汪涛[1]2003年在《高分化胰腺癌多药耐药机制及靶向逆转的初步研究》文中提出目的：从多药耐药膜转运蛋白角度探讨高分化胰腺癌的耐药及调控机制；研究阻断体外培养的人高分化胰腺癌细胞株SW1990 IGF-ⅠR环路对多药耐药蛋白MRP表达的调节作用；评价IGF-ⅠR反义寡核苷酸转染对SW1990胰腺癌细胞株化疗敏感性的影响。方法：1、收集2000.4-2001.12月间四家医院的高分化胰腺癌手术切除病理标本26例，每个标本作连续切片，采用免疫组化SP法分别检测叁种多药耐药膜转运蛋白P-gp、MRP、LRP和IGF-ⅠR在胰腺癌组织和癌周组织中的表达，并作对比研究和相关性分析；2、采用自行设计的混合骨架IGF-ⅠR反义寡核苷酸，在非脂质体配方的FugeneTM6试剂介导下转染体外培养指数期生长的高分化胰腺癌细胞株SW1990，在转染后12、24、48、72、96小时连续观测IGF-ⅠR的水平变化，了解该序列IGF-ⅠR反义寡核苷酸对IGF-ⅠR表达的干预效果；同时，免疫组化、Wester-blot和RT-PCR检测转染对MRP在蛋白和mRNA水平表达的影响。3、在前面研究的基础上，采用不同剂量IGF-ⅠR反义寡核苷酸转染SW1990细胞，高效液相色谱仪比较转染前后5-氟脲嘧啶、丝裂霉素、Gemcitabine叁种不同结构化疗药物在细胞内蓄积浓度的变化；四氮唑蓝法、流式细胞仪和AO荧光染色检测转染联合化疗对胰腺癌细胞杀伤效应、细胞周期和凋亡易感性的影响。设立空白转染、DMEM假转染和IGF-ⅠR正义寡核苷酸转染作为对照组。结果：1.1、在高分化胰腺癌组织中，叁种多药耐药膜转运蛋白呈差异性表达：MRP最高（76.9%），P-gp次之（42.3%），LRP仅7.69%；而癌旁组织中，其表达亦不均衡：P-gp为34.6%，MRP7.69%，LRP未检测到表达；MRP在胰腺癌组织中的表达显着高于癌旁组织（P<0.05），但P-gp和LRP在胰腺癌和癌旁组织的表达则无明显差异（P＞0.05）；1.2、IGF-ⅠR在高分化胰腺癌组织中过度表达（73.1%），而在癌周基本不表达，相关分析显示，IGF-ⅠR与MRP在高分化胰腺癌组织中的表达明显正相<WP=10>关（rs=0.711，P<0.02）。2.1、体外培养的SW1990胰腺癌细胞呈典型的上皮样细胞生长特征，高表达IGF-ⅠR和MRP，免疫组化显示表达部位主要位于细胞的胞浆和胞膜，而部分胞核也可着色；2.2、IGF-ⅠR反义寡核苷酸转染后，SW1990胰腺癌细胞的IGF-ⅠR在蛋白和mRNA水平均明显下降，与对照组相比差异显着（P<0.05）：免疫组化显示IGF-ⅠR蛋白的阳性表达率在空白对照组为84.2%，转染后12、24、48、72、96小时分别为51.3%、22.6%、19.7%、38.8%和62.4%；RT-PCR显示各时相点IGF-ⅠR mRNA的表达量分别是空白对照组SW1990胰腺癌细胞表达水平的60.6%、34.2%、26.3%、45.8%和76.5%；2.3、IGF-ⅠR反义寡核苷酸能显着下调SW1990胰腺癌细胞MRP在蛋白和mRNA水平的表达（P<0.05），且与IGF-ⅠR变化规律一致：在转染12、24、48、72、96小时，MRP的表达量分别是空白转染组的83.6%、52.6%、39.3%、62.6%和91.8%（免疫组化SP）；58.3%、38.6%、29.5%、54.4%和81.1%（Western-blot）；52.6%、30.9%、25.5%、48.3%和76.8%(RT-PCR)。3.1、IGF-ⅠR反义寡核苷酸能明显提高化疗药物在SW1990胰腺癌细胞内的蓄积浓度，与对照组比较差异显着（P<0.05），蓄积浓度随反义寡核苷酸转染剂量的升高而增加；3.2、单纯IGF-ⅠR反义寡核苷酸转染对SW1990胰腺癌细胞有低水平的杀伤效应，而转染联合化疗对肿瘤细胞的杀伤作用明显增强，显着高于单纯化疗组和转染组（P<0.05），并分别随转染剂量和化疗给药浓度的增加而增强；3.3、流式细胞仪检测发现，给予单纯化疗干预或反义寡核苷酸转染，细胞周期均出现相同变化：G0/G1期细胞比例上升，G2、M期比例下降；而反义寡核苷酸转染联合化疗，则对SW1990的细胞周期抑制作用更为明显，无论与单纯反义寡核苷酸转染还是化疗相比，G0/G1期细胞比率均有显着上升；3.4、AO荧光染色显示，指数期生长的人胰腺癌细胞株SW1990自然凋亡率极低，仅为0.72%左右；在与化疗药物共同孵育后，出现典型的凋亡表现，凋亡率随化疗浓度升高而增加；在IGF-ⅠR反义寡核苷酸转染后，可出现SW1990细胞凋亡的显着增加（P<0.05），两者有量效关系；但在IGF-ⅠR反义寡核苷酸转染联合化疗时，细胞凋亡率只在较低转染水平和化疗浓度时呈上升趋势，而在较高的转染水平和化疗浓度时反而下降。结论：1、MRP是高分化胰腺癌组织中的“优势耐药蛋白”，在胰腺癌和癌周组织中的差异性表达提示它是肿瘤发生和行进过程中获得的一种新型耐药机制；2、IGF-ⅠR作为许多恶性肿瘤的共性标志物，是一种具有强大生物学活性的调节因子，在高分化胰腺癌组织中过度表达，可能参与多药耐药蛋白MRP的调控，是MRP的重要上游事件；3、体外培养的SW1990人胰腺癌细胞株同时高表达IGF-ⅠR和MRP，可作为研究原发性多药耐药的良好细胞模型；4、与前期的反义技术相比较，本研究所设计的IGF-ⅠR反义寡核苷酸对IGF-ⅠR的干预在起效时间、下调幅度和持续抑制上都有明显提高，这得益于IGF-ⅠR反义寡核苷酸靶序列的确立、活性基团的修饰和<WP=11>FugeneTM6试剂的辅助转染；5、IGF-ⅠR反义寡核苷酸可明显抑制胰腺癌细胞株SW1990的MRP表达，证实IGF-ⅠR对MRP的调控作用，即通过某种内在化机制在mRNA水平干扰MRP
