导读:本文包含了蛋白酶抑制子基因论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:冈田绕眼果蝇,丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白,组织特异性
蛋白酶抑制子基因论文文献综述
黄琳,贺莉芳,吕思颖,尚战阳,马元芬[1]（2019）在《冈田绕眼果蝇丝氨酸蛋白酶抑制蛋白基因的克隆及组织表达水平》一文中研究指出目的筛选并鉴定冈田绕眼果蝇转录组中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serine protease inhibitor,serpin)基因,分析其基因结构及在不同发育时期的表达水平。方法利用PCR技术克隆冈田绕眼果蝇serpin基因,对其编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析;利用MEGA 7. 0软件对获得的serpin基因进行系统进化树分析;利用HMMTOP version2. 0和TMHMM server version 2. 0软件预测serpin基因的跨膜结构域;利用RT-q PCR检测冈田绕眼果蝇几个不同发育时期(卵、蛆、蛹、雄蝇和雌蝇)中serpin基因表达水平。结果从冈田绕眼果蝇中克隆出serpin基因,开放阅读框全长1 323 bp,编码440个氨基酸,冈田绕眼果蝇serpin基因与其他果蝇serpin基因的氨基酸序列一致性最高为76%,serpin基因序列的系统进化分析表明冈田绕眼果蝇与Drosophila arizonae的进化关系最接近。冈田绕眼果蝇serpin存在跨膜结构,跨膜螺旋区的位置是第21～43位氨基酸。冈田绕眼果蝇serpin基因在卵、蛆、蛹、雄蝇、雌蝇等不同发育阶段中表达量不同,其中卵的表达量最高。结论成功克隆出冈田绕眼果蝇serpin基因序列,其编码蛋白主要在卵、蛆和雄蝇表达量高,为进一步研究冈田绕眼果蝇serpin基因功能奠定了基础。(本文来源于《医学动物防制》期刊2019年08期）
杨帆[2]（2019）在《RNAi对旋毛虫丝氨酸蛋白酶1.2及丝氨酸蛋白酶抑制因子基因功能的研究》一文中研究指出旋毛虫是一种主要的食源性寄生线虫,旋毛虫病主要是由于生食或半生食含旋毛虫囊包的肉制品从而感染。旋毛虫成虫寄生在宿主的小肠内,但幼虫侵入肠黏膜的机制尚不完全清楚。蛋白酶能够催化蛋白质多肽链的水解,而在寄生虫体内分泌的有多种功能的蛋白酶,在寄生虫的侵入与致病过程有着重要的作用。旋毛虫丝氨酸蛋白酶Ts SP1.2和丝氨酸抑制因子Ts SPI是从旋毛虫排泄-分泌物(excretory-secretory,ES)中获得的。实验室前期已经发现Ts SP1.2(Gen Bank Accession No.:EU302800)和Ts SPI抑制因子(Gen Bank accession no.XP_003377380.1)均可能参与了旋毛虫感染性幼虫侵入小肠上皮细胞(IEC)。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在生物进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,ds RNA)诱发的、同源m RNA高效特异性降解的现象[1]。本研究的目的是通过RNAi确定Ts SP1.2和Ts SPI在旋毛虫幼虫侵袭和生长发育中的作用。将特异性小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)通过电穿孔法导入旋毛虫肌幼虫(muscle larvae,ML)体内后,分别通过q PCR技术和Western blot技术来验证干扰效果。同时两个基因互为无关基因进行RNAi特异性的研究。此外,选取最优si RNA并导入旋毛虫肌幼虫后,体外观察幼虫存活率并在胆汁激活为肠道第1期幼虫(IL1)后进行侵入实验,观察RNAi沉默Ts SP1.2或Ts SPI是否能抑制幼虫对肠上皮细胞(IEC)的入侵与发育。将RNAi处理后的肌幼虫经口接种感染小鼠,观察沉默Ts SP1.2和Ts SPI对幼虫发育、存活及生殖力的抑制作用。材料与方法1.旋毛虫虫种、实验动物及细胞本实验所用旋毛虫均来自本实验室昆明小鼠保种的旋毛虫(T1)。实验所用BALB/c小鼠,雄性6周龄,购自河南省实验动物中心。所用细胞系为本实验室分离出的小鼠小肠上皮细胞。2.Ts SP1.2和Ts SPI的表达纯化及抗其免疫血清的制备将本实验室之前冻存的Ts SP1.2和Ts SPI重组菌活化。进行r Ts SP1.2和r Ts SPI诱导表达,进行超声破碎并纯化蛋白,分别免疫小鼠,获取抗r Ts SP1.2和抗r Ts SPI的免疫血清。3.si RNA的设计及合成根据Ts SP1.2和Ts SPI的基因号,登录si RNA在线设计软件si Direct version 2.0进行设计。每个基因筛选出3个si RNA,根据其位点分别命名Ts SP1.2的si RNA为si RNA-534、si RNA-818、si RNA-303;Ts SPI的si RNA为si RNA-445、si RNA-653、si RNA-882。此外,设计一条Control si RNA并添加FAM荧光标记,用于实验观察是否将si RNA导入旋毛虫体内。4.将si RNA用电穿孔法导入到旋毛虫体内应用瞬时电击的方法,分别将2μМ不同si RNA导入到旋毛虫体内,体外培养18h后观察荧光信号。