蓝藻Kai生物钟主输出途径相关突变体中Prx节律性研究

论文摘要

蓝藻Synechococcus elongatus PCC 7942（S.elongatus PCC 7942）是目前研究生物钟节律性最简单的模式生物,其核心钟蛋白KaiA/B/C可以依赖于翻译后振荡机制（Post Translational Oscillation,PTO）进行节律性振荡,并且这种节律性振荡方式能够在添加适量ATP的情况下,在离体实验中重建。在生物钟节律性的调控中,与核心振荡系统运作过程最相关的是生物钟信号输入和信号输出途径的钟基因的表达调控,它们以依赖于转录翻译反馈环（Transcription–Translation Feedback Loop,TTFL）的方式对生物钟的节律性行使调控作用。借助于信号输入途径,蓝藻生物钟系统可以感知环境时刻信号并将其传递给生物钟核心振荡器,而后信号输出途径可以将核心钟生成的内源时间信号传递给受生物钟调控的下游基因,这些输入/输出途径钟基因的节律性表达对蓝藻光合作用等基础代谢活动的有效进行至关重要。环境中的光信号和细胞内的氧化还原信号均可以重置生物钟的昼夜节律相位,在蓝藻细胞中参与细胞氧化还原稳态维持的主要有过氧化还原蛋白（Peroxiredoxins,Prx）、硫氧还蛋白（Thioredoxin,Trx）和谷氧还蛋白（Glutathione、Grx）等。前人的研究结果表明,蓝藻中典型的2-Cys Prx(Prx-SO2/3节律性标签)在氧化还原状态水平上存在昼夜节律振荡。Prx-SO2/3节律性标签的氧化还原状态节律性振荡方式不同于前述PTO和TTFL机制,而是以一种非转录依赖的振荡（Non-transcriptional Oscillator,NTO）机制维持运转。硫氧还蛋白还原酶（Thioredoxin reductase,TR）在Prx蛋白氧化还原再循环过程中起关键的调控作用,而谷胱甘肽合成酶（Glutathione synthase,GS）参与Prxs家族中1-Cys Prx辅助因子的合成。Prx广泛存在于古细菌,细菌和真核生物中,在进化上保持了高度的保守性,以其为基础的Prx-SO2/3节律性标签也广泛存在于上述不同的生命体中。由于基于TTFL和PTO的生物体的内源生物钟时间保持机制在不同进化阶元的生命体中并不保守,因此深入探究跨物种通用的Prx-SO2/3节律性标签的NTO分子调控机制,并探索NTO时间保持机制与具有多样性的TTFL和PTO时间保持机制之间的关联关系在生物钟基础理论研究方面具有较为重要的理论价值。本论文以模式蓝藻S.elongatus PCC 7942为研究对象,对承担蓝藻Kai生物钟主要输入和输出途径的关键基因群与Prx-SO2/3节律性标签运转维持的已知调控者prx基因家族成员、TR和GS等基因在转录水平和翻译水平上的节律性特征进行了较为细致地研究,并对这二组基因及其表达产物之间的关联关系进行了探究。相关研究结果初步确定基于蓝藻TTFL和PTO机制的Kai生物钟和以NTO机制为基础的Prx-SO2/3节律性标签之间不是相互独立的,所以二者可以通过CikA等环境时刻信息输入途径关键基因表达产物及2-Cys Prx蛋白的相互作用共同影响蓝藻生物钟的节律性表型。在此过程中,CikA与2-Cys Prx之间到底是发生了直接的蛋白质互作,还是二者间只是间接的功能性互作还有待下一步工作的深入研究。