黄明钜[2]2012年在《叶酸结合蛋白与卵巢癌多药耐药关系的研究》文中提出第一章卵巢癌多药耐药的研究进展卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统常见的肿瘤,它是妇科叁大恶性肿瘤之一,仅次于宫颈癌,宫体癌,居第叁位。卵巢癌约占卵巢恶性肿瘤的80%,目前主要的治疗手段是手术治疗和铂类为基础的联合化疗,患者5年生存率一直徘徊在20%-30%左右。大多数卵巢患者发现时已为中晚期,有的甚至已经失去了手术机会而给予非手术治疗,75%～80%的卵巢癌开始对化疗敏感,其余则表现为原发耐药,最终所有化疗患者至少80%出现耐药,而多药耐药机制极为复杂,目前还没完全清楚,卵巢癌多药耐药产生后治疗效果明显降低。预防和减少卵巢癌多药耐药的发生,以及对卵巢癌多药耐药的逆转治疗,是现阶段迫切需要解决的问题。国外有学者曾报道叶酸结合蛋白与卵巢癌的发生发展密切相关,在多药耐药中也扮演了重要的角色,具体机制暂未明确,需要我们进一步的研究探索。第二章卵巢恶性肿瘤组织叶酸结合蛋白表达检测及其临床意义目的：探讨卵巢恶性肿瘤组织中叶酸结合蛋白(FOLR1)的表达及其临床意义。方法：采用Western Blot检测80例卵巢恶性肿瘤组织、50例卵巢良性肿瘤组织及30例正常卵巢组织中的FOLR1表达情况,分析其与卵巢恶性肿瘤临床病理及多药耐药的相关性。结果：(1)FOLR1在正常卵巢组织,卵巢良性肿瘤和卵巢恶性肿瘤中的表达量依次增高(P<0.01)。(2)FOLR1在卵巢恶性肿瘤临床分期中Ⅰ～Ⅱ期的表达量低于Ⅲ～Ⅳ期,在组织分级高分化中的表达量低于中低分化(P<0.05)。(3)FOLR1在铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤中的表达量低于铂类药物敏感型(P<0.01)；其在治疗后仍进展肿瘤中的表达量低于缓解者(P<0.01)。(4)FOLR1在粘液性肿瘤中的表达量低于浆液性肿瘤(P<0.05),在有淋巴结和远处器官转移的卵巢恶性肿瘤中高于未有转移者(P<0.05),与患者的不同肿瘤病理分类、是否有大网膜转移和腹水量多少无明显相关(P>0.05)。(5)取FOLR1表达量界值为3.115时来判断卵巢肿瘤性质,ROC曲线的Youden指数最大,卵巢恶性肿瘤FOLR1表达量的高低与中位生存时间差别无明显相关(P>0.05),COX模型多因素分析显示FOLR1表达量不是影响患者生存预后的独立因素。结论：FOLR1在正常卵巢和卵巢良性肿瘤组织中的表达量低于卵巢恶性肿瘤,其可作为一种新型的卵巢恶性肿瘤早期诊断标志物。铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤中FOLR1呈低表达,在铂类药物敏感型卵巢恶性肿瘤中高表达,提示FOLR1与卵巢恶性肿瘤多药耐药相关,可作为判断卵巢恶性肿瘤多药耐药潜在标志物之一。第叁章FOLR1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定目的：构建携带叶酸结合蛋白基因(FOLR1)的慢病毒表达载体并进行表达鉴定。方法：PCR扩增FOLR1全长,克隆至pWPI载体质粒,重组阳性克隆行PCR和测序鉴定,重组质粒与其辅助质粒共同转染293T细胞包装病毒,病毒颗粒感染SKOV3细胞,流式分选,RT-PCR和Western Blot检测FOLR1的表达。结果：FOLR1正确克隆至pWPI载体质粒,PCR及测序证实重组表达载体构建成功,293T细胞成功包装慢病毒,pWPI-FOLR1慢病毒高效感染SKOV3细胞,RT-PCR和Western Blot检测出被感染后的SKOV3细胞中有FOLR1表达。结论：成功构建了FOLR1慢病毒表达载体,能高效感染SKOV3细胞,FOLR1基因转导后稳定表达,为下步探讨FOLR1在恶性卵巢肿瘤中的功能提供了实验基础。第四章FOLR1基因对顺铂作用卵巢癌上皮细胞生物学影响的体外实验研究目的：探索卵巢癌SKOV3细胞中FOLR1基因表达上调后对其生物学功能的影响以及作用途径。方法：MTT法测定叁组细胞(SKOV3、pWPI-SKOV3、 pWPI-FOLR1-SKOV3)的生长增值情况、顺铂对叁组细胞的IC50和不同顺铂浓度分别作用不同时间对叁组细胞的抑制率；流式细胞术检测不同顺铂浓度分别作用不同时间诱导叁组细胞的凋亡率；流式细胞术检测不同顺铂浓度作用48小时对叁组细胞周期分布的影响；高效液相检测同浓度顺铂作用叁组细胞48小时后细胞内顺铂的浓度。结果：实验组细胞(pWPI-FOLR1-SKOV3)与两组对照组相比较：(1)增殖速度明显升高、顺铂对其作用的IC50值降低。(2)顺铂对其生长抑制率增加(P<0.05),呈剂量-时间依赖关系,其对顺铂的敏感性增加。(3)顺铂更容易诱导其凋亡发生(P<0.05),呈时间-剂量依赖关系。(4)顺铂将其周期中的S期阻滞比例明显增加(P<0.05)。(5)细胞内的顺铂浓度增加近一倍。结论：FOLR1基因能增强卵巢癌SKOV3细胞的生长增殖能力；卵巢癌SKOV3细胞中FOLR1基因表达上调后顺铂对其抑制率增加,呈剂量-时间依赖关系,顺铂更容易诱导其凋亡发生,呈时间-剂量依赖关系,顺铂将其细胞周期中的S期阻滞明显增加,细胞内顺铂浓度升高。
刘媛媛[3]2007年在《卵巢癌多药耐药差异表达基因的验证》文中研究指明卵巢癌是最常见的女性恶性肿瘤之一,它的5年存活率低。其重要原因之一是肿瘤细胞的多药耐药现象。为了探讨卵巢上皮癌铂类耐药机理,本课题组前期采用FDD-PCR方法筛选卵巢上皮癌铂类耐药细胞和敏感细胞系中差异表达基因。结果显示①S4:Homosapiens mitochondrion②a17:5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferase reductase③actin-related protein 3 homolog mRNA④s16:rihosomal protein L35a mRNA⑤s20:replication protein A2 mRNA⑥s23:basictranscription factor 3(BTF3)mRNA⑦a5:thymosin,beta10(TMSB10)mRNA⑧a13:esterase D/formylglutathione hydrolase(ESD)⑨a26:mitochondrion基因片段为各种耐药细胞系共存且与亲本敏感细胞间有表达差异的基因。本实验进一步验证上述差异表达基因及P73、WWOX基因在卵巢癌耐药和敏感细胞(组织)的表达,并探讨其与卵巢癌多药耐药和卵巢癌临床病理之间的关系。最后采用RNA干扰阻断WWOX基因表达的体外实验研究。1、卵巢上皮癌铂类耐药细胞和敏感细胞系中差异基因的表达:同时运用RT-PCR和Northern blot方法检测上述9条差异表达基因在卵巢癌耐药和敏感细胞中的表达,结果Northern杂交仅仅得到的四条基因片段(a17、a32、s23、s16)的mRNA表达信息,没有检测到其余5条基因的表达情况。其中a17和a32仅仅在卵巢癌耐药细胞中表达,而S16、S23基因在卵巢癌某些敏感和耐药细胞中表达,两种方法验证的结果一致,暗示这些基因与肿瘤多药耐药有联系。根据他们的生物学特性,我们推测a17基因使药物代谢灭活增加导致了肿瘤的耐药;S16是通过导致细胞毒性损坏从而参与了多药耐药的发生。而因为没有关于a32和s23的生物学信息作为参考,我们尚不能推测其通过哪方面参与了多药耐药的发生。