5.RNAi后在基因转录水平和蛋白表达水平的变化将siRNA转染肌幼虫后2、4、6及8天,通过qPCR和Western blot技术分别观察Ts SP1.2和Ts SPI基因转录水平和蛋白表达水平的变化。同时观察不同剂量si RNA(1、2、3μМ)的干扰效果。6.RNAi具有基因特异性分别选取2μМ来自Ts SP1.2和Ts SPI的si RNA进行基因沉默,两组互为对照组,验证RNAi基因特异性。7.RNAi后的虫体存活率及其对虫体侵入IEC的影响电穿孔处理旋毛虫肌幼虫后,体外培养7d,观察肌幼虫形态变化,计算存活率。应用电击法将1、1.5、2、2.5、3μM si RNA-534、si RNA-653和Control si RNA导入到旋毛虫肌幼虫体内,PBS作为对照组。体外孵育2h后观察肌幼虫体外入侵IEC情况,计算RNAi对虫体侵入IEC的抑制率。8.RNAi对旋毛虫感染性、发育及生殖力的影响将80只BALB/c小鼠分为4组(每组20只):分别为Ts SP1.2组、Ts SPI组、Control si RNA组及空白对照组。每只小鼠分别按300条肌幼虫进行经口感染。感染后6d后各组剖杀10只小鼠,回收肠道期成虫(AW),测量雌雄虫长度并计算成虫减虫率,每组分别抽取100条成虫进行体外培养,72h后收集新生幼虫(NBL),观察NBL虫体长度并计算雌虫生殖力。剩余小鼠在感染后35 d剖杀,收集肌幼虫,测量虫体长度并计算肌幼虫减虫率。结果1.si RNA的导入:通过荧光显微镜下观察,发现RNAi处理后幼虫体内有明显一条荧光且虫体通体发亮,而未处理的幼虫则没有荧光信号。2.RNAi对旋毛虫肌幼虫Ts SP1.2和Ts SPI基因转录和蛋白表达水平的影响2.1 RNAi对旋毛虫Ts SP1.2基因转录和蛋白表达水平的影响:q PCR和Western blot结果显示,si RNA-534、si RNA-818、si RNA-303处理组肌幼虫Ts SP1.2基因转录水平相对于PBS对照组分别降低了57.05%、47.37%和27.18%(P<0.05),蛋白表达水平分别减少了69.65%、68.97%和37.09%(P<0.05);1、2、3μМsi RNA-534导入虫体后,Ts SP1.2基因转录水平降低了44.29%、53.81%和79.16%(P<0.05),蛋白水平分别减少了35.83%、44.05%和63.28%(P<0.05);2μM si RNA-534干扰后的肌幼虫在培养2d和4d基因表达量分别降低了56.44%和35.46%(P<0.05),蛋白水平分别降低了84.48%与67.35%(P<0.05),Control si RNA与PBS对照组相比较,Ts SP1.2转录和蛋白表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。2.2 RNAi对旋毛虫肌幼虫Ts SPI基因转录和蛋白表达水平的影响:q PCR和Western blot分析发现,si RNA-445、si RNA-653、si RNA-882处理组同PBS对照组相比,Ts SPI基因转录水平分别降低了20.50%、42.09%和12.13%(P<0.05),蛋白表达水平分别减少了63.52%、80.26%和10.61%(P<0.05);1、2及3μМsi RNA-653导入虫体后1d,Ts SPI基因转录水平分别降低了23.57%、36.90%和60.78%(P<0.05),蛋白表达水平分别减少了26.47%、75.13%和89.18%(P<0.05);2μM si RNA-653干扰后的肌幼虫在4d和6d,基因表达量明显降低了75.75%和69.79%(P<0.05),蛋白表达量分别降低了69.23%和50.63%(P<0.05)。Control si RNA组同PBS对照组相比,Ts SPI基因转录和蛋白表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。3.RNA干扰的基因特异性分析分别将si RNA-Ts SP1.2和si RNA-Ts SPI导入到幼虫体内后1d,观察RNAi对Ts SP1.2和Ts SPI蛋白表达水平的变化。结果发现,si RNA-Ts SP1.2处理组同PBS组相比,蛋白表达量减少了46.05%,si RNA-Ts SPI组蛋白表达水平的差异无统计学意义(P>0.05);si RNA-Ts SPI组蛋白表达量相对于PBS对照组减少了20.50%,Ts SP1.2组蛋白表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。4.RNAi后的虫体存活率RNAi后1d,si RNA-534、si RNA-653、Control si RNA组和PBS组幼虫死亡率分别为5.16%、4.80%、4.49%及3.16%(P>0.05)。沉默后7d,4组虫体死亡率分别为30.34%、34.08%、33.13%和32.73%(P>0.05)。结果表明RNAi对幼虫的生存能力没有明显的抑制作用。5.RNAi对虫体侵入IEC的抑制作用5.1 Ts SP1.2基因沉默对旋毛虫侵入IEC的抑制作用:2、2.5及3μМ的RNAi实验组与PBS组相比,均显着抑制了幼虫对IEC的侵入,3组的幼虫侵入率分别为42.82%、38.66%和32.88%(χ2 2μM=11.095,χ2 2.5μM=14.892,χ2 3μM=23.878;P<0.01);RNAi对幼虫侵入IEC的抑制效果与si RNA534的剂量具有相关性(r=0.981,P<0.001)。