细胞自噬调控细胞质内蛋白稳态和脂质代谢

论文摘要

细胞自噬既可以清除细胞内“废物”,也为细胞更新和稳态维持提供了物质和能量保障。蛋白聚集体自噬和脂滴自噬的异常与多种人类疾病相关,但其作用机制仍不清楚。本篇论文围绕两种选择性自噬展开,分为两个部分。论文第一部分揭示了线粒体蛋白运输调控胞质中蛋白质稳态的机制。我们发现,线粒体外膜蛋白运输复合物的重要组成成份Tom40表达水平下降后,胞质中蛋白酶体功能下降,自噬途径出现异常。细胞内出现大量被自噬膜结构包裹的蛋白聚集体。在神经系统中,Tom40表达水平的减少也会引起泛素化的蛋白聚集体在神经细胞中累积,并导致神经系统的退化和损伤。进一步研究发现,Tom40表达水平的减少还会加剧亨廷顿疾病致病蛋白Htt polyQ的积累,加重神经损伤,暗示线粒体蛋白运输系统的异常会进一步加剧胞内错误折叠蛋白的累积和毒性。线粒体损伤和蛋白聚集体的累积是神经退行性疾病的两大特征,本研究揭示了二者之间的关系,加深了对神经退行性疾病致病机制理解。在本论文第二部分的工作中,我们发现两个果蝇突变体的眼中积累了大量脂滴,暗示其可能参与调控细胞中的脂质代谢。定位克隆发现一个新的果蝇基因CG5745在这两个突变体中发生了突变。CG5745编码一个进化上保守的含有Tre2-Bub2-Cdc16（TBC）结构域的蛋白。我们根据其哺乳动物同源基因TBC1D22A和TBC1D22B的名称将其命名为dTBC22。含有TBC结构域的蛋白通常作为GTPase激活蛋白（GAP）催化Rab蛋白水解GTP。我们发现dTBC22的GAP活性对其调控脂质稳态是十分重要的。表达显性负性突变体（dominant negative）dTBC22RQ导致脂滴在多组织中积累。进一步实验发现dTBC22与Rab40相互作用,发挥GAP活性促进Rab40水解GTP。与dTBC22突变相似,过表达模拟GTP结合形式的Rab40突变体Rab40Q75L也会导致多种组织中脂滴的积累。Rab40敲除后,果蝇体重增加,耐饥饿能力增强。在果蝇脂肪体中,Rab40敲除抑制饥饿导致的脂滴减小。Rab40与脂滴上甘油三酯脂肪酶Brummer（Bmm）结合。在正常饲喂条件下,野生型的果蝇脂肪体中Bmm蛋白水平较低,Rab40缺失果蝇的脂肪体中Bmm蛋白水平升高,暗示Rab40在营养充足条件下抑制Bmm水平。饥饿后,野生型的果蝇脂肪体中Bmm蛋白水平升高,此时Rab40缺失果蝇脂肪体中的Bmm蛋白水平与野生型相当,暗示饥饿解除了Rab40对Bmm水平的抑制。与此对应,我们发现Rab40在细胞中广泛分布,营养充足时在脂滴上富集。但在饥饿条件下,脂滴上的Rab40消失,高尔基体上出现Rab40的富集。进一步研究还发现,敲除Rab40会减少脂肪体中饥饿诱导的细胞自噬囊泡分子标记Atg8a和溶酶体膜蛋白LAMP在脂滴周围的聚集,暗示脂滴自噬出现异常。在脂肪体中敲减LAMP或Atg8a的表达均抑制饥饿诱导的脂滴减少,暗示Rab40可能通过调控脂滴的自噬调控胞内脂代谢。基于以上结果,我们得出以下模型:营养充足时,Rab40在脂滴上富集,与Bmm结合,降低Bmm水平。饥饿时,Rab40离开脂滴,解除对Bmm的抑制,并促进脂滴自噬,从而实现脂肪体中脂质的调度和使用。dTBC22促进Rab40水解GTP,使得Rab40可以在GTP和GDP结合形式之间循环互换,维持其正常功能。dTBC22的缺失或Rab40的过表达均打破了Rab40循环,产生显性负效应,抑制Rab40活性,破坏了脂质稳态。这一研究发现了两个调控脂质代谢的新分子,加深了人们对脂解和脂滴自噬过程的认识。