论文的主要研究内容如下:1、在非生物胁迫下筛选得到了S.elongatus PCC 7942 RT-qPCR实验的最适内参基因,为后续研究生物钟输出途径基因和prx家族基因在转录水平的表达模式奠定了技术基础。研究结果表明:prs和secA组合是适用于所有胁迫条件和高光胁迫下最适的内参基因。而secA和ppc,rimM和rnpA,rnpA和ilvD组合则分别在NTC,NaCl和H2O2胁迫条件下表达最为稳定。rimM只在特定条件下稳定表达,应慎重选择。16S和rnpB不适合在S.elongatus PCC7942中作为内参基因。2、构建了Kai生物钟输出途径相关基因和Prx-SO2/3节律性标签编码基因2-cys prx的单基因敲除突变体,并在不同突变体中使用RT-qPCR技术探究了相关基因的表达模式。结果表明:敲除cikA和sasA基因,直接导致rpaA基因的表达失去了节律性。敲除2-cys prx基因主要改变了cikA、rpaA和1-cys prx等基因的振幅,或者推迟了其表达节律性相位。研究中还发现了尚未报道的prx家族成员1-cys prx,prxQ-A1和prxQ-B等基因的转录节律性,而敲除2-cys prx基因则会造成它们节律性表达模式的丧失。2-cys prx在转录水平上并未发现节律性,但敲除2-cys prx会提高cikA基因的振幅,可能表明2-cys prx在cikA上游行使生物钟节律性调控功能。3、构建了2-cys prx和cikA、TR和GS的单敲蓝藻株系和双敲除蓝藻株系,进而探究了它们在不同光强下周期长度的变化。结果表明:高光胁迫和低光胁迫均能显著缩短目标蓝藻的昼夜节律周期长度。2-cys prx基因的敲除（突变体简称为d2Cys）不影响藻核心钟的周期长度。TR基因敲除蓝藻（TR敲除株系,简称为dTR）仅在正常光强下周期长度显著缩短,GS基因敲除蓝藻（GS敲除株系,简称为dGS）对蓝藻生物钟的影响较小。TR和GS与2-cys prx基因分别组合的双敲除蓝藻株系（分别简称为d2Cys/dTR和d2Cys/dGS）表现出极显著的核心钟周期缩短的表型,表明TR和GS与2-cys prx基因分别参与了3条相互独立,但是可以发生功能代偿的不同信号途径,并参与了生物钟的环境时刻信号的输入途径。在同一光强下,cikA单敲除蓝藻株系（CikA敲除株系,简称为dCikA）具有昼夜节律,但周期长度显著缩短,cikA与2-cys prx基因双敲除的蓝藻株系（简称为d2Cys/dCikA）表现出核心钟完全丧失节律性的无节律表型,这暗示了cikA与2-cys prx基因可能共同参与调控蓝藻生物钟核心振荡器的环境时刻信号输入过程且具有功能互作。4、蓝藻2-Cys Prx与CikA蛋白互作的检测。利用双分子荧光互补技术（BiFC）检测的结果表明:二者在类似蓝藻细胞生理环境的烟草叶绿体中能够激发互作荧光信号。而在不进行光合作用的酵母细胞中实施的酵母双杂交实验则检测不到2-Cys Prx与CikA蛋白的相互作用。这种来自BiFC和酵母双杂交实验的结果看似矛盾,但初步表明依赖于正常光合电子传递过程的细胞内氧化还原状态很可能是2-Cys Prx与CikA蛋白互作的前提条件。当然,这一推论目前还需要更进一步的确凿实验证据来检验与证明。