但是,不同浓度Control si RNA组的虫体侵入率的差异无统计学意义(P>0.05)。5.2 Ts SPI基因沉默对旋毛虫侵入IEC的抑制作用:2、2.5、3μМsiRNA-653转染旋毛虫体内后1d,3组的幼虫侵入率分别为43.68%、36.07%和30.54%(χ22μM=12.789,χ22.5μM=17.185,χ23μM=28.474,P<0.001);幼虫侵入率与si RNA653的浓度存在相关性(r=0.976,P<0.001)。不同浓度Control si RNA组的虫体侵入率的差异无统计学意义(P>0.05)。6.RNAi对旋毛虫感染性、发育及生殖力的影响6.1 Ts SP1.2-si RNA组:si RNA-534处理的肌幼虫感染小鼠后6d,RNAi组成虫荷(48.31±7.29)明显低于Control si RNA组(114.15±12.68)和PBS组(112.77±9.99)(Fadults=162.493,P<0.001);雌成虫培养72h后新生幼虫产量分别为53.33±8.26、78.17±6.33和76.17±6.78条(FNBL=39.547,P<0.001);感染后35 d从3组小鼠回收的肌幼虫数分别为1076.40±348.31、3410.79±643.72和3682.34±1090.84(FML=35.530,P<0.05)。结果表明,Ts SP1.2-si RNA处理幼虫接种小鼠后6d与35d成虫与肌幼虫的减虫率分别是57.16%和71.46%。虫体长度测量结果显示,si RNA组雌成虫长度(1496.48±96.19)μm低于si RNA对照组(1807.70±105.88)μm和PBS组(1999.05±36.42)μm;si RNA组与si RNA对照组的雄成虫长度分别为(867.92±28.11)μm与(949.89±20.01)μm,亦明显小于PBS组(996.29±70.27)μm(Ffemal=50.965,Fmale=6.205,P<0.05)。3组的新生幼虫长度分别为(73.72±9.69)μm、(116.50±2.59)μm和(119.28±4.64)μm(FNBL=39.547,P<0.0001)。si RNA组的肌幼虫长度(843.44±39.60)μm亦显着短于对照组的(1133.12±55.54)μm和PBS组的(1146.38±20.70)μm(F=57.836,P<0.001)。6.2 Ts SPI-si RNA组:si RNA-653处理的肌幼虫感染小鼠后6d,RNAi组成虫荷(440.92±8.29)明显低于Control si RNA组(114.15±12.68)和PBS组(112.77±9.99)(Fadults=191.887,P<0.001);雌成虫培养72 h后新生幼虫产量分别为(40.67±6.32)、(78.17±6.33)和(76.17±6.78)条(FNBL=112.406,P<0.001);感染后35 d从3组小鼠回收的肌幼虫数分别为(1012.29±131.41)、(3410.79±643.72)和(3682.34±1090.84)条(FML=57.014,P<0.05)。结果表明,Ts SP1.2-si RNA处理幼虫接种小鼠后6d与35d成虫与肌幼虫的减虫率分别是63.71%和72.38%。虫体长度测量结果显示,si RNA组雌成虫长度(1517.98±90.74)μm低于si RNA对照组(1807.70±105.88)μm和PBS组(1999.05±36.42)μm;si RNA组与si RNA对照组的雄成虫长度分别为(715.32±57.60)μm与(949.89±20.01)μm,亦明显小于PBS组(996.29±70.27)μm(Ffemal=40.683,Fmale=40.008,P<0.05)。3组的新生幼虫长度分别为(69.85±4.22)μm、(116.50±2.59)μm和(119.28±4.64)μm(FNBL=57.836,P<0.001)。si RNA组的肌幼虫长度(817.44±43.25)μm亦显着短于对照组的(1133.12±55.54)μm和PBS组的(1146.38±20.70)μm(F=39.547,P<0.001)。结论1.应用电穿孔法将Ts SP1.2和Ts SPI特异性si RNA成功导入到了旋毛虫肌幼虫体内。2.Ts SP1.2-si RNA 534和Ts SPI-si RNA 653分别明显降低了Ts SP1.2和Ts SPI的转录与表达。3.RNAi沉默Ts SP1.2和Ts SPI,均显着抑制了旋毛虫对肠上皮细胞的侵入与虫体的发育,并降低了雌虫的繁殖力,进一步证实Ts SP1.2和Ts SPI为旋毛虫的侵入相关蛋白,可作为抗旋毛虫疫苗的潜在的分子靶点。(本文来源于《郑州大学》期刊2019-04-01）
陈冬金,陈岩锋,桑雷,孙世坤,王锦祥[3]（2019）在《钙蛋白酶抑制蛋白基因作为肉质候选基因的研究进展》一文中研究指出钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin CAST),是钙蛋白酶系统的成员之一,对畜禽肌肉的嫩度等肉质性状有调节作用。本文阐述CAST基因的结构特征、表达与定位、调节机理、多态性及其与肉质性状的相关研究进展。(本文来源于《中国畜禽种业》期刊2019年01期）
