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猪伪狂犬病毒感染早期引起PK-15细胞转录组变化及差异表达基因分析

2020-12-02阅读(120)

猪伪狂犬病毒感染早期引起PK-15细胞转录组变化及差异表达基因分析

论文摘要

伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）可在猪群内引起传染性的伪狂犬病（Pseudorabies,PR）,引起成年猪发热、母猪流产、死胎及仔猪死亡等症状。目前PR在我国还没有根除,给我国的养猪业带来经济损失。此前对PRV感染细胞转录组的研究往往更多地关注在感染12h后的差异表达基因,而鲜有对感染早期发生的病毒吸附和侵入事件时的细胞转录组变化进行研究,同时对PRV粘附及侵入相关受体或基因的研究也知之尚少。本实验将PRV感染PK-15细胞0hpi、2hpi、6hpi、12hpi、24hpi、36hpi、48hpi的总RNA进行转录组测序,并对测序数据进行生物信息分析,筛选0hpi、2hpi、6hpi的差异表达基因,随后对这些差异表达基因进行功能注释,包括GO功能分析、KEGG通路分析、蛋白功能聚类分析、PPI网络分析,从而有助于我们理解在病毒感染早期的发生的生物学事件,寻找可能的病毒受体或影响病毒侵入的功能基因。另外,本次实验还通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对转录组测序数据筛选出来的显著差异表达的CYP1A1基因及文献报道过的PRV受体NECTIN-1、NECTIN-2基因设计靶向sgRNA分别在PRV的宿主细胞PK-15及3D4/21细胞中进行了基因敲除实验。得到结果表明:（1）PRV对PK-15细胞的感染存在时间与剂量效应,即随着病毒感染MOI和时间的增加,细胞出现致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）越明显。使用MOI为10-6的PRV-Eα毒株感染PK-15细胞时,84hpi仍能使细胞大量死亡,表明PRV-Eα毒株对于PK-15细胞是强致死毒株。（2）PRV-Eα感染PK-15细胞后,PK-15细胞和PRV基因组的转录水平随着感染时间的延长呈现显著负相关,感染6h后PRV编码基因开始表达。（3）以|log2FC|≥2,p≤0.001为条件,筛选出PRV感染2h后差异表达基因有830个,感染6h后差异表达基因有848个,感染2h到6h内差异表达基因有381个。在0-2 hpi、0-6 hpi、2-6 hpi都差异表达的基因有8个,在0-2 hpi与0-6hpi都差异表达的基因有410个,在0-6hpi与2-6hpi都差异表达的基因有137个,在0-2hpi与2-6 hpi都差异表达的基因有65个。（4）对PRV感染PK-15细胞3个时间点的感染差异表达基因进行功能注释:GO分析富集到与免疫应答、RNA聚合酶II启动子的转录负调节、炎症应答、脂多糖应答、突触囊泡内吞作用、pH调节等多个相关条目。KEGG富集到p53信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和突触小泡循环等通路。蛋白功能分类到多数基因与水解酶、转运和受体功能相关。PPI网络分析富集到多个差异表达基因间存在互作关系。（5）对CYP1A1、NECTIN-1、NECTIN-2基因设计了有活性的靶向sgRNAs,通过慢病毒感染的方法在PK-15细胞中成功敲除了NECTIN-1基因,通过脂质体转染的方法在3D4/21细胞中实现了NECTIN-2基因的片段敲除。本研究通过对PRV感染PK-15细胞0hpi、2hpi、6hpi、12hpi、24hpi、36hpi、48hpi转录组测序数据的分析揭示了PRV在感染宿主细胞后病毒与宿主细胞转录组水平的变化,对感染不同时间点差异表达基因进行功能注释筛选出与病毒粘附和侵入相关的关键基因以及通路。同时通过CRISPR/Cas9技术对PRV粘附及侵入可能的相关基因CYP1A1、NECTIN-1、NECTIN-2进行敲除,为PRV的致病机制的研究提供参考,并为猪的抗病育种提供一些理论基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词中英文对照表
  • 1.前言
  •   1.1 研究问题的由来
  •   1.2 文献综述
  •     1.2.1 伪狂犬病的研究现状
  •     1.2.2 伪狂犬病毒及其粘附受体基因研究进展
  •     1.2.3 病毒侵入过程中的影响因素
  •     1.2.4 猪抗病育种的研究进展
  •     1.2.5 RNA-Seq技术在病毒感染相关基因鉴定中的应用
  •     1.2.6 基因编辑技术在猪抗病育种中的应用