论文目录

致谢

摘要

Abstract

缩略词表

1 绪论

1.1 细胞自噬

1.2 细胞自噬相关的生理和病理

1.3 果蝇在自噬研究中的应用

1.4 线粒体蛋白运输系统

1.5 脂代谢与人类疾病

1.6 总结

2 线粒体蛋白运输系统调控胞质内蛋白稳态和神经系统完整性

2.1 前言

2.2 实验材料和方法

2.2.1 仪器设备

2.2.2 果蝇品系与饲养

2.2.3 果蝇幼虫饥饿处理

2.2.4 果蝇爬行力测试

2.2.5 突变体果蝇的制作

2.2.6 FRT19A重组克隆果蝇的制作

2.2.7 果蝇基因组提取及扩增

2.2.8 转基因载体构建

2.2.9 S2细胞培养及转染

2.2.10 组织解剖与染色

2.2.11 ROS水平检测

2.2.12 ATP水平检测

2.2.13 透射电镜样品制作

2.2.14 果蝇组织免疫印迹实验

2.2.15 质谱样品制备

2.2.16 统计分析

2.3 实验结果

2.3.1 减少Tom40的表达导致自噬途径被破坏

2.3.2 蛋白聚集体的形成和自噬途径的破损坏不是线粒体损伤的普遍反应

2.3.3 线粒体蛋白运输被破坏后不同的线粒体蛋白前体有不同的命运

2.3.4 Tom40 RNAi组织里蛋白酶体亚基积累在蛋白聚集体中并且蛋白酶体活性下降

2.3.5 Tom40 RNAi组织中抑制自噬途径减小蛋白聚集体大小并且阻止自噬膜结构对蛋白聚集体的包裹

2.3.6 减少Tom40的表达导致神经退行性疾病

2.4 总结与讨论

3 Rab40及其GTPase激活蛋白通过调节脂肪酶和自噬调控脂质稳态

3.1 前言

3.2 实验材料与方法

3.2.1 仪器设备

3.2.2 抗体使用

3.2.3 果蝇品系与饲养

3.2.4 果蝇幼虫饥饿处理

3.2.5 果蝇体重称量

3.2.6 突变体果蝇制作

3.2.7 转基因载体构建

3.2.8 S2细胞培养、转染及药物处理

3.2.9 S2细胞免疫荧光

3.2.10 S2细胞免疫共沉淀

3.2.11 GTPase激活蛋白分析（GAP assay）

3.2.12 脂肪体免疫荧光及Lysotracker Red染色

3.2.13 脂肪体、唾液腺脂滴染色

3.2.14 眼睛及脂肪体透射电镜样品制作

3.2.15 果蝇饥饿处理情况下成活率实验

3.2.16 统计分析

3.3 实验结果

3.3.1 新基因CG5745的鉴定

3.3.2 dTBC22是Rab40的GTPase激活蛋白（GAP）

3.3.3 Rab40在脂滴和高尔基体上富集

3.3.4 Rab40敲除抑制饥饿导致的脂滴减小

3.3.5 Rab40与Bmm有相互作用

3.3.6 缺失Rab40导致自噬途径被破坏

3.4 总结与讨论

参考文献

综述对自噬及选择性自噬的概述

1 细胞自噬

2 蛋白降解途径:泛素-蛋白酶体系统和蛋白聚集体自噬

3 脂解作用:脂肪酶（lipase）和脂类自噬（lipophagy）

4 总结

综述参考文献

附录

作者简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 段秀英

导师: 佟超

关键词: 果蝇,细胞自噬,线粒体,蛋白聚集体,脂滴,蛋白,脂肪酶

来源: 浙江大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 浙江大学

分类号: Q25

总页数: 131

文件大小: 12984K

下载量: 504

细胞自噬调控细胞质内蛋白稳态和脂质代谢

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