2、卵巢癌多药耐药差异表达基因在卵巢肿瘤组织中的表达及其临床意义:采用RT-PCR方法对卵巢肿瘤及对照组织中的上述基因表达进行了检测,旨在探讨这些差异表达基因的表达上调或下凋是否与临床多药耐药现象相吻合以及其临床意义。结果显示,S4、S16、S20、S23、a5、a26、a13、a32基因片段的高表达与卵巢癌化疗铂类耐药之间可能存在着某些联系。通过他们的生物学特征我们推测a13、a17通过参与药物代谢过程、a26通过抑制肿瘤细胞凋亡和改变线粒体膜渗透性、s16通过参与细胞毒性损坏、s20通过参与DNA损伤修复从而导致了多药耐药。而a5、a17、s4、a32、s23的功能尚未明确。且S4、S23、a5、a13、a32的高表达与卵巢癌的高转移和进展有关,其中我们推测a5高表达导致了肌动蛋白骨架的断裂导致了肿瘤细胞的转移。a17、a26、s16、s20与卵巢癌的临床病理特征无关,考虑这几种基因可以成为卵巢癌耐药的指标,却与进展无关。3、P73基因在卵巢肿瘤组织和卵巢上皮癌耐药细胞系中的表达及其临床意义:采用RT-PCR和northern blot方法检测P73基因在卵巢肿瘤组织中和铂类药物敏感和耐药的卵巢上皮癌细胞系中的表达变化,旨在探讨其与多药耐药的相关性和临床意义。结果显示P73的表达与卵巢癌的临床分期、组织学类型、病情进展程度及患者预后无关。P73基因在卵巢癌耐药细胞株中的表达为高,考虑是否同时存在着P53的突变,P53的突变异构体使P73的功能失活才导致的耐药。WWOX基因在卵巢肿瘤组织和卵巢上皮癌耐药细胞系中的表达及其临床意义:采用RT-PCR和northern blot方法检测WWOX基因在卵巢肿瘤组织中和铂类药物敏感和耐药的卵巢上皮癌细胞系中的表达变化,旨在探讨其与多药耐药的相关性和临床意义。RT-PCR结果显示WWOX基因在卵巢癌敏感细胞系A2780中表达丰度均高于耐药细胞系,认为WWOX不介导多药耐药。而WWOX在敏感细胞系SKOV3中不表达,但是相对应的耐药细胞表达却明显增高,这个结论却与之前的推论背道而驰。我们考虑与这两种细胞耐药性不同有关。Northern杂交的结果反应出WWOX基因在两种卵巢癌敏感细胞中表达丰度均大于耐药细胞株,暗示WWOX基因不诱导产生卵巢癌的多药耐药。WWOX在卵巢肿瘤及对照组织中的检测的结果显示WWOX在卵巢癌铂类耐药组织中的表达阳性率和表达量明显高于敏感组织,但是无统计学意义。本实验结果尚不支持WWOX作为一个抑癌基因的看法,但是提示WWOX基因的表达与卵巢癌的发生和进展有一定的关系,与国外部分观点符合。5、RNA干扰阻断WWOX基因表达的体外实验研究:本章采用针对WWOX基因的特异性小分子干扰RNA,转染进卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3/SB,从基因角度探索逆转卵巢癌细胞多药耐药的途径,以期恢复卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性。进一步探讨WWOX是否作为抑癌基因,并且也将为WWOX基因参与肿瘤的基因诊断及治疗提供新的思路。转染了WWOX的干扰片段后,SKOV3-SB的耐药下降,说明了WWOX很可能参与了耐药。功能实验结果提示WWOX通过增强肿瘤细胞自身修复,抵御化疗药物的损伤的作用及发挥类似药物输出泵的作用参与了耐药的发生。RNAi结果与前一章结果相反,考虑与实验误差有关,因为瞬时转染虽然可以抑制基因的表达,但对于干扰的长期有效性尚无实验结论,需要在后续实验中通过长效表达载体实验中做进一步验证。从结果来看,虽然本实验结果验证了与卵巢癌多药耐药有关的一些基因,并且也推测了他们参与多药耐药的途径,但是这仅仅作为一种假设。我们还要进一步系统研究这些耐药相关因子在耐药发生过程中所起的作用,以期在未来建立对耐药性状具有准确预测能力的计算机耐药模型,对于临床上耐药卵巢癌患者的个体化治疗方案的制订和实施,从根本上解决耐药问题,是非常必要的。
吴文娟[4]2014年在《卵巢上皮癌多药耐药的血清蛋白组学及代谢组学的初步研究》文中提出目的使用蛋白组学及代谢组学技术研究卵巢上皮癌多药耐药患者血清中差异表达的蛋白质及代谢化合物，寻找卵巢上皮癌多药耐药相关的诊断标志物及探索多药耐药的发病机制，进而找到逆转耐药治疗的靶点。方法收集临床上卵巢上皮癌（EOC）铂类耐药患者（PTR）、非耐药患者（PTS）、卵巢良性囊肿（BOC）及正常健康人（NC）四组血清各10例，每组的10例样品混合成一个pool，使用Human14亲和柱去除血清中高丰度蛋白后，收集去除高丰度蛋白后的组分用于蛋白组学的分析。本实验采用基于iTRAQ的蛋白组学技术分析不同分组血清差异蛋白表达谱，然后借助生物信息学方法筛选出有重要价值的蛋白质，采用Western blot及ELISA技术验证其表达的规律；此外，从蛋白组学分析的样本中抽取132例临床血清样本，包括PTR、PTS、BOC及NC四组，利用液质联用正离子模式检测四组血清代谢指纹谱。结果两次iTRAQ实验总共鉴定叁百多种蛋白，本研究对四组样本中两两进行对比分析，重点关注PTS及PTR间的差异表达，两组鉴定到62个有统计学意义的差异表达蛋白，使用生物信息学方法对这62个蛋白进行全面分析，并采用Western blot及ELISA技术对部分差异蛋白进行验证，表达趋势与质谱一致。代谢组学共检测到25800个代谢化合物，使用主成分分析（PCA）对数据降维后，并结合临床资料进行分析后得到6个对EOC多药耐药意义重大的差异代谢物。结论差异表达蛋白SERPINA1、FN1、ORM1及6个差异代谢物可对EOC化疗的疗效起到监测作用，可能参与EOC多药耐药的生物过程，是EOC多药耐药潜在的诊断标志物及逆转耐药治疗药物的作用靶点。
徐近[5]2005年在《胰腺癌中多药耐药基因MDR1的表达及其转录调控研究》文中研究表明肿瘤细胞对多种化疗药物产生的多药耐药性MDR(multidrugresistance)是临床化疗失败的主要原因，MDR的形成机制复杂，目前认为MDR1基因(multidrug resistance gene 1)表达异常是导致MDR产生的主要因子。在胰腺癌的临床诊治工作中，探讨胰腺癌中MDR1基因的表达及其转录调控有重要的研究价值。 临床研究 应用免疫组织化学法和RT-PCR技术分别从蛋白和基因水平检测MDR1基因在胰腺癌临床标本中的表达，并研究其与胰腺癌根治性术后生存时间之间的关系。研究结果表明，MDR1基因的蛋白表达产物P-gp在胰腺癌中的表达(阳性率79.3％)明显高于正常胰腺、癌旁组织和胰腺良性肿瘤；RT-PCR证实同样的结果；P-gp与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、TNM分期以及术前是否行介入化疗方面无显着性差异，但对根治性术后生存时间有一定的影响。 