产β-1,3—葡聚糖酶放线菌的分离及酶基因克隆表达

论文摘要

β-1,3-葡聚糖酶是降解β-1,3-葡聚糖产生具备药理活性的β-葡聚糖寡糖的有效酶工具。茯苓中多糖水解成寡糖具有抗肿瘤及免疫调节活性,利用β-1,3-葡聚糖酶可水解茯苓中β-1,3-糖苷键为主链的可溶性或不可溶性多糖,形成寡糖进而促进生物活性。因此,筛选产β-1,3-葡聚糖酶菌株、研究β-1,3-葡聚糖酶降解茯苓多糖的应用具有一定的意义与价值。论文基于高通量测序技术的应用,调查了土样中微生物群落的分布及多样性;从土样中分离分泌葡聚糖酶的菌株并鉴定;利用分子手段获得β-1,3-葡聚糖酶探究了其对茯苓多糖的降解;取得了以下主要结论:（1）高通量测序数据的分析结果显示,茯苓培植土（FTL1）中放线菌门（Actinobacteria）所占比例为18.64%,其丰度仅次于变形杆菌门（Proteobacteria）,且放线菌门中链酶菌属（Streptomyces）和节杆菌属（Arthrobacter）各占比为1.90%和0.78%。因此本研究确定从FTL1筛选降解β型葡聚糖放线菌。（2）选用相应的筛选培养基,从FTL1中分离了58株放线菌,其中11株具有β-1,3-葡聚糖酶活性。首次发现和报道了来自北里孢菌属（Kitasatospora）菌株SYBCQL具有β-1,3-葡聚糖酶活性。来自链酶菌属的菌株SYBC17产酶活力最高,为1.02 U·mg-1。应用菌株SYBC17发酵了茯苓,最佳发酵时间为96 h,此时SYBC17对茯苓中多糖的降解效果最好。（3）克隆和分析了菌株SYBC17的两个编码β-1,3-葡聚糖酶的基因17-W和17-Q,菌株SYBCQL的基因QLK1,在分子水平验证了分离的菌株产β-1,3-葡聚糖酶。重组酶QLK1,17-W和17-Q的酶活性分别为65.82 U·mg-1,132.90 U·mg-1和14.70 U·mg-1。重组酶17-W产率最高。（4）生物信息学分析显示,三个酶蛋白全为糖苷水解酶家族16,分别由一个催化结构域及一个碳水化合物结构域组成,其中QLK1与17-W的碳水化合物结构域为CMB13,而17-Q对应结构域为CMB6。三个同源建模的酶蛋白与β-葡寡糖四糖成功实现分子对接,β-葡寡糖四糖均出现在催化活性中心的底物结合区。（5）酶学性质研究发现,QLK1的最适温度是60°C,17-W和17-Q的最适作用温度均为55°C。QLK1和17-Q的最适pH是5.5,而17-W的最适pH是6.0,三个酶的热稳定性和pH稳定良好;三个重组酶对底物的亲和力由大到小的排序依次是17-W、QLK1、17-Q。（6）TLC分析重组酶对茯苓多糖的降解作用显示,重组酶17-W降解后主要产生两种类型的寡糖,17-Q降解后主要产生三种类型的寡糖。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吴秋兰

导师: 廖祥儒

关键词: 葡聚糖酶,高通量测序,基因克隆及表达,放线菌

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: Q78;TQ920.1

总页数: 52

文件大小: 4955K

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