论文摘要
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BM 2709是本室保存的一株高产碱性蛋白酶的重要工业菌株,产量可达到12000 U/mL±197 U/mL。但是该菌株存在碱性蛋白酶产酶周期较短的弊端,即在产酶后期阶段发酵产量大幅度下降。为了对该菌株进行遗传修饰,延长蛋白酶生产周期以及提高蛋白酶产量,对B.licheniformis BM 2709进行组学分析及应用研究。首先对B.licheniformis BM 2709这株重要的高产碱性蛋白酶工业菌株进行全基因组测序,得到了长4,341,076 bp,GC含量为45.85%的BM 2709基因组序列。预测到编码基因5166个,tRNA81个,rRNA80个。利用Ori-Finder和GC-skew预测BM 2709基因组复制起始位点OriC的信息。为该菌株的改造及优化提供了清晰的遗传背景。其次以测得的BM 2709基因组为参照,用高通量RNA-Seq测序技术对BM 2709发酵过程中的三个阶段(12 h,48 h,60 h)的全基因组转录情况进行分析。根据生物信息学分析数据FPKM值分析,得出48 h对比12 h的差异表达基因中上下调基因分别有267个和173个;60 h对比48 h的差异表达基因上下调基因分别有182个和16个。从这些差异表达基因中筛选并完成了 24个候选基因启动子的克隆,挖掘基因表达调控元件(诱导型启动子)。使用穿梭载体pWH1520,以克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因alk为报告基因,以不同的启动子区为表达调控元件,构建重组表达载体,并电转化至B.licheniformis Δ2709-BM 2709中,以空载体alk-pWH1520为对照。最终成功筛选获得两种新型诱导型启动子p707和p1004。发酵性能检测结果显示,启动子p707和p1004的启动强度是对照的8.3倍。由此可见,组学分析手段是遗传改造与元件挖掘等生物学中的有力工具。最后,为了研究外源基因在BM 2709基因组位置及整合方向对基因表达的影响,我们构建一个由启动子p43控制表达的kan基因表达盒(即p43Kan),将其插入到距基因组OriC不同距离的几个位点,以穿梭质粒pWH1520为载体,将所有调控元件构建于该载体上,所述调控元件包括由pS启动子控制的筛选标记基因upp、由p43启动子控制的kan基因,以及上、下游同源臂序列,其电转化转入B.licheniformiΔupp-BM 2709中,通过同源重组方法进行整合置换,也许是破环了某些操纵子结构等原因,最终只得到同一位置不同方向的2株重组基因工程菌。对其进行抗生素抑菌实验,实验结果显示此位置基因方向不同的表达并没有明显影响,然而,此论点还需要更多的实验来证明是否具有普遍规律。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 袁飞燕
导师: 路福平
关键词: 地衣芽孢杆菌,组学分析,诱导型启动子,碱性蛋白酶
来源: 天津科技大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学,生物学
单位: 天津科技大学
分类号: Q933
DOI: 10.27359/d.cnki.gtqgu.2019.000425
总页数: 64
文件大小: 5193K
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