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摘要

ABSTRACT

缩略语对照表

第一章绪论

1.1 生物昼夜节律性的研究进展

1.1.1 蓝藻生物节律性分子调控机制研究进展

1.1.1.1 蓝藻生物钟核心振荡器编码基因kaiA/B/C基因簇的转录调控机制

1.1.1.2 Kai蛋白的节律性振荡及其调控机制

1.1.2 蓝藻生物钟输出途径基因在转录水平的调控研究进展

1.2 过氧化还原蛋白Peroxiredoxin节律性研究进展

2/3节律性标签的研究进展'> 1.2.1 蓝藻细胞内Peroxiredoxins蛋白及Prx-SO_2/3节律性标签的研究进展

1.2.2 Thioredoxin对 Peroxiredoxins调控作用的研究进展

1.2.3 Glutathione对 Peroxiredoxins调控作用的研究进展

1.3 本论文的主要内容及意义

第二章蓝藻SynechococcuselongatusPCC7942 在非生物胁迫条件下内参基因的筛选及验证

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.1.1 主要试剂

2.2.1.2 主要仪器设备

2.2.2 方法

2.2.2.1 材料处理

2.2.2.2 总RNA的抽提

2.2.2.3 基因组DNA的去除及c DNA的合成及纯化

2.2.2.4 候选内参基因的RT-PCR检验

2.2.2.5 候选内参基因的RT-qPCR反应体系及程序

2.2.2.6 候选内参基因表达稳定性分析

2.3 结果

2.3.1 RT-qPCR模板质量的鉴定

2.3.2 候选内参基因的基本信息及特异性分析

2.3.3 基于geNorm软件分析的候选内参基因表达稳定性统计结果

2.3.4 基于NormFiner软件分析的候选内参基因表达稳定性统计结果

2.3.5 基于BestKeeper软件分析的候选内参基因表达稳定性统计结果

2.3.6 候选内参基因的综合稳定性分析

2.3.7 最适内参基因筛选结果的验证

2.4 讨论

第三章蓝藻生物钟输出途径相关突变体中Prx家族基因的节律性表达模式

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 方法

3.2.2.1 生物钟输出途径钟基因敲除突变体的构建

3.2.2.1.1 目的基因同源重组打靶片段的克隆

3.2.2.1.2 蓝藻生物钟输出途径钟基因及nptII基因表达框的PCR体系及程序

3.2.2.1.3 蓝藻生物钟输出途径钟基因与克隆载体的连接和转化

3.2.2.1.4 蓝藻生物钟输出途径钟基因重组质粒及nptII基因表达框的酶切验证

3.2.2.1.5 酶切产物的连接及转化

3.2.2.1.6 生物钟输出途径钟基因单敲除突变体的获得

3.2.2.2 RT-qPCR实验样本的收集

3.2.2.3 生物钟输出途径及prx家族基因的RT-qPCR实验引物设计

3.2.2.3.1 目标基因序列的获得

3.2.2.3.2 目标基因RT-qPCR引物的设计

3.3 结果

3.3.1 蓝藻生物钟输出途径钟基因敲除突变体的获得

3.3.1.1 蓝藻生物钟输出途径钟基因敲除质粒构建的检测结果

3.3.1.2 生物钟输出途径钟基因敲除蓝藻突变体的验证

3.3.1.3 RT-qPCR实验中总RNA质量的检验

3.3.2 蓝藻生物钟输出途径钟基因在不同突变体中的表达模式分析

3.3.2.1 蓝藻生物钟输出途径钟基因的引物特异性验证

3.3.2.2 蓝藻生物钟输出途径cikA基因在不同突变体中的表达模式分析

3.3.2.3 蓝藻生物钟输出途径sasA基因在不同突变体中的表达模式分析

3.3.2.4 蓝藻生物钟输出途径labA基因在不同突变体中的表达模式分析

3.3.2.5 蓝藻生物钟输出途径rpaA基因在不同突变体中的表达模式分析

3.3.2.6 蓝藻生物钟输出途径rpaB基因在不同突变体中的表达模式分析

3.3.3 蓝藻过氧化物酶Prx家族基因在不同突变体中的表达模式分析

3.3.3.1 蓝藻过氧化物酶Prxs家族基因的RT-qPCR引物特异性验证

3.3.3.2 prxs家族1-cys prx基因在不同突变体中的表达模式分析

3.3.3.3 Prxs家族2-cys prx基因在不同突变体中的表达模式分析

3.3.3.4 Prxs家族prxQ-A1 基因在不同突变体中的表达模式分析

3.3.3.5 Prxs家族prxQ-A2 基因在不同突变体中的表达模式分析

3.3.3.6 Prxs家族prxQ-A3 基因在不同突变体中的表达模式分析

3.3.3.7 Prxs家族prxQ-B基因在不同突变体中的表达模式分析

3.4 讨论

第四章氧化还原稳态维持相关基因在蓝藻生物钟节律性调控中的功能研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 方法

4.3 结果

4.3.1 dCikA、dTR和 dGS单敲除系突变体的获得

4.3.2 dCys/dCikA、dCys/dTR和 dCys/dGS双敲除系突变体的获得

4.3.3 dCikA与 d2Cys/dCikA敲除突变体的生物钟节律性表型分析

4.3.4 dTR与 d2Cys/dTR敲除突变体的生物钟节律性表型分析

4.3.5 dGS与 d2Cys/dGS敲除突变体的生物钟节律性表型分析

4.4 讨论

第五章 2-Cys Prx和 CikA互作检测

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 材料

5.2.2 方法

5.2.2.1 主要试剂和仪器

5.2.2.2 载体的构建

5.2.2.2.1 PCR体系及程序

5.2.2.2.2 目的基因酶切及与载体的连接

5.2.2.2.3 目标基因PCR扩增产物分别与BiFC载体及酵母双杂交质粒载体连接的重组质粒产物转化大肠杆菌DH5α

5.2.2.3 BiFC重组质粒注射烟草

5.2.2.4 酵母细胞的转化

5.3 结果

5.3.1 携带2-cys prx和 cikA-BiFC重组质粒工程农杆菌对本氏烟草瞬时转化的实验结果

5.3.1.1 载体构建过程

5.3.1.2 2-Cys Prx和 CikA相互作用的双分子荧光互补实验激光共聚焦显微镜检测结果

5.3.2 酵母双杂交实验结果

5.3.2.1 酵母双杂交载体的构建

5.3.2.2 酵母双杂交在二缺和四缺培养基上的筛选结果

5.4 讨论

结论

参考文献

攻读硕士学位期间取得的科研成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 罗笑

导师: 赵宇玮

关键词: 蓝藻,生物节律,氧化还原稳态,蛋白互作

来源: 西北大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西北大学

分类号: Q418

总页数: 125

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