江红霞,李喜莲,侯富军,刘勇杰,李飞[4]（2018）在《日本沼虾半胱氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆及其组织表达特征》一文中研究指出半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CST)是一种能够可逆结合并抑制半胱氨酸蛋白酶类的活性的蛋白,为了明确日本沼虾(Macrobrachium nipponense)CST基因(Mn CST)序列及其在日本沼虾卵巢中的作用,本研究利用RACE方法克隆获得日本沼虾Mn CST全长cDNA序列,利用qRT-PCR分析了其在不同组织和不同发育阶段的卵巢中的表达情况,并利用RNA干扰(RNAi)技术初步分析了Mn CST在日本沼虾卵巢发育中的作用。结果显示,Mn CST cDNA序列全长6199 bp,包含1183 bp 5′非编码区、2304 bp 3′非编码区和2709 bp开放阅读框,编码903个氨基酸残基,其氨基酸序列上有6个cystatin-like(半胱氨酸蛋白酶抑制因子样)结构域和42个磷酸化位点;Mn CST基因在各个组织中均有表达,肠中表达量最高;日本沼虾不同发育阶段的卵巢中均有Mn CST基因表达,Ⅳ期卵巢中表达量最高,Ⅱ期卵巢中表达量最低;Mn CST基因在日本沼虾卵巢中的表达变化与组织蛋白酶B(Cts B)和组织蛋白酶L(Cts L)基因的表达变化基本是一致的,但对卵黄蛋白原(Vg)基因的表达没有直接影响。Mn CST在日本沼虾卵巢中的作用可能主要是抑制Cts B和Cts L的活性,在日本沼虾卵巢发育过程中对Vg的水解起间接的调控作用。(本文来源于《中国水产科学》期刊2018年05期）
程金芝,刘鉴,翟慧,吕清巧,颜凤[5]（2017）在《埃及伊蚊丝氨酸蛋白酶抑制蛋白基因家族的筛选和表达谱分析》一文中研究指出目的筛选并鉴定埃及伊蚊(Aedes aegypti)全基因组中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serine protease inhibitor,serpin)基因,分析其基因结构以及在不同发育时期和不同组织中的表达谱。方法运用生物信息学方法在埃及伊蚊全基因组数据库中筛选并鉴定埃及伊蚊serpin基因家族,利用Vector NTI11.0软件进行同源性比对、保守性分析,采用MEGA7.0软件构建系统进化树。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测埃及伊蚊不同发育时期(卵、Ⅰ~Ⅳ龄幼虫、蛹、雄蚊和未吸血雌蚊),以及未吸血雌蚊不同组织(唾液腺、中肠、脂肪体和卵巢)的serpin基因表达变化。结果从埃及伊蚊全基因组中筛选出26条serpin基因序列。生物信息学分析结果显示,19条具有信号肽,16条推测具有抑制酶活性。进化分析表明,埃及伊蚊serpin基因家族被分为A、B和C分支,B分支分为4组,每分支均具有同源性,且不同成员间在进化上相对保守。qRT-PCR结果显示,Aa SRPN25在雌蚊中特异性表达,相对表达量为0.074±0.015(P<0.01);Aa SRPN19~22在雄蚊中丰富表达;Aa SRPN23在Ⅰ龄幼虫时期特异性高表达,而且在唾液腺中也特异性高表达,相对表达量分别为22.9±5.28和4.24±1.39(P<0.01);Aa SRPN25在唾液腺中特异性高表达,相对表达量为74.44±25.76(P<0.01),Aa SRPN6、Aa SRPN14在中肠中的表达量最高,相对表达量分别为1.80±0.33、0.703±0.501;Aa SRPN17、Aa SRPN20在脂肪体中的表达量最高,相对表达量分别为0.34±0.09、0.15±0.03。结论从埃及伊蚊全基因组中筛选出26条serpin基因序列,其中19条具有信号肽,16条推测具有抑制酶活性的作用。(本文来源于《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》期刊2017年06期）
虞勇,李明辉,刘桂剑,李冰玉,邹云增[6]（2016）在《钙蛋白酶抑制蛋白基因过表达Balb/C小鼠的繁育及鉴定》一文中研究指出目的:建立钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)基因过表达Balb/C小鼠的培育方法,并探讨碱性裂解液提取基因组DNA在子代鼠基因型鉴定中的价值。方法:将雄性C57BL/6-CAST~(+/-)转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠杂交,将雄性CAST~(+/-)杂合子代小鼠与雌性Balb/C野生型子代小鼠杂交,连续杂交至消除C57BL/6小鼠遗传背景。取子代小鼠鼠尾组织,采用碱性裂解液提取基因组DNA,PCR法扩增CAST基因片段,琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。采用柯萨奇B3病毒(CVB3)感染Balb/C-CAST~(-/-)小鼠以建立急性病毒性心肌炎小鼠模型。结果:C57BL/6-CAST~(+/-)转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠连续杂交10代可消除C57BL/6小鼠遗传背景。采用碱性裂解液提取的基因组DNA数量、纯度能够满足后续实验需要,且产物大小与目的片段一致。成功建立Balb/C-CAST~(-/-)基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型。结论:成功建立Balb/CCAST基因过表达小鼠,为后续研究奠定了基础;碱性裂解液提取基因组DNA简便、高效,值得推广。(本文来源于《中国临床医学》期刊2016年04期）