  •   1.3 研究的目的与意义
  • 2.材料与方法
  •   2.1 技术路线
  •   2.2 材料
  •     2.2.1 细胞及毒株
  •     2.2.2 主要仪器、设备和耗材
  •     2.2.3 主要试剂及试剂盒
  •     2.2.4 主要试剂配制
  •     2.2.5 主要数据库、网站和软件
  •   2.3 方法
  •     2.3.1 细胞培养
  •     2.3.2 病毒扩增及病毒毒价的测定
  •     2.3.3 PRV感染PK-15 细胞
  •     2.3.4 细胞总RNA的提取
  •     2.3.5 RNA样品测序
  •     2.3.6 RNA-Seq原始数据的处理及生物信息学分析
  •     2.3.7 RT-qPCR实验
  •     2.3.8 引物设计和PCR扩增
  •     2.3.9 PX330-sgRNA表达载体的构建
  •     2.3.10 细胞脂质体转染
  •     2.3.11 慢病毒包装及感染细胞
  •     2.3.12 sgRNA表达载体的活性验证
  •     2.3.13 蛋白水平表达检测
  • 3.结果
  •   3.1 PRV-Eα毒株感染PK-15 细胞的时间与剂量效应
  •   3.2 PRV-Eα毒株感染PK-15 细胞RNA-seq测序数据评估
  •     3.2.1 数据评估及质控
  •     3.2.2 样本相关性检验
  •   3.3 PRV-Ea感染PK-15 细胞不同时间点病毒与宿主细胞转录组表达趋势比较
  •   3.4 PRV1152 感染PK-15 细胞的病毒示踪结果
  •   3.5 PRV感染PK-15 细胞差异表达基因分析
  •   3.6 PRV感染PK-15 细胞差异表达基因可视化分析
  •   3.7 PRV感染PK-15 细胞差异表达基因聚类分析
  •   3.8 PRV感染PK-15 细胞不同时间点显著差异表达基因重叠关系分析
  •   3.9 差异表达基因功能注释
  •     3.9.1 GO功能富集分析
  •     3.9.2 KEGG信号通路分析
  •     3.9.3 差异表达基因蛋白功能分类
  •   3.10 差异表达基因PPI网络构建及分析
  •   3.11 差异表达基因RT-qPCR验证
  •   3.12 CYP1A1 基因蛋白表达水平及sgRNA活性验证
  •   3.13 NECTIN-1 基因敲除细胞系的构建
  •     3.13.1 NECTIN1-sgRNAs活性验证
  •     3.13.2 NECTIN-1 基因敲除细胞系单克隆阳性验证
  •   3.14 3D4/21 稳定表达Cas9 蛋白细胞系的构建
  •   3.15 NECTIN-2 基因敲除细胞系的构建
  •     3.15.1 NECTIN2-sgRNAs活性验证
  •     3.15.2 NECTIN-2 基因片段敲除
  • 4.讨论
  •   4.1 关于PRV感染PK-15 时间效应的讨论
  •   4.2 关于PRV粘附及侵入过程中重要差异表达基因的讨论
  •   4.3 关于病毒与宿主细胞互作基因分析方法的讨论
  •   4.4 关于基因编辑在抗病育种中的运用的讨论
  • 5.小结
  •   5.1 主要结论
  •   5.2 主要创新点
  •   5.3 不足之处及下一步工作计划
  • 参考文献
  • 附录
  •   附录1 RNA质量检测结果
  •   附录2 PRV感染不同时间点DEGs重叠结果统计
  •   附录3 6hpi VS0hpi与6hpi VS2hpi差异表达基因PPI网络分析
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 杨高娟

    导师: 赵书红,谢胜松

    关键词: 粘附,侵入,差异表达基因,基因编辑

    来源: 华中农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 华中农业大学

    基金: 国家转基因生物新品种培育重大专项(2016ZX08006003-004),中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(2662018JC002)

    分类号: S852.651

    DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000201

    总页数: 98

    文件大小: 6035K

    下载量: 243

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