耐辐射异常球菌类分子伴侣蛋白DohL有序性及抗逆特性研究

论文摘要

耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）对氧化和冷冻等胁迫具有极强的耐受性,大量实验表明,以无规卷曲为二级结构的类分子伴侣蛋白LEA3参与到该菌的抗逆过程。前期研究表明,耐辐射异常球菌的类分子伴侣蛋白DohL属于LEA3蛋白家族,具有LEA3蛋白家族的特征,即含有8个由11个氨基酸组成的保守基序（motifs）,但与已报道的以无规卷曲为二级结构的LEA3蛋白完全不同,DohL蛋白能够形成以α-螺旋为主的天然有序的二级结构,该结构的有序性可能与其抗逆功能以及耐辐射异常球菌适应极端环境有关。本研究利用定点突变的方法降低DohL蛋白二级结构的有序性,通过测定圆二色谱,构建重组大肠杆菌菌株以及回补菌株,阐明DohL蛋白有序性与抗逆性的关系。主要研究进展如下:1.生物信息学分析发现,DohL蛋白N端序列（1-103位）为Deinococcus属保守序列,可能是其折叠成有序二级结构的关键区域。分析结果显示,亮氨酸（L）、色氨酸（W）和异亮氨酸（I）位点高度保守,且上述3种氨基酸能够促成蛋白形成有序二级结构。因此,本研究将61位的W和75位的I突变为脯氨酸（P）,该突变蛋白命名为WIP,将14-17位4个连续L、61位的W和75位的I突变为P,该突变蛋白命名为LWIP。软件预测突变后的2个蛋白有序性均降低,与DohL蛋白相比,有序性从高到低依次为DohL>WIP>LWIP。进一步利用圆二色谱技术测定DohL及突变蛋白二级结构的有序性,结果显示,3个蛋白的有序性分别为DohL:82.5%;WIP:62.2%;LWIP:51.4%,有序性与预测结果一致。2.构建重组大肠杆菌进行蛋白异源表达和表型分析,在氧化和冷冻胁迫条件下,表达突变蛋白的重组菌株比表达DohL蛋白的重组菌生存能力减弱。为进一步研究蛋白保护能力的变化,体外分别表达并纯化了DohL、WIP和LWIP 3个蛋白,同时测定DohL及2个突变蛋白在反复冻融和H2O2冲击条件下对LDH（乳酸脱氢酶）的保护作用。体外酶活实验表明,以上3种蛋白在胁迫条件下均能保护LDH的活性,具有类分子伴侣功能,保护作用强弱程度为DohL>WIP>LWIP,表明DohL蛋白保护作用随有序性降低而减弱。3.为验证DohL及2个突变蛋白的抗逆功能,构建了3个回补菌株Com-dohl、Com-wip、Com-lwip,并进行高浓度H2O2胁迫处理。实验结果显示,3个回补株均能够不同程度回补突变株耐受氧化胁迫的能力,且3个回补株的回补能力强弱为Com-dohl>Com-wip>Com-lwip,说明DohL蛋白的抗逆功能随有序性降低而减弱,进而导致菌株氧化胁迫抗性减弱。进一步测定菌株体内总抗氧化能力,测定在80 mM H2O2处理条件下野生型、突变株及回补株体内总抗氧化能力。结果表明,Com-wip和Com-lwip回补株相比Com-dohl回补株总抗氧化能力减弱,说明DohL蛋白有序性降低影响其抗逆功能,进而降低菌株氧化胁迫抗性,由此推测,高度保守位点上的氨基酸对DohL蛋白的抗逆功能具有重要作用。综上所述,耐辐射异常球菌DohL蛋白N端区域是该蛋白有序折叠的关键区域,DohL蛋白的抗逆功能随蛋白的有序性降低而减弱。研究结果说明耐辐射异常球菌中氨基酸的组成和比例有利于DohL蛋白结构的正确折叠和抗逆功能的发挥,可能是菌株适应极端环境的结果。

论文目录

摘要

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英文缩略表

第一章引言

1.1 蛋白有序/无序结构对功能的影响

1.1.1 蛋白有序结构对功能的影响

1.1.2 蛋白无序结构对功能的影响

1.2 LEA3 蛋白的研究进展

1.2.1 LEA蛋白概述

1.2.2 LEA蛋白的分类

1.2.3 LEA3 蛋白的结构与特征

1.2.4 LEA3 蛋白的功能

1.3 耐辐射异常球菌LEA蛋白研究进展

1.3.1 耐辐射异常球菌的基本特性

1.3.2 耐辐射异常球菌的抗性

1.3.3 耐辐射异常球菌LEA蛋白研究进展

1.4 本研究的目的和意义

1.4.1 研究目的

1.4.2 研究意义

1.5 技术路线

第二章 DohL及突变蛋白二级结构测定和功能研究

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和载体

2.1.2 培养基及主要试剂

2.1.3 主要仪器和试剂盒

2.1.4 细菌培养条件

2.2 方法

2.2.1 DohL及突变蛋白表达载体的构建

2.2.2 带有His标签融合蛋白的纯化

2.2.3 DohL及突变蛋白的二级结构测定

2.2.4 突变蛋白对大肠杆菌的影响

2.2.5 胁迫条件下乳酸脱氢酶（LDH）体外酶活测定

2.2.6 数据统计与分析

2.3 实验结果与分析

2.3.1 LEA3 蛋白序列同源性比对

2.3.2 DohL蛋白序列的分析

2.3.3 DohL蛋白N端序列突变位点的分析

2.3.4 点突变后蛋白有序性预测

2.3.5 表达载体及重组大肠杆菌的构建

2.3.6 DohL及突变蛋白的诱导表达与纯化

2.3.7 DohL及突变蛋白圆二色谱测定

2.3.8 过氧化氢对重组菌株的影响

2.3.9 反复冻融对重组菌株的影响

2.3.10 胁迫条件下DohL及突变蛋白对LDH酶活的保护作用

2.4 讨论

2.4.1 DohL突变位点分析

2.4.2 利用圆二色谱（CD）的方法测定蛋白的二级结构组成

2.4.3 DohL蛋白具有类分子伴侣的功能

第三章 DohL及突变蛋白WIP、LWIP功能分析

3.1 实验材料

3.1.1 菌株与质粒

3.1.2 培养基及主要试剂

3.1.3 主要仪器和设备

3.1.4 细菌培养条件

3.2 方法

3.2.1 细菌基因组及质粒提取

3.2.2 回补菌株的构建

3.2.3 耐辐射异常球菌质粒DNA转化

3.2.4 过氧化氢冲击后菌体生长测定

3.2.5 氧化胁迫条件下细胞内总抗氧化能力的测定

3.2.6 数据统计与分析

3.3 实验结果

3.3.1 回补突变株Δdohl重组质粒的构建

3.3.2 过氧化氢冲击后回补菌株的生长

3.3.3 胁迫条件下DohL及突变蛋白对细胞内总抗氧化能力的影响

3.4 讨论

第四章全文结论和创新点

4.1 全文结论

4.2 创新点

参考文献

致谢

作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 韩佳慧

导师: 王劲

关键词: 耐辐射异常球菌,类分子伴侣蛋白,蛋白有序性,非生物胁迫

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国农业科学院

基金: 国家自然科学基金,973 项目

分类号: Q936

总页数: 75

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