张石洋[7]（2016）在《候选转基因靶标基因亚洲玉米螟丝氨酸蛋白酶抑制因子Serpin1突变体构建及功能分析》一文中研究指出玉米是世界叁大禾谷类作物之一,是重要的粮食、饲料和工业加工原料作物。近几年,随着我国玉米种植面积扩大和逐年连作,亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis的为害逐渐加重,严重影响玉米产量。目前,我国转基因抗虫玉米研发工作正在进行中。丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serine proteinase inhibitors, Serpins)是一种分布广泛的家族型蛋白酶抑制剂,该家族的大多数成员都对丝氨酸蛋白酶具有特异性抑制。迄今为止,现己从动物、病毒、植物、细菌和古生菌中发现1500多类丝氨酸蛋白酶抑制因子,该类抑制因子一般含有350～400个氨基酸残基,分子量约为40～100 kDa,并拥有一个包含8-9个a螺旋和3个p折迭的保守的叁维结构。丝氨酸蛋白酶抑制剂通常在C端有一段暴露的反应中心(reactive centre loop)RCL序列,可以与丝氨酸蛋白酶共价结合,随后Serpin自身被裂解,RCL区域P1位点的氨基酸在serpin的结合过程中起关键作用。本文以亚洲玉米螟免疫相关的丝氨酸蛋白酶抑制因子Serpin1为候选转基因靶标基因,进行P1位点定点突变,构建突变体并分析其表达产物的功能。本实验室已克隆获得Of-Serpin1全长为1336 bp的cDNA序列(登录号：.X524148),含一个1188 bp的开放阅读框,编码395个氨基酸残基,预测的分子量为43.3 kDa,其pI值为4.92,拥有一个典型的RCL功能区域。为探究P1位点在亚洲玉米螟serpin1功能中的作用,本文设计突变引物,将野生型P1位点的亮氨酸L360(CTA)突变为精氨酸R360(AGG)、赖氨酸K360(AAG)、苯丙氨酸F360(TTC)和丝氨酸S360(AGT),并在Serpin1氨基末端添加FLAG标签。将野生型和四种突变体Of-Serpin1的ORF克隆于pET-28b表达载体中,之后转入E.coli BL21(DE3)菌株进行体外原核表达。利用Ni2+亲和柱对野生型及四种突变体Serpin 1 (R、K、F、S)重组蛋白进行亲和纯化,利用Western blotting鉴定纯化获得的蛋白。对野生型及四种突变体Serpin1(R、K、F、S)重组蛋白进行抑制动力学分析。结果表明：添加Of-Serpinl S360(AGT)后牛胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)的Vmax值和Km值最小,表示Of-Serpinl P1位点为S360时与chymotrypsin的亲和力最大,亲和力从大到小的Of-Serpin1 P1位点依次为S360>K360>p360>L360>R360。添加Of-serpin1 S360 (AGT)后chymotrypsin的K1值最小,表示Of-Serpin1 P1位点为S360时对chymotrypsin的抑制作用越强,抑制作用强度从大到小的Of-Serpin1 P1位点依次为S360>K360>F360>L360>R360。生物信息学分析表明Of-Serpin1类似于抗胰凝乳蛋白酶因子,但是Of-Serpin1野生型及四种突变体重组蛋白的选择性剪切实验结果证明,它们均可同时被牛胰凝乳蛋白酶和牛胰蛋白酶(.rypsin)剪切。(本文来源于《扬州大学》期刊2016-05-01）
吴芳兰,范先成,李倩,陈立华,李宁沙[8]（2015）在《丝氨酸蛋白酶抑制因子基因检测在乳腺癌骨髓微转移诊断中的作用》一文中研究指出目的探讨乳腺癌患者骨髓中丝氨酸蛋白酶抑制因子(Maspin)m RNA的表达及临床意义。方法用荧光定量聚合酶链反应(RTFQ-PCR)检测58例乳腺癌、15例乳腺良性肿瘤及10例健康体检者骨髓中的Maspin m RNA表达,并分析Maspin m RNA表达与临床病理因素的相关性。结果 58例乳腺癌患者中,20例Maspin m RNA阳性表达,阳性表达率为35.3%(20/58),显着低于乳腺良性肿瘤患者(86.7%)和健康体检者(90.0%)(P<0.05)。Maspin m RNA阳性表达与乳腺癌临床分期、腋窝淋巴结转移呈负相关(P<0.05);与年龄、肿瘤大小、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)表达无关(P>0.05)。结论 Maspin m RNA可作为检测乳腺癌患者骨髓微转移(BMM)的分子指标之一。BMM检测可为乳腺癌患者的治疗和预后判断提供帮助。(本文来源于《中国现代医学杂志》期刊2015年32期）