实验研究 通过RT-PCR检测MDR1基因在两株胰腺癌细胞株AsPC-1和BxPC-3中的表达，发现均有较高水平的基础表达。BxPC-3为原发癌细胞株，且其MDR1基因表达要略强于在AsPC-1细胞，因此选择BxPC-3细胞株作为进一步的研究对象。在体外通过逐步增加阿霉素(ADM)浓度筛选，成功构建了胰腺癌多药耐药细胞株BxPC-3／ADM，发现MDR1在诱导早期的耐药中起主导作用，在后期则和多药耐药相关蛋白(MRP)协同发挥作用；我们通过脂质体转染法将MDR1 cDNA转入BxPC-3细胞，成功获得了短时的MDR1高表达，稳定转染的单克隆表达尚有待进一步的研究。 利用RNA干扰技术，设计合成了针对MDR1基因的siRNA，并在其上下游分别引入BglⅡ和HindⅢ限制性酶切位点，通过双酶切连接反应将MDR1siRNA插入质粒载体Retro pSuper多克隆位点中的BglⅡ和HindⅢ之间，以此构建MDR1siRNA真核表达质粒RetropSuper-MDR1siRNA，应用RT-PCR行酶切鉴定，结果显示MDR1siRNA成功地载入了质粒。采用脂质体介导的方法将MDR1siRNA表达质粒转染胰腺癌细胞株BxPC-3，应用RT-PCR和Western blot方法检测BxPC-3细胞中MDR1在基因和蛋白水平的表达变化，研究结果显示MDR1siRNA表达质粒能显着抑制胰腺癌细胞BxPC-3中MDR1基因的表达，MDR1的蛋白表达水平亦受到明显抑制。 结论：研究结果表明，胰腺癌中MDR1呈高表达，并对根治术后生存时间有一定的影响。胰腺癌细胞株AsPC-1和BxPC-3存在MDR1的高表达；通过逐步增加ADM浓度，同样可以成功构建多药耐药细胞株BxPC-3／ADM；MDR1siRNA能有效地抑制胰腺癌BxPC-3细胞株MDR1的表达，siRNA技术是一有效调控MDR1基因表达的方法。
刘雯静[6]2011年在《胰腺癌特异性microRNAs的筛选及机制研究》文中研究说明背景：胰腺癌恶性程度极高,是消化系统第二大恶性肿瘤,在肿瘤死亡原性诱因中列第四位,是5年生存率最低的恶性肿瘤,而缺乏早期诊断手段和化疗耐药是导致胰腺癌高死亡率的主要原因。胰腺癌早期诊断率低,导致95%以上的胰腺癌患者在明确诊断时肿瘤已进入进展期,手术虽是根治胰腺癌的唯一方法,但根治性手术切除率仅15-20%；化疗是胰腺癌主要的辅助治疗手段,然而,肿瘤细胞对化疗药物产生的耐药性严重地影响了疗效。因此,提高早期胰腺癌的诊断率、扭转胰腺癌耐药,是提高胰腺癌的治疗效果和改善预后的关键。近年来,人们在研究中发现,microRNAs (miRNAs)是稳定存在于外周血中一种候选的肿瘤标志物,同时与肿瘤耐药密切相关。miRNAs是近年来发现的一系列内源性单链非编码的小RNAs分子,长度约22个核苷酸。其广泛分布于真核生物中。miRNAs常以基对相互原则与靶信使RNA (mRNA)的3’端的非翻译区完全或不完全配对,降解靶信使RNA或阻遏其转录后翻译。对组织分化、细胞分化、凋亡等正常的生理过程起到重要的调控作用。最近多项研究发现,若干miRNAs在各种肿瘤组织中的表达水平有不同程度上调或下调,这一现象初步揭示了肿瘤发生、进展、耐药与miRNAs表达量及种类之间存在相关性,为逆转现状,从根本上改善肿瘤预后提供新的途径。目的：在胰腺癌中,寻找具有潜在诊断价值的外周血特异性miRNAs,探索胰腺癌耐药相关的miRNAs,并通过调控miR-155在胰腺癌早期抑制]hMLH1表达改善胰腺癌预后。探索miRNAs对于胰腺癌早期诊断、治疗和指导预后的价值。方法：1、人胰腺癌组织和外周血特异性miRNAs表达谱的建立：①建立利用实时定量PCR(Real-time PCR)对临床血浆标本中循环miRNAs进行定量测定的技术平台；②采用基于qPCR(quantitative PCR)的TaqMan低密度阵列(TaqMan low density array, TLDA)技术,对健康个体、胰腺癌和胰腺炎患者血浆标本中的循环miRNAs进行初步分析,建立人胰腺癌、胰腺炎外周血特异性miRNAs表达谱；③在筛选结果中,选择5种在胰腺癌中呈差异表达的miRNAs进行验证(let-7b、miR-miR-363、miR-942、miR-645、miR-190b)。2、耐药相关miRNAs筛选：①cck-8法验证胰腺癌耐药(耐健泽、耐5-fu、耐阿霉素)细胞株的耐药性；②利用miRNAs芯片技术比较人胰腺癌耐药(耐健泽、耐5-fu、耐阿霉素)细胞株与非耐药细胞株的miRNA表达差异；③根据表达谱结果,应用real-time PCR对部分差异表达的miRNA进行验证。3、探索与胰腺癌早期事件相关的miR-155的作用机制及其指导治疗、改善预后的意义：①应用双荧光素酶报告基因及Western Blot的方法探索miR-155下游潜在靶基因hMLH1;②应用免疫组化方法研究其与胰腺癌临床预后的关系。结果：1、①建立了循环miRNAs定量检测方法；②在胰腺癌、胰腺炎、正常人的血浆中共检测到188种miRNAs。胰腺癌与胰腺炎相比,有6条显着上调、1条显着下调(P<0.01)；胰腺癌和胰腺炎相比,有10条显着上调,9条显着下调(P<0.01)；③验证结果显示,miR-942在胰腺癌与健康人外周血中表达呈显着差异(P=0.023)。2、①SW1990的阿霉素、氟尿嘧啶和吉西他滨的耐药株的耐药性分别是亲本株的12.57、133.68和438.96倍；②与亲本株相比,在SW1990/Gem细胞株中差异表达显着的miRNAs有58条,在SW1990/Adm细胞株中有59条,在SW1990/5-Fu细胞株中有47条。在SW1990/Gem、5-Fu两个耐药株中同时呈现显着差异的miRNAs14条,在SW1990/Gem、Adm两个耐药株中同时呈现显着差异的miRNAs22条,在SW1990/5-Fu、Adm两个耐药株中同时呈现显着差异的miRNAs 12条；其中3个耐药株中同时呈现显着差异的miRNAs7条;即miR-33a、33b、1285、486-5p、99b*、125a-3p、200c*在吉西他滨、氟尿嘧啶、阿霉素3株耐药株中的表达与亲本株相比差异具有显着性(P<0.05)；③文献检索胰腺癌耐药相关基因,及在其它肿瘤中调控上述基因的miRNAs,并与本研究的筛选结果进行比对。其中miR-34a、424、449a、497、451、21和miR-101在胰腺癌耐药株中呈差异表达；④应用实时荧光定量(Real Time-PCR)的方法对miR-486-5p、miR-125a-3p、miR-99b*、miR-1285进行验证,结果与芯片的结果一致,且均存在显着差异(P<0.05)3、①hMLH1是miR-155的靶基因；②miR-155通过与hMLH1的3’-UTR区不完全配对,抑制mRNA翻译；③hMLH1与胰腺癌的恶性进展及预后相关。