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嗜热属真菌中7个聚酮合成基因的功能研究

2020-12-10阅读(212)

嗜热属真菌中7个聚酮合成基因的功能研究

论文摘要

真菌能产生一类数量众多、结构多样、活性良好的聚酮化合物,因此对于真菌中大量潜在未知聚酮化合物的挖掘及生物合成研究具有重要意义及应用价值。嗜热真菌是唯一一类适宜在高温条件下（45-50℃）生长的真核生物。前期本实验室从嗜热属真菌杜邦嗜热菌Thermomyces dupontii和疏棉状嗜热菌Thermomyces lanuginosus 200065中分离得到一系列具有新颖结构和强杀线虫活性的大环内酯化合物Thermolides,为进一步研究这类化合物的生物合成途径,本研究利用生物信息学方法对两株嗜热真菌基因组进行预测分析,发现杜邦嗜热菌中共有5个编码Ⅰ型聚酮合成酶（Polyketide synthase,PKS）的基因:PKS12（由一个NRPS和一个Ⅰ型PKS组成）、PKS25（由Ⅰ型PKS-NRPS杂合基因组成）、PKS18、PKS30、PKS31均为Ⅰ型PKS;疏棉状嗜热菌中有6个PKS基因,其中两个PKS基因L-PKK12、L-PPK25分别与PKS12、PKS25同源。通过同源重组原理和原生质体转化方法对以上PKS基因进行敲除,将突变菌株与野生型菌株在表型、抗逆性、代谢、基因表达水平等方面进行比较,初步探究这些基因在嗜热杜邦菌中的生物合成功能和生物学意义。主要结果如下:1.首次在杜邦嗜热菌中建立了稳定的原生质体转化方法和基因敲除体系,成功获得杜邦嗜热菌的5个PKS基因敲除菌株:APKS12、△PKS18、△PKS25、△PKS30、△PKS31。应用该体系也获得了疏棉状嗜热菌的2个PKS基因敲除菌株:AL-PKS12、△L-PKS25。2.与野生型菌株相比,杜邦嗜热菌5个PKS敲除菌株中△PKS30的表型差异最大,其菌落不再产生棕色色素,表现为白色;△PKS3;的孢子产量显著减少2.6倍、孢子萌发率显著降低10.8%,敲除菌株△PKS12、△PKS18、△PKS25、△PKS31则无明显差异。在氧化胁迫（H2O2）、渗透胁迫（NaCl）、紫外辐射（λ=185nm）、分生孢子高温胁迫（60℃C）实验中,5个PKS敲除菌株均没有产生明显差异。但在细胞壁合成干扰（SDS、刚果红）实验中,APKS12、APKS18在含有0.02%SDS的PDA培养基上,气生菌丝生长比野生菌株更加致密,即表现为正常生长条件下（不含0.02%SDS）的致密菌丝生长状态,表明基因PKS12、PKS18的敲除可能会提高杜邦嗜热菌抗0.02%SDS能力;在含有0.2mg/mL刚果红的PDA培养基上,△PKS12、△PKS18、△PKS25的菌落生长直径均比野生型菌株增大,进一步结合转录组数据分析后发现,△PKS12中参与细胞壁合成的7个基因表达水平相比野生型菌株均上调,△PKS18的7个基因中有4个表达上调,且总体的表达上调水平高于下调水平,表明△PKS12、△PKS18的细胞壁合成能力相比野生型菌株均有一定提高。3.与野生型菌株相比,杜邦嗜热菌5个PKS敲除菌株的YGP发酵液乙酸乙酯粗提物LC-MS检测结果表明△PKS12差异最大,△PKS12的5个特有消失差异峰对应分子量分别与大环内酯化合物Thermolides A-E相一致,PKS12是大环内酯化合物Thermolides A-E生物合成的关键基因。同样,在疏棉状嗜热菌中L-PKS12（与PKS12同源）的敲除会导致Thermolides F-G消失,表明L-PKS12是大环内酯化合物Thermolides F-G生物合成的关键基因。PDB发酵液乙酸乙酯粗提物的LC-MS检测结果表明,杜邦嗜热菌突变菌株△PKS30有一个特有消失差异峰,通过分子量比对确定该化合物与本实验室前期鉴定的化合物Carviolin（roseo-purpurin）A相一致,表明PKS30是Carviolin（roseo-purpurin）A生物合成的关键基因。