徐龙威,王芹,汪桂玲,李家乐[9]（2015）在《叁角帆蚌Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制子基因的cDNA全序列克隆与表达分析》一文中研究指出为探究蛋白酶抑制因子基因在叁角帆蚌免疫应答中所起的作用,本研究采用RACE法对叁角帆蚌Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子(KSPI)基因的c DNA全序列进行了克隆。结果显示,该基因序列全长为1029bp,其中3'端非翻译区206bp,5'端非翻译区61bp,开放阅读框长762 bp,共编码253个氨基酸,包含5个Kazal结构域,根据氨基酸序列同源性分析发现与一些已知物种的KSPI基因具有较高的相似度,属于典型的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子基因。实时荧光定量PCR分析结果显示KSPI基因在闭壳肌、斧足、肝脏、血液、外套膜、鳃、和性腺7个组织中均有表达。其中外套膜、闭壳肌中表达含量最高,血液、肝脏中含量较低。利用嗜水气单胞菌诱导后检测发现,各个组织呈现出先升高再降低的趋势,在12或24小时达到最大值,之后逐渐降低,推测KSPI基因在叁角帆蚌的免疫反应中具有重要作用。(本文来源于《2015年中国水产学会学术年会论文摘要集》期刊2015-11-05）
冯欣宇,马雅军,徐建农,梁江涛,夏爱[10]（2015）在《中华按蚊丝氨酸蛋白酶抑制因子14(SRPN14)基因的多态性和进化研究》一文中研究指出目的鉴定和定位中华按蚊丝氨酸蛋白酶抑制因子14(SRPN14)基因,分析其在不同群体中的多态性,以及进化中的选择压力。方法依据中华按蚊基因组测序数据,设计引物,建立扩增SRPN14基因部分片段的体系,荧光原位杂交进行染色体定位。测定采自我国12省(市)18个采集地的中华按蚊群体的SRPN14基因部分片段序列,计算其在群体内与群体间的遗传差异,以及适应性进化的选择压力。结果本研究获得的中华按蚊SRPN14基因部分序列长度为429 bp,与冈比亚按蚊SRPN14基因的对应位置在核苷酸和氨基酸水平的序列一致性分别为77%和88%,位于唾腺染色体的2L:23C亚区。采自我国13个群体411个个体中,SRPN14的等位基因数目共204个,其中51个在群体间共享,占25.00%。13个群体的中华按蚊SRPN14等位基因数目范围为11(辽宁群体LN)~33(重庆群体CQ),核苷酸多态性为0.008(LN)~0.024(海南群体HAN)。AMOVA分析结果显示,群体内变异显着大于群体间,群体内变异占总变异的95.79%,群体间差异小,遗传分化指数(FST)值为0.042。中华按蚊各群体SRPN14基因核苷酸同义替换位点数明显多于非同义替换位点数,ω均小于1。结论SRPN14基因在中华按蚊群体中存在一定的多态性,其进化受到负选择压力。(本文来源于《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》期刊2015年04期）
蛋白酶抑制子基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
旋毛虫是一种主要的食源性寄生线虫,旋毛虫病主要是由于生食或半生食含旋毛虫囊包的肉制品从而感染。旋毛虫成虫寄生在宿主的小肠内,但幼虫侵入肠黏膜的机制尚不完全清楚。蛋白酶能够催化蛋白质多肽链的水解,而在寄生虫体内分泌的有多种功能的蛋白酶,在寄生虫的侵入与致病过程有着重要的作用。旋毛虫丝氨酸蛋白酶Ts SP1.2和丝氨酸抑制因子Ts SPI是从旋毛虫排泄-分泌物(excretory-secretory,ES)中获得的。实验室前期已经发现Ts SP1.2(Gen Bank Accession No.:EU302800)和Ts SPI抑制因子(Gen Bank accession no.XP_003377380.1)均可能参与了旋毛虫感染性幼虫侵入小肠上皮细胞(IEC)。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在生物进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,ds RNA)诱发的、同源m RNA高效特异性降解的现象[1]。本研究的目的是通过RNAi确定Ts SP1.2和Ts SPI在旋毛虫幼虫侵袭和生长发育中的作用。将特异性小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)通过电穿孔法导入旋毛虫肌幼虫(muscle larvae,ML)体内后,分别通过q PCR技术和Western blot技术来验证干扰效果。同时两个基因互为无关基因进行RNAi特异性的研究。此外,选取最优si RNA并导入旋毛虫肌幼虫后,体外观察幼虫存活率并在胆汁激活为肠道第1期幼虫(IL1)后进行侵入实验,观察RNAi沉默Ts SP1.2或Ts SPI是否能抑制幼虫对肠上皮细胞(IEC)的入侵与发育。将RNAi处理后的肌幼虫经口接种感染小鼠,观察沉默Ts SP1.2和Ts SPI对幼虫发育、存活及生殖力的抑制作用。材料与方法1.旋毛虫虫种、实验动物及细胞本实验所用旋毛虫均来自本实验室昆明小鼠保种的旋毛虫(T1)。实验所用BALB/c小鼠,雄性6周龄,购自河南省实验动物中心。所用细胞系为本实验室分离出的小鼠小肠上皮细胞。2.Ts SP1.2和Ts SPI的表达纯化及抗其免疫血清的制备将本实验室之前冻存的Ts SP1.2和Ts SPI重组菌活化。进行r Ts SP1.2和r Ts SPI诱导表达,进行超声破碎并纯化蛋白,分别免疫小鼠,获取抗r Ts SP1.2和抗r Ts SPI的免疫血清。3.si RNA的设计及合成根据Ts SP1.2和Ts SPI的基因号,登录si RNA在线设计软件si Direct version 2.0进行设计。每个基因筛选出3个si RNA,根据其位点分别命名Ts SP1.2的si RNA为si RNA-534、si RNA-818、si RNA-303;Ts SPI的si RNA为si RNA-445、si RNA-653、si RNA-882。