结论：1、建立成熟的循环miRNAs定量检测方法；初步建立胰腺癌miRNAs表达谱；has-mir-942可能成为胰腺癌血清特异性肿瘤标记物,具有潜在的早期诊断价值。2、初步建立胰腺癌耐药相关miRNAs表达谱,其中miR-486-5p、miR-99b*、miR-125a-3p、miR-1285是潜在的与胰腺癌多药耐药相关的上游调控基因,验证其差异表达可能成为对耐药人群早期诊断的依据,进而通过指导个体化治疗改善预后；明确与其他肿瘤耐药相关的miRNAs (miR-34a、424、449a、497、451、21和miR-101)亦在胰腺癌miRNAs耐药谱中呈现差异表达,为进一步验证其在胰腺癌耐药机制中的作用提供线索。3、MiR-155通过下调靶基因hMLH1调控胰腺癌的恶性进展。
韦露薇[7]2017年在《RDX、ITGA5及其信号传导通路在卵巢癌多药耐药中的研究》文中指出第一章卵巢癌多药耐药中信号通路关键基因的筛选及其与临床预后的分析目的:综合运用生物信息学方法,结合前期研究结果,筛选与卵巢癌多药耐药相关的信号通路关键基因,并分析其与卵巢癌临床病理关系。方法:运用文本挖掘、通路富集和GO分析等生物信息学方法,分析潜在信号通路关键基因及其生物学功能等。采用荧光定量PCR方法检测卵巢37例卵巢癌敏感组织,34例耐药组织中筛查出的9个潜在基因m RNA表达情况;将122例卵巢癌组织蜡块制作成组织芯片,应用免疫组化检测筛选的4个差异基因在卵巢癌耐药及敏感组织中的表达,并分析其与耐药、临床病理及预后相关性。QRT-PCR和WB验证分次顺铂干预的移植瘤组织中RDX和ITGA5的m RNA和蛋白表达。结果:(1)运用Pathway通路富集和GO分析等生物信息学方法并结合前期研究结果,筛选出ezrin(EZR)、radixin(RDX)、moesin(MSN)、isozyme1(PDK1)、ras homolog family member A(RHOA)、SDC1、SDC2、ITGA5、FN1等9个潜在与卵巢癌多药耐药相关的基因;(2)QRT-PCR验证9个潜在耐药相关基因其在卵巢癌组织中m RNA表达,相对敏感组织,在耐药组织中EZR、FN1、MSN、PDK1、RHOA、SDC1基因则分别下调0.65倍、0.62倍、上调1.09倍、1.69倍、1.42倍和1.09倍,差异无统计学意义(P>0.05);ITGA5、SDC2和RDX分别上调2.03倍、2.38倍和5.76倍,差异有统计学意义(P<0.05);(3)免疫组化检测FN1、ITGA5、SDC2和RDX在卵巢癌组织中蛋白表达,其中FN1、ITGA5、RDX和SDC2在铂类药物耐药型卵巢癌中的表达量高于铂类药物敏感型,除SDC2蛋白表达量两组差异不显着(P>0.05),RDX、ITGA5、FN1差异显着(P﹤0.05);(4)在卵巢癌中,RDX蛋白的表达与FIGO临床分期、术后残余灶有关(P﹤0.05);ITGA5蛋白的表达与术后残余灶有关(P﹤0.05);SDC2、FN1的表达量与年龄、FIGO分期、组织学类型、细胞分化、肿瘤残余灶大小、有无淋巴结、腹腔转移均无关(P>0.05);(5)经Kaplan-Meier生存曲线和Cox模型分析,RDX是影响卵巢患者生存预后的独立因素;ITGA5阳性表达患者较其阴性患者总生存率明显下降(P=0.001),但不是影响生存预后的独立因素。结论:我们通过整合生物信息学、前期蛋白质组学及代谢组学筛选出了与卵巢上皮癌耐药相关重要信号传导通路,并通过QRT-PCR、免疫组化、蛋白印迹等方法进一步验证了这些重要信号传导通路上的关键基因与卵巢癌多药耐药及临床病理的关系。RDX、SDC2、ITGA5和FN1可能是卵巢癌多药耐药的信号通路调控基因,同时RDX、ITGA5在铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤中表达显着高于铂类药物敏感型卵巢恶性肿瘤,且与患者生存预后有相关性,在肿瘤的生长及肿瘤耐药产生过程中发挥重要角色。后期需要进一步研究RDX、ITGA5参与卵巢癌耐药发生的相关分子机制。第二章RDX、ITGA5对卵巢癌SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞多药耐药的生物功能研究目的:构建下调RDX、ITGA5的慢病毒载体并进行鉴定。研究卵巢癌SKOV3耐顺铂细胞(SKOV3-GFP/DDPⅡ)中RDX、ITGA5基因表达下调后,细胞生物学功能的改变。方法:(1)筛选干扰效率最高的RDX、ITGA5 sh RNA病毒颗粒,感染SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞,QRT-PCR和WB检测感染后细胞中RDX、ITGA5的表达。(2)CCK8法测定细胞的生长、增殖情况、及DDP作用后细胞的半数抑制率的变化;(3)流式细胞术检测DDP作用48小后对细胞周期分布的变化;(4)Transwell法检测细胞侵袭、迁移能力的变化。结果:筛选干扰效率最高的RDX、ITGA5慢病毒载体,感染SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞后,RDX、ITGA5表达明显下调。实验组细胞(SKOV3-GFP/DDPⅡ-RDXi、SKOV3-GFP/DDPⅡ-ITGA5i)与对照组、空白组相比较:(1)顺铂的IC50值明显降低、生长速度明显下降(P<0.05),对顺铂的敏感性增加。(2)顺铂诱导后细胞阻滞于G2/M期,其比例明显增加(P<0.05)。(3)RDX、ITGA5干扰后SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞侵袭、迁移能力均明显下降(P<0.05)。结论:通过下调RDX、ITGA5表达,能显着降低卵巢癌SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞的生长、侵袭和迁移能力,增加对顺铂的敏感性增加;RDX、ITGA5基因下调后顺铂将其细胞阻滞在G2/M期。第叁章RDX、ITGA5对卵巢癌SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞多药耐药中凋亡和信号通路的影响及机制研究目的:探索RDX、ITGA5基因下调后在顺铂耐药的卵巢癌SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞中凋亡的变化,以及RAS-PI3K-AKT1信号通路的影响,探索RDX、ITGA5参与卵巢癌耐药的可能途径。