代谢工程改造大肠杆菌积累L—酪氨酸与发酵条件优化

论文摘要

L-酪氨酸（L-Tyrosine,Tyr）是三大芳香族氨基酸之一,在食品、饲料、医药和化工等领域有广泛应用。由于L-酪氨酸代谢途径和调控方式较为复杂,因此合成效率受到制约。本研究是在实验室构建的一株L-苯丙氨酸生产菌的基础上对其进行分子改造,使其能够过量积累L-酪氨酸。此外,对菌株培养条件和发酵过程进行优化,确定了最佳发酵条件和补料方式,进一步强化大肠杆菌合成酪氨酸的能力。本文主要研究结果如下:（1）L-酪氨酸重组菌株的构建和酪氨酸转运系统的改造。通过连续传代消除大肠杆菌（Escherichia coli）WSH-Z06（pAP-B03）菌株的pAP-B03质粒,获得E.coli HGX菌株。构建热诱导表达质粒pAP-aroGfbr-tyrAfbr,转化E.coli HGX菌株获得了热诱导型菌株E.coli HGXP,摇瓶发酵L-酪氨酸产量为3.12 g?L-1,较E.coli HGX菌株提升了110.8%。在E.coli HGXP菌株的基础上分别构建酪氨酸转运系统基因敲除菌E.coli HGPP（HGXPΔaroP）和HGEP（HGXPΔtyrP）,摇瓶发酵结果表明,E.coli HGPP和HGEP单基因敲除菌L-酪氨酸产量分别达到3.74 g?L-1和3.45 g?L-1。对L-酪氨酸转运系统基因敲除菌的诱导温度进行了优化,结果表明38°C为最佳诱导温度。在3 L发酵罐上进行补料分批发酵实验,E.coli HGPP和HGEP单基因敲除菌L-酪氨酸产量进一步提高至44.5g?L-1和35.1 g?L-1。（2）大肠杆菌L-酪氨酸竞争途径、阻遏调控及前体供应的改造。分别在E.coli HGXP菌株的基础上构建了L-苯丙氨酸竞争代谢途径基因pheA、L-色氨酸竞争代谢途径基因trpD、全局性调控蛋白编码基因tyrR及丙酮酸激酶编码基因pykF单基因敲除菌。摇瓶发酵结果表明,在构建的4株单基因敲除菌中,pheA单基因敲除菌E.coli HSP（HGXPΔpheA）的L-酪氨酸产量最高,为4.42 g?L-1。在pheA单基因敲除菌E.coli HSP的基础上进一步敲除tyrR基因,构建pheA/tyrR双基因敲除菌E.coli HRP（HGXPΔpheA/tyrR）,L-酪氨酸产量进一步提高到了5.84 g?L-1。在pheA/tyrR双基因敲除菌E.coli HRP的基础上进一步敲除trpD基因和pykF基因,构建多基因敲除菌HRDP（HGXPΔpheA/tyrR/trpD）和HKP（HGXPΔpheA/tyrR/pykF）,但由于菌株的生长受到影响,L-酪氨酸产量并没有提高。（3）E.coli HRP菌株产L-酪氨酸发酵罐发酵优化。在3 L发酵罐上对L-酪氨酸生产菌E.coli HRP的诱导时间、诱导温度以及补料方式进行了优化。发现在对数生长中期,即OD600=25.60左右时诱导,L-酪氨酸产量最高,为40.23 g?L-1。在38°C的温度条件下进行诱导可以进一步提高L-酪氨酸的产量,达到了48.69 g?L-1。考察了几种不同的葡萄糖流加方式对L-酪氨酸合成的影响,发现当采用速率线性下降的葡萄糖流加方式时,L-酪氨酸产量进一步提升至55.54 g?L-1,转化率为0.252 mol?mol-1,生产强度为1.385g?L-1?h-1。在15 L发酵罐上进行发酵,E.coli HRP菌株的L-酪氨酸产量可以达到52.33g?L-1,和在3 L发酵罐上发酵时的生产水平相当。

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Abstract

第一章绪论

1.1 L-酪氨酸的研究背景

1.1.1 L-酪氨酸的性质

1.1.2 L-酪氨酸的应用

1.1.3 L-酪氨酸的生产方法

1.2 L-酪氨酸的生物合成及进展

1.2.1 L-酪氨酸生产菌株

1.2.2 L-酪氨酸的生物合成途径

1.2.3 L-酪氨酸微生物发酵法研究进展

1.3 增强L-酪氨酸合成的代谢调控策略

1.3.1 提高前体物质的供应量

1.3.2 阻断竞争代谢途径

1.3.3 解除关键酶的反馈抑制

1.3.4 解除调控蛋白TyrR的阻遏

1.3.5 调节转运系统

1.4 课题背景与意义

1.5 课题研究内容

第二章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 试剂和培养基

2.1.3 主要仪器设备

2.2 分子生物学操作

2.2.1 重组质粒的构建

2.2.2 转化子的筛选与鉴定

2.2.3 重组质粒的序列分析

2.2.4 消除pAP-B03质粒

2.2.5 使用CRISPR-Cas9系统敲除大肠杆菌目的基因

2.2.6 质粒的提取

2.2.7 大肠杆菌电转化感受态细胞的制备

2.2.8 DNA片段的电转化

2.2.9 基因敲除菌消除质粒

2.3 培养方法

2.3.1 种子培养

2.3.2 摇瓶发酵培养

2.3.3 发酵罐发酵培养

2.4 分析方法

2.4.1 菌体浓度的测定

2.4.2 葡萄糖浓度的测定

2.4.3 发酵液样品的处理方法

2.4.4 L-酪氨酸的测定

2.4.5 乙酸的测定

第三章结果与讨论

3.1 重组菌株的构建及酪氨酸转运系统基因敲除对酪氨酸生产的影响

3.1.1 E.coli HGX及HGXP菌株的构建

3.1.2 E.coli HGX及HGXP菌株的摇瓶发酵

3.1.3 L-酪氨酸转运系统基因敲除菌的构建

3.1.4 L-酪氨酸转运系统基因敲除对发酵生产L-酪氨酸的影响

3.1.5 L-酪氨酸转运系统基因敲除菌的诱导温度优化

3.1.6 L-酪氨酸转运系统基因敲除菌的补料分批发酵

3.2 大肠杆菌L-酪氨酸竞争途径、阻遏调控及前体供应的改造

3.2.1 pheA、trpD、tyrR及pykF单基因敲除菌的构建

3.2.2 pheA、trpD、tyrR及pykF单基因敲除菌的摇瓶发酵

3.2.3 双基因及多基因敲除菌的构建

3.2.4 双基因及多基因敲除菌的摇瓶发酵

3.3 E.coli HRP菌株产L-酪氨酸发酵罐发酵优化

3.3.1 诱导时间对发酵生产L-酪氨酸的影响

3.3.2 诱导温度对发酵生产L-酪氨酸的影响

3.3.3 葡萄糖流加方式对发酵生产L-酪氨酸的影响

3.3.4 15L发酵罐发酵

主要结论与展望

主要结论

展望

致谢

参考文献

附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王钦

导师: 周景文

关键词: 大肠杆菌,酪氨酸,代谢工程,基因敲除

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

基金: 国家优秀青年科学基金(No.21822806),国家自然科学基金(No.31770097)

分类号: TQ922.9

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