此外,设计一条Control si RNA并添加FAM荧光标记,用于实验观察是否将si RNA导入旋毛虫体内。4.将si RNA用电穿孔法导入到旋毛虫体内应用瞬时电击的方法,分别将2μМ不同si RNA导入到旋毛虫体内,体外培养18h后观察荧光信号。5.RNAi后在基因转录水平和蛋白表达水平的变化将siRNA转染肌幼虫后2、4、6及8天,通过qPCR和Western blot技术分别观察Ts SP1.2和Ts SPI基因转录水平和蛋白表达水平的变化。同时观察不同剂量si RNA(1、2、3μМ)的干扰效果。6.RNAi具有基因特异性分别选取2μМ来自Ts SP1.2和Ts SPI的si RNA进行基因沉默,两组互为对照组,验证RNAi基因特异性。7.RNAi后的虫体存活率及其对虫体侵入IEC的影响电穿孔处理旋毛虫肌幼虫后,体外培养7d,观察肌幼虫形态变化,计算存活率。应用电击法将1、1.5、2、2.5、3μM si RNA-534、si RNA-653和Control si RNA导入到旋毛虫肌幼虫体内,PBS作为对照组。体外孵育2h后观察肌幼虫体外入侵IEC情况,计算RNAi对虫体侵入IEC的抑制率。8.RNAi对旋毛虫感染性、发育及生殖力的影响将80只BALB/c小鼠分为4组(每组20只):分别为Ts SP1.2组、Ts SPI组、Control si RNA组及空白对照组。每只小鼠分别按300条肌幼虫进行经口感染。感染后6d后各组剖杀10只小鼠,回收肠道期成虫(AW),测量雌雄虫长度并计算成虫减虫率,每组分别抽取100条成虫进行体外培养,72h后收集新生幼虫(NBL),观察NBL虫体长度并计算雌虫生殖力。剩余小鼠在感染后35 d剖杀,收集肌幼虫,测量虫体长度并计算肌幼虫减虫率。结果1.si RNA的导入:通过荧光显微镜下观察,发现RNAi处理后幼虫体内有明显一条荧光且虫体通体发亮,而未处理的幼虫则没有荧光信号。2.RNAi对旋毛虫肌幼虫Ts SP1.2和Ts SPI基因转录和蛋白表达水平的影响2.1 RNAi对旋毛虫Ts SP1.2基因转录和蛋白表达水平的影响:q PCR和Western blot结果显示,si RNA-534、si RNA-818、si RNA-303处理组肌幼虫Ts SP1.2基因转录水平相对于PBS对照组分别降低了57.05%、47.37%和27.18%(P<0.05),蛋白表达水平分别减少了69.65%、68.97%和37.09%(P<0.05);1、2、3μМsi RNA-534导入虫体后,Ts SP1.2基因转录水平降低了44.29%、53.81%和79.16%(P<0.05),蛋白水平分别减少了35.83%、44.05%和63.28%(P<0.05);2μM si RNA-534干扰后的肌幼虫在培养2d和4d基因表达量分别降低了56.44%和35.46%(P<0.05),蛋白水平分别降低了84.48%与67.35%(P<0.05),Control si RNA与PBS对照组相比较,Ts SP1.2转录和蛋白表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。2.2 RNAi对旋毛虫肌幼虫Ts SPI基因转录和蛋白表达水平的影响:q PCR和Western blot分析发现,si RNA-445、si RNA-653、si RNA-882处理组同PBS对照组相比,Ts SPI基因转录水平分别降低了20.50%、42.09%和12.13%(P<0.05),蛋白表达水平分别减少了63.52%、80.26%和10.61%(P<0.05);1、2及3μМsi RNA-653导入虫体后1d,Ts SPI基因转录水平分别降低了23.57%、36.90%和60.78%(P<0.05),蛋白表达水平分别减少了26.47%、75.13%和89.18%(P<0.05);2μM si RNA-653干扰后的肌幼虫在4d和6d,基因表达量明显降低了75.75%和69.79%(P<0.05),蛋白表达量分别降低了69.23%和50.63%(P<0.05)。Control si RNA组同PBS对照组相比,Ts SPI基因转录和蛋白表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。3.RNA干扰的基因特异性分析分别将si RNA-Ts SP1.2和si RNA-Ts SPI导入到幼虫体内后1d,观察RNAi对Ts SP1.2和Ts SPI蛋白表达水平的变化。结果发现,si RNA-Ts SP1.2处理组同PBS组相比,蛋白表达量减少了46.05%,si RNA-Ts SPI组蛋白表达水平的差异无统计学意义(P>0.05);si RNA-Ts SPI组蛋白表达量相对于PBS对照组减少了20.50%,Ts SP1.2组蛋白表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。4.RNAi后的虫体存活率RNAi后1d,si RNA-534、si RNA-653、Control si RNA组和PBS组幼虫死亡率分别为5.16%、4.80%、4.49%及3.16%(P>0.05)。沉默后7d,4组虫体死亡率分别为30.34%、34.08%、33.13%和32.73%(P>0.05)。结果表明RNAi对幼虫的生存能力没有明显的抑制作用。