方法:流式细胞术检测不同顺铂浓度分别作用48小时诱导四组细胞的凋亡率;使用Path Scan?Antibody Array Kit、免疫蛋白印迹(Western blot)方法检测四组细胞(SKOV3-GFP/DDPⅡ、SKOV3-GFP/DDPⅡ-NC、SKOV3-GFP/DDPⅡ-RDXi,SKOV3-GFP/DDPⅡ-ITGA5i)信号通路关键蛋白的表达和变化。结果:(1)四组细胞顺铂1μg/ml诱导叁组细胞48小时后,实验组细胞(SKOV3-GFP/DDPⅡ-RDXi、SKOV3-GFP/DDPⅡ-ITGA5i)与两组对照组相比较凋亡明显增加;(2)与NC组相比,SKOV3-GFP/DDPⅡ-RDXi细胞Smad2和TAK1蛋白表达水平显着降低;P44/42 MAPK(ERK1/2)、Akt、Bad、HSP27、p53、SAPK/JNK、PARP、Caspase-3、Caspase-7、Chk1、Ik Ba、EGFR/Erb B1、HER2/Erb B2、HER3/Erb B3、FGFR1、FGFR3、FGFR4、Ins R、Trk A/NTRK1、Trk B/NTRK2、Met/HGFR、Ron/MST1R、Ret、c-Kit/SCFR、Akt/PKB/Rac和蛋白表达水平显着上调(P<0.05);(3)与NC组相比,SKOV3-GFP/DDPⅡ-ITGA5i细胞EGFR/Erb B1、HER2/Erb B2、FGFR1、Trk A/NTRK1、ALK、P44/42 MAPK(ERK1/2)、Akt、Bad、HSP27、p53、p38 MAPK、SAPK/JNK、PARP、Caspase-3、Caspase-7、Ik Ba、Chk1、Ik Ba、Eph B4和Akt/PKB/Rac蛋白表达水平显着上调;IGF-IR蛋白表达水平显着下调(P<0.05);(4)RAS-PI3K-AKT1信号通路中,SKOV3-GFP/DDPⅡ-RDXi细胞的AKT、MEK1/2、Erk1/2蛋白表达显着上调,Ras表达量下调。结论:RDX、ITGA5基因下调能在SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞中增强顺铂诱导产生的凋亡。RDX下调通过激活抑癌基因P53活性,激活PI3K/Akt通路、Ras/Raf/MEK/ERK信号通路,从而增加耐药细胞对顺铂的敏感性,为卵巢癌MDR中信号转导通路机制研究提供新的思路。
申薇[8]2013年在《诺斯卡品逆转卵巢癌细胞顺铂耐药的作用机制研究》文中进行了进一步梳理卵巢癌（Ovarian cancer）是妇科最常见的恶性肿瘤，具有易复发转移、易产生多药耐药(Multidrug resistance, MDR)的生物学特性。化疗是卵巢癌肿瘤减灭术基础上的一种重要的治疗手段，其中铂类化合物如顺铂(Cisplatin, DDP)，是众多药物中最经典有效的，但肿瘤的多药耐药性增加了化疗失败率。MDR是指一种药物作用于肿瘤细胞产生耐药性后，该肿瘤对未接触过的其它不同作用机理的抗肿瘤药物也产生了交叉耐药。引起MDR的原因有许多，其中凋亡调控基因的异常表达是导致卵巢癌多药耐药的主要途径之一，研究发现许多信号通路和转录因子通过提高细胞的增殖和生存能力而降低对顺铂的敏感性，其中促凋亡因子如野生型P53、Bax、Caspase-3等和抑制凋亡因子如XIAP、Survivin、Bcl-2等的多方面因素介导，进一步导致抗肿瘤药物诱导凋亡失败。其中XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin作为多药耐药相关蛋白，参与多种肿瘤多药耐药的形成。微管抑制剂诺斯卡品(Noscapine，NOS)是一种苄基异喹啉类生物碱，在过去几十年中作为镇咳药广泛应用。近年来发现诺斯卡品及其衍生物有抗肿瘤作用。有研究表明诺斯卡品可以抑制微管动态不稳定性，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡，对神经胶质瘤、髓细胞性白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌等都有抑制作用。其作用机制尚不完全清楚，可能涉及到了多种途径，包括抑制有丝分裂G2/M期及JNK途径激活、P53参与、caspase级联反应、线粒体途径、NF-κB信号通路调节等。一些研究还表明当紫杉醇等微管抑制剂产生耐药作用时，诺斯卡品及其衍生物仍可起到一定的抗肿瘤作用，且具有毒副作用小，无明显交叉耐药的特点，提示诺斯卡品可能具有逆转肿瘤耐药的作用。目前，有关诺斯卡品对卵巢癌顺铂耐药SKOV3/DDP细胞的逆转耐药作用尚未见报道，有待于进一步研究。本实验利用顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞产生耐药的方法建立卵巢癌顺铂耐药SKOV3/DDP细胞株，通过体外实验观察XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin在诺斯卡品作用后的表达情况，探讨诺斯卡品对卵巢癌顺铂耐药的逆转作用及机制；体内实验利用裸鼠皮下移植卵巢癌顺铂耐药细胞，建立裸鼠移植瘤模型，通过给予不同浓度的诺斯卡品及诺斯卡品与顺铂联合剂量，观察裸鼠移植瘤体积及组织形态学变化，同时分析诺斯卡品对裸鼠卵巢癌顺铂耐药移植瘤组织中XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白表达的影响，进一步利用多项实验方法检测四种蛋白在正常卵巢组织、交界性卵巢肿瘤组织和上皮性卵巢癌组织中的表达，并分析与卵巢癌临床病理指标的关系。期望通过探讨诺斯卡品逆转人卵巢癌SKOV3/DDP细胞多药耐药的作用机制及临床相关性，为卵巢癌顺铂耐药逆转的研究提供实验依据、开辟新的思路。方法：1卵巢癌耐药细胞系SKOV3/DDP的建立及其耐药蛋白的表达采用顺铂持续接触浓度递增的方法对SKOV3诱导，取对数生长期SKOV3细胞，于含有0.02mg/L顺铂的培养基中培养，逐步提高顺铂的诱导浓度，直到细胞能在含0.2mg/L顺铂的培养基中稳定生长，历时8个月，将其命名为SKOV3/DDP细胞。顺铂作用于SKOV3、SKOV3/DDP细胞后，采用MTT法检测两种细胞的生长抑制率，计算半数抑制浓度（IC50），从而计算耐药指数（RI）；通过流式细胞术方法（flow cytometry, FCM）检测两种细胞的细胞凋亡率及细胞中XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表达；Realtime-PCR方法检测细胞中XIAP、Survivin mRNA的表达。