另外三个突变菌株△PKS18、△PKS25、△PKS31的YGP、PDB发酵液LC-MS检测结果表明,这三个敲除菌株并无特有差异峰的产生,仅存在几个峰面积变化的差异峰,可能是由于基因本身表达量较低或者发酵条件限制导致差异不够明显,因而对△PKS18、△PKS25、△PKS31的生物合成功能仍待进一步研究。4.基因表达差异分析结果表明,杜邦嗜热菌5个PKS基因敲除菌株的下调差异表达基因数量均高于上调差异表达基因数量（>1000条,其中△PKS30的差异下调基因数量约为差异上调基因数量的1.5倍）。在特有差异基因数量方面,△PKS12特有差异表达基因数量最多（2655个）,其次是△PKS18（1831个）和△PKS30（1500个）,而△PKS25（938个）与△PKS31（929个）特有差异表达基因数量相对较少。5个PKS敲除菌株的共有、特有差异表达基因的GO富集和KEGG富集分析结果表明,这些差异表达基因主要在代谢途径及相关的蛋白酶活性、细胞结构和成分等方面有较为显著的富集,而对于这些差异表达基因具体参与的途径、相互作用关系、以及对其他生物过程的影响还需结合进一步的筛选和分析进行说明。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 真菌聚酮合酶及其生物合成研究进展
  •   1.1 概述
  •   1.2 真菌Ⅰ型聚酮合酶的分类及生物合成研究
  •     1.2.1 真菌非还原型聚酮合酶（NR-PKS）及其生物合成
  •     1.2.2 真菌高度还原型聚酮合酶（HR-PKS）及其生物合成
  •     1.2.3 真菌PKS-NRPS合酶及其生物合成
  •   1.3 本研究的目的和意义
  • 第二章 两株嗜热真菌聚酮合成基因的筛选及基因敲除菌株的构建
  •   2.1 两株嗜热真菌中的聚酮合成基因的预测与筛选
  •     2.1.1 目的基因的预测分析方法
  •     2.1.2 预测分析结果
  •       2.1.2.1 杜邦嗜热菌中聚酮合成基因的预测及筛选
  •       2.1.2.2 杜邦嗜热菌中5个目的蛋白序列的同源聚类分析
  •       2.1.2.3 蛋白保守域分析结果
  •       2.1.2.4 疏棉状嗜热菌中聚酮合成基因的预测及筛选
  •     2.1.3 小结与讨论
  •   2.2 两株嗜热真菌聚酮合成基因敲除菌株的构建
  •     2.2.1 实验材料和方法
  •       2.2.1.1 供试菌株及质粒
  •       2.2.1.2 主要试剂及实验仪器
  •       2.2.1.3 培养基及试剂
  •       2.2.1.4 嗜热真菌基因组DNA提取
  •       2.2.1.5 质粒的提取
  •       2.2.1.6 敲除质粒的构建
  •       2.2.1.7 原生质体的制备及转化
  •       2.2.1.8 转化子验证
  •     2.2.2 实验结果
  •       2.2.2.1 敲除质粒构建结果
  •       2.2.2.2 转化子PCR验证
  •     2.2.3 小结与讨论
  • 第三章 杜邦嗜热菌中5个聚酮合成基因敲除菌株表型及抗逆性比较分析
  •   3.1 实验材料和方法
  •     3.1.1 菌株
  •     3.1.2 培养基
  •     3.1.3 菌丝生长情况观察
  •     3.1.4 孢子产量及孢子萌发率比较
  •     3.1.5 抗逆性比较
  •     3.1.6 分生孢子抗紫外辐射能力的检测
  •     3.1.7 分生孢子耐高温能力的检测
  •     3.1.8 秀丽隐杆线虫的制备及发酵液杀线虫活性实验
  •   3.2 实验结果
  •     3.2.1 菌丝生长情况比较结果
  •     3.2.2 孢子产量及孢子萌发率比较
  •     3.2.3 抗逆性实验结果