5.RNAi对虫体侵入IEC的抑制作用5.1 Ts SP1.2基因沉默对旋毛虫侵入IEC的抑制作用:2、2.5及3μМ的RNAi实验组与PBS组相比,均显着抑制了幼虫对IEC的侵入,3组的幼虫侵入率分别为42.82%、38.66%和32.88%(χ2 2μM=11.095,χ2 2.5μM=14.892,χ2 3μM=23.878;P<0.01);RNAi对幼虫侵入IEC的抑制效果与si RNA534的剂量具有相关性(r=0.981,P<0.001)。但是,不同浓度Control si RNA组的虫体侵入率的差异无统计学意义(P>0.05)。5.2 Ts SPI基因沉默对旋毛虫侵入IEC的抑制作用:2、2.5、3μМsiRNA-653转染旋毛虫体内后1d,3组的幼虫侵入率分别为43.68%、36.07%和30.54%(χ22μM=12.789,χ22.5μM=17.185,χ23μM=28.474,P<0.001);幼虫侵入率与si RNA653的浓度存在相关性(r=0.976,P<0.001)。不同浓度Control si RNA组的虫体侵入率的差异无统计学意义(P>0.05)。6.RNAi对旋毛虫感染性、发育及生殖力的影响6.1 Ts SP1.2-si RNA组:si RNA-534处理的肌幼虫感染小鼠后6d,RNAi组成虫荷(48.31±7.29)明显低于Control si RNA组(114.15±12.68)和PBS组(112.77±9.99)(Fadults=162.493,P<0.001);雌成虫培养72h后新生幼虫产量分别为53.33±8.26、78.17±6.33和76.17±6.78条(FNBL=39.547,P<0.001);感染后35 d从3组小鼠回收的肌幼虫数分别为1076.40±348.31、3410.79±643.72和3682.34±1090.84(FML=35.530,P<0.05)。结果表明,Ts SP1.2-si RNA处理幼虫接种小鼠后6d与35d成虫与肌幼虫的减虫率分别是57.16%和71.46%。虫体长度测量结果显示,si RNA组雌成虫长度(1496.48±96.19)μm低于si RNA对照组(1807.70±105.88)μm和PBS组(1999.05±36.42)μm;si RNA组与si RNA对照组的雄成虫长度分别为(867.92±28.11)μm与(949.89±20.01)μm,亦明显小于PBS组(996.29±70.27)μm(Ffemal=50.965,Fmale=6.205,P<0.05)。3组的新生幼虫长度分别为(73.72±9.69)μm、(116.50±2.59)μm和(119.28±4.64)μm(FNBL=39.547,P<0.0001)。si RNA组的肌幼虫长度(843.44±39.60)μm亦显着短于对照组的(1133.12±55.54)μm和PBS组的(1146.38±20.70)μm(F=57.836,P<0.001)。6.2 Ts SPI-si RNA组:si RNA-653处理的肌幼虫感染小鼠后6d,RNAi组成虫荷(440.92±8.29)明显低于Control si RNA组(114.15±12.68)和PBS组(112.77±9.99)(Fadults=191.887,P<0.001);雌成虫培养72 h后新生幼虫产量分别为(40.67±6.32)、(78.17±6.33)和(76.17±6.78)条(FNBL=112.406,P<0.001);感染后35 d从3组小鼠回收的肌幼虫数分别为(1012.29±131.41)、(3410.79±643.72)和(3682.34±1090.84)条(FML=57.014,P<0.05)。结果表明,Ts SP1.2-si RNA处理幼虫接种小鼠后6d与35d成虫与肌幼虫的减虫率分别是63.71%和72.38%。虫体长度测量结果显示,si RNA组雌成虫长度(1517.98±90.74)μm低于si RNA对照组(1807.70±105.88)μm和PBS组(1999.05±36.42)μm;si RNA组与si RNA对照组的雄成虫长度分别为(715.32±57.60)μm与(949.89±20.01)μm,亦明显小于PBS组(996.29±70.27)μm(Ffemal=40.683,Fmale=40.008,P<0.05)。3组的新生幼虫长度分别为(69.85±4.22)μm、(116.50±2.59)μm和(119.28±4.64)μm(FNBL=57.836,P<0.001)。si RNA组的肌幼虫长度(817.44±43.25)μm亦显着短于对照组的(1133.12±55.54)μm和PBS组的(1146.38±20.70)μm(F=39.547,P<0.001)。结论1.应用电穿孔法将Ts SP1.2和Ts SPI特异性si RNA成功导入到了旋毛虫肌幼虫体内。2.Ts SP1.2-si RNA 534和Ts SPI-si RNA 653分别明显降低了Ts SP1.2和Ts SPI的转录与表达。3.RNAi沉默Ts SP1.2和Ts SPI,均显着抑制了旋毛虫对肠上皮细胞的侵入与虫体的发育,并降低了雌虫的繁殖力,进一步证实Ts SP1.2和Ts SPI为旋毛虫的侵入相关蛋白,可作为抗旋毛虫疫苗的潜在的分子靶点。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
蛋白酶抑制子基因论文参考文献
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标签：冈田绕眼果蝇; 丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白; 组织特异性;