2诺斯卡品逆转SKOV3/DDP细胞对顺铂耐药作用及机制应用MTT方法检测诺斯卡品、顺铂及诺斯卡品与顺铂联合作用对SKOV3/DDP细胞的生长抑制率；应用FCM方法检测诺斯卡品、顺铂及诺斯卡品与顺铂联合作用对SKOV3/DDP细胞凋亡及细胞周期的影响，同时检测细胞中XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表达；应用Realtime-PCR方法检测诺斯卡品、顺铂及诺斯卡品与顺铂联合作用SKOV3/DDP细胞后，细胞中XIAP、Survivin mRNA的表达。3诺斯卡品逆转卵巢癌顺铂耐药裸鼠移植瘤作用研究将BALB/c nu/nu裸鼠（3-4周龄，雌性，16~20g）按体重随机分为10组，每组6只。其中裸鼠SKOV3/DDP和SKOV3细胞移植瘤分别为7组和3组。裸鼠皮下注射细胞，待第2周肿瘤界限清楚后，开始用药。诺斯卡品，腹腔注射，1次/3天，共注射7次；顺铂，腹腔注射，1次/3天，共注射7次。裸鼠SKOV3/DDP细胞移植瘤分组：实验组分别为20和40mg/kg诺斯卡品用药组，3和6mg/kg顺铂用药组，3mg/kg顺铂与20和40mg/kg诺斯卡品联合用药组；对照组给予生理盐水。裸鼠SKOV3细胞移植瘤分组：实验组分别为3和6mg/kg顺铂组；对照组给予生理盐水。实验期间，每隔日测量一次裸鼠移植瘤的长、短径及其裸鼠体重。停药3天后，采用拉颈法处死裸鼠，并剥离移植瘤称重，计算移植瘤体积和重量及其抑制率。采用FCM方法检测裸鼠移植瘤组织细胞的凋亡率、细胞周期及XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表达；免疫组织化学方法（immunohistochemistry, IHC）检测裸鼠移植瘤组织细胞中XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表达。4耐药相关蛋白在卵巢癌组织中的表达及其意义收集河北医科大学第四医院卵巢上皮性癌共80例，交界性肿瘤20例，正常卵巢组织15例。手术经病理结果证实的80例上皮性癌，其中浆液性囊腺癌41例，黏液性囊腺癌28例，子宫内膜样癌11例。80例标本中I、II期者38例，III、Ⅳ期者42例；高分化者39例，中分化26例，低分化15例；有淋巴转移者39例，无淋巴转移者41例。采用FCM和IHC检测上皮性癌，交界性肿瘤，正常卵巢组织中XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表达，分析XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin表达与卵巢癌临床病理特征的关系及及蛋白之间的关系。结果：1卵巢癌耐药细胞系SKOV3/DDP的建立及其耐药蛋白的表达通过细胞培养，镜下分析结果显示，与SKOV3细胞相比，SKOV3/DDP细胞体积变大呈多角形，神经元细胞样生长，形态更不规则，细胞质可见颗粒状囊泡，边界模糊，折光性差。MTT结果显示，顺铂作用SKOV3、SKOV3/DDP细胞24、48、72h，SKOV3细胞的IC50值为11.19mg/L、5.94mg/L、3.03mg/L，SKOV3/DDP细胞的IC50值为27.24mg/L、17.52mg/L、11.46mg/L，由IC50比较得SKOV3/DDP细胞24、48、72h的耐药指数RI为2.43、2.95、3.78。FCM结果显示，SKOV3/DDP细胞中的XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白的表达量较SKOV3细胞显着增高（P<0.01）， Caspase-3蛋白表达量较SKOV3细胞显着降低（P<0.01）。顺铂作用SKOV3、SKOV3/DDP细胞48h，SKOV3/DDP细胞凋亡率显着低于SKOV3细胞（P<0.01）。Realtime-PCR结果显示，SKOV3、SKOV3/DDP细胞中XIAP mRNA的表达水平无明显差异(P>0.05)；SKOV3/DDP细胞中Survivin mRNA的表达显着高于SKOV3细胞，两者比较有显着差异(P<0.05)。2诺斯卡品逆转SKOV3/DDP细胞对顺铂耐药作用及机制MTT结果显示，诺斯卡品作用于SKOV3/DDP细胞24h、48h、72h，SKOV3/DDP细胞的IC50值分别为52.84μmol/L，28.04μmol/L，21.58μmol/L，诺斯卡品对SKOV3/DDP细胞的生长有明显的抑制作用，且存在着浓度和时间依赖效应(P<0.05)。诺斯卡品+顺铂联合组与单独应用诺斯卡品及顺铂组相比，对SKOV3/DDP细胞生长抑制率显着增高(P<0.05)。FCM结果显示，诺斯卡品+顺铂联合组与单独应用诺斯卡品及顺铂组相比，SKOV3/DDP细胞凋亡率显着增高(P<0.05)；G0/G1期细胞比例减少，G2/M期细胞比例显着增加(P<0.05)。诺斯卡品+顺铂联合组与单独应用顺铂组相比，SKOV3/DDP细胞中XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白表达量均显着降低(P<0.05)，而Caspase-3蛋白表达量显着增高(P<0.05)。Realtime-PCR结果显示，诺斯卡品+顺铂联合组与单独应用顺铂组相比，SKOV3/DDP细胞中XIAP、Survivin mRNA表达量显着降低(P<0.05)。3诺斯卡品逆转卵巢癌顺铂耐药裸鼠移植瘤作用研究成功建立SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤模型，移植瘤100%成瘤。DDP作用组，与SKOV3细胞裸鼠移植瘤相比， SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤体积及重量显着增加（P<0.05)。诺斯卡品+顺铂联合组与单独应用诺斯卡品或顺铂组相比，SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤的体积及重量显着降低(P<0.05)。FCM结果显示，诺斯卡品+顺铂联合组与单独应用诺斯卡品及顺铂组相比，SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤细胞凋亡率显着增加(P<0.05)，细胞中G0/G1期细胞比例显着减少，G2/M期细胞比例显着增加(P<0.05)。