  •       3.2.3.1 渗透胁迫
  •       3.2.3.2 细胞壁合成干扰
  •       3.2.3.3 氧化胁迫
  •     3.2.4 分生孢子抗紫外辐射能力
  •     3.2.5 分生孢子耐高温能力实验
  •     3.2.6 发酵液杀线虫活性实验
  •   3.3 小结与讨论
  • 第四章 杜邦嗜热菌中5个聚酮合成基因敲除菌株次生代谢产物图谱比较
  •   4.1 实验材料和方法
  •     4.1.1 菌株
  •     4.1.2 培养基、试剂及仪器
  •     4.1.3 菌株发酵
  •     4.1.4 样品处理
  •     4.1.5 液相色谱-质谱（LC-MS）检测
  •     4.1.6 气相色谱-质谱（GC-MS）检测
  •   4.2 实验结果
  •     4.2.1 野生型菌株和突变菌株发酵液GC-MS检测结果
  •     4.2.2 GC-MS检测结果
  •     4.2.3 野生型菌株与突变菌株发酵液LC-MS检测结果
  •       4.2.3.1 △PKS12与野生型菌株的LC-MS差异图谱比较（负离子）
  •       4.2.3.2 大环内酯化合物ThermolidesA-E生物合成基因的LC-MS确认结果
  •       4.2.3.3 大环内酯化合物Thermolides F-G生物合成基因的LC-MS确认结果
  •       4.2.3.4 △PKS18与野生型菌株的LC-MS差异图谱比较（负离子）
  •       4.2.3.5 △PKS25与野生型菌株的LC-MS差异图谱比较（负离子）
  •       4.2.3.6 △PKS30与野生型菌株的LC-MS差异图谱比较（负离子）
  •       4.2.3.7 化合物carviolin （roseo-purpurin）A生物合成基因的LC-MS确认结果
  •       4.2.3.8 △PKS31与野生型菌株的LC-MS差异图谱比较（负离子）
  • 第五章 杜邦嗜热菌聚酮合成基因敲除菌株表达谱差异分析
  •   5.1 材料和方法
  •     5.1.1 菌株
  •     5.1.2 培养基
  •     5.1.3 试剂和设备
  •     5.1.4 实验方法
  •       5.1.4.1 菌株培养和样品制备
  •       5.1.4.2 RNA-Seq分析
  •   5.2 实验结果
  •     5.2.1 主成分分析结果（PCA）
  •     5.2.2 差异表达基因数量分析结果
  •     5.2.3 五个PKS敲除菌株共有差异表达基因GO富集分析结果
  •     5.2.4 五个PKS敲除菌株共有差异表达基因KEGG富集分析结果
  •     5.2.5 五个PKS敲除菌株特有差异表达基因GO富集分析结果
  •     5.2.6 五个PKS敲除菌株特有差异表达基因KEGG富集分析结果
  •     5.2.7 细胞壁合成相关基因表达差异分析
  •   5.3 小结与讨论
  • 全文总结及展望
  • 附表
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间完成的科研成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 何佳宁

    导师: 牛雪梅

    关键词: 嗜热真菌,杜邦嗜热菌,聚酮合成酶,生物合成,次生代谢产物

    来源: 云南大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 云南大学

    分类号: Q933

    总页数: 149

    文件大小: 14548K

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