.3.5 RNA-Seq数据的生物信息学分析

2.4 候选启动子的克隆及表达载体的构建

2.4.1 候选诱导型启动子的克隆

2.4.2 报告基因的克隆及连接

2.4.3 B.licheniformis Δ2709-BM 2709感受态的制备及电转化

2.4.4 启动子表达蛋白酶的活力测定

2.5 Kan基因整合到地衣芽孢杆菌染色体情况对表达的影响

2.5.1 同源臂的设计与克隆

2.5.2 整合载体的构建

2.5.3 重组整合载体转入地衣芽孢杆菌Aupp-BM 2709

2.5.4 Kan在不同菌株中的表达

3 结果与讨论

3.1 BM 2709基因组测序数据及分析

3.1.1 BM 2709基因组的基本信息及ori的预测

3.1.2 BM 2709基因组的功能注释

3.2 BM2709碱性蛋白酶活力测定

3.2.1 生长曲线

3.2.2 碱性蛋白酶活力测定

3.3 BM 2709转录组测序

3.3.1 样品制备

3.3.2 RNA-Seq的生物信息学数据分析

3.4 新型诱导型启动子在BM 2709中的筛选

3.4.1 候选诱导型启动子区的克隆

3.4.2 重组表达载体的构建

3.4.3 重组表达载体在Δ2709-BM 2709中的表达活性

3.5 Kan基因整合到地衣芽孢杆菌染色体情况对表达的影响

3.5.1 同源臂的设计与克隆

3.5.2 整合载体的构建

3.5.3 重组整合载体转入地衣芽孢杆菌Δupp-BM 2709

3.5.4 Kan基因在Δupp-BM 2709 2区上的表达

4 结论

5 展望

6 参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

8 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 袁飞燕

导师: 路福平

关键词: 地衣芽孢杆菌,组学分析,诱导型启动子,碱性蛋白酶

来源: 天津科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 天津科技大学

分类号: Q933

DOI: 10.27359/d.cnki.gtqgu.2019.000425

总页数: 64

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地衣芽孢杆菌BM 2709的组学分析及应用研究

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