诺斯卡品+顺铂联合作用组与单独应用顺铂组相比，SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤细胞中XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白表达量均显着降低(P<0.05)，Caspase-3蛋白表达量显着增高(P<0.05)。IHC结果显示，诺斯卡品+顺铂联合作用组与单独应用顺铂组相比，SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤细胞中XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白阳性表达率均显着降低(P<0.05)，Caspase-3蛋白的阳性表达率显着增高(P<0.05)。4耐药相关蛋白在卵巢癌组织中的表达及其意义IHC结果显示：XIAP以细胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性；Bcl-2以细胞浆和细胞膜中出现棕黄色颗粒为阳性；Caspase-3、Survivn以细胞核和细胞浆内有棕黄色颗粒为阳性。卵巢癌组织中XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白阳性表达率（78.8%、48.8%和55.0%）和交界性卵巢肿瘤组织（60.0%、30.0%和25.0%）显着高于正常卵巢组织（0、0和6.7%）（P<0.01）。正常卵巢癌组织中Caspase-3蛋白阳性表达率（93.3%）显着高于交界性卵巢肿瘤组织（55.0%）和卵巢癌组织（43.8%）(P<0.01)。FCM及IHC结果显示，XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白在卵巢浆液性囊腺癌、黏液性囊腺癌及子宫内膜样癌组织中阳性率及表达量无显着差异(P>0.05)；高、中、低分化组四种蛋白阳性率与表达量逐渐升高，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。淋巴结转移组与淋巴无转移组相比，Survivin和Bcl-2蛋白阳性率与表达量显着增高(P<0.01)，XIAP和Caspase-3蛋白阳性率与表达量无显着差异(P>0.05)。临床III～Ⅳ期组与I～II期组相比，XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白阳性率与表达量显着增高(P<0.01)，Caspase-3蛋白阳性率与表达量显着降低(P<0.01)。卵巢癌组织中XIAP与Caspase-3蛋白，Survivin与Bcl-2蛋白的表达具有相关性（P<0.01; P<0.01），XIAP与Bcl-2蛋白，Survivin与Caspase-3蛋白表达无相关性（P>0.05; P>0.05）。结论：1采用顺铂接触浓度不断递增的诱导方法，建立卵巢癌耐药SKOV3/DDP细胞。顺铂作用SKOV3和SKOV3/DDP细胞后，SKOV3/DDP细胞的抑制率和凋亡率均低于SKOV3细胞，表明SKOV3/DDP细胞产生顺铂耐药。与SKOV3细胞相比，SKOV3/DDP细胞中XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白及Survivin mRNA高表达，Caspase-3蛋白低表达，表明这些蛋白及基因均参与了卵巢癌耐药。2初次探讨了诺斯卡品逆转卵巢癌顺铂耐药机制，国内外尚未见相关报道。诺斯卡品能有效抑制SKOV3/DDP细胞的增殖，具有时间及浓度依赖性。低剂量诺斯卡品联合顺铂提高了顺铂对SKOV3/DDP细胞的敏感性，并可诱导细胞凋亡，表明诺斯卡品对SKOV3/DDP细胞具有耐药逆转作用，其机制与下调XIAP、Survivin mRNA及XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白表达，上调Caspase-3蛋白表达有关。3建立了SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤模型。诺斯卡品与顺铂联合组，SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤的生长抑制率显着高于诺斯卡品或顺铂组，表明诺斯卡品可以逆转SKOV3/DDP细胞裸鼠移植瘤对顺铂的耐药，其逆转耐药机制与下调XIAP、Bcl-2和Survivin蛋白和上调Caspase-3蛋白在裸鼠移植瘤组织中的表达有关，证明这些蛋白参与了卵巢癌顺铂耐药。4在卵巢正常组织、交界性卵巢肿瘤和上皮性卵巢癌组织中，XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白的阳性表达率逐渐增高，Caspase-3蛋白的阳性表达率逐渐降低。XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表达与卵巢癌临床分期及恶性程度密切相关。XIAP与Caspase-3蛋白和Survivin与Bcl-2蛋白在上皮性卵巢癌组织中表达具有相关性。卵巢癌顺铂耐药裸鼠移植瘤组织中四种蛋白的表达与在患者卵巢癌组织中存在相似性，表明诺斯卡品在人和裸鼠卵巢癌耐药逆转中可能具有相同作用。
参考文献：
[1]. 高分化胰腺癌多药耐药机制及靶向逆转的初步研究[D]. 汪涛. 第叁军医大学. 2003
[2]. 叶酸结合蛋白与卵巢癌多药耐药关系的研究[D]. 黄明钜. 广西医科大学. 2012
[3]. 卵巢癌多药耐药差异表达基因的验证[D]. 刘媛媛. 广西医科大学. 2007
[4]. 卵巢上皮癌多药耐药的血清蛋白组学及代谢组学的初步研究[D]. 吴文娟. 广西医科大学. 2014
[5]. 胰腺癌中多药耐药基因MDR1的表达及其转录调控研究[D]. 徐近. 复旦大学. 2005
[6]. 胰腺癌特异性microRNAs的筛选及机制研究[D]. 刘雯静. 北京协和医学院. 2011
[7]. RDX、ITGA5及其信号传导通路在卵巢癌多药耐药中的研究[D]. 韦露薇. 广西医科大学. 2017
[8]. 诺斯卡品逆转卵巢癌细胞顺铂耐药的作用机制研究[D]. 申薇. 河北医科大学. 2013
标签：肿瘤学论文; 肿瘤论文; 化疗药物论文; 胰腺癌论文; 细胞分化论文; 卵巢恶性肿瘤论文; 基因合成论文; 细胞转染论文; 放化疗论文; 顺铂论文; 癌症论文; 寡核苷酸论文;