一、HBV拉米夫定耐药株多聚酶墓因变异的研究（论文文献综述）
范晶华[1]（2019）在《慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究》文中认为[目 的]前期研究聚焦早期准种变化对短期（一般3年或以下）抗病毒治疗疗效的影响。本研究前瞻性观察慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者（慢性乙型肝炎及乙肝病毒相关肝硬化患者）核苷（酸）类似物（NAs）长期（近10年）抗病毒治疗过程中的疗效及对临床结局的影响,研究抗病毒治疗关键时间节点的乙型肝炎病毒准种异质性及其进化机制,进一步明确抗病毒治疗效果差异的病毒学机制。[方法]本研究的第一部分纳入107例接受核苷（酸）类似物治疗的慢性HBV感染者开展为期111.83月的前瞻性、开放性、观察性的真实世界研究。入组患者随机分为恩替卡韦组（治疗药物为恩替卡韦）和非恩替卡韦组（治疗药物为拉米夫定、阿德福韦酯或替比夫定）。每24～48周进行一次随访,收集患者临床资料,分析长期抗病毒治疗后病毒学、生化及血清学应答情况及对临床结局的影响。本研究第二部分采用第一部分的24例慢乙肝患者进行HBV准种研究。首先,我们将研究对象分为三组（三组间无配对关系）,即未治疗组、治疗1年组和治疗10年组（病毒学突破组）,分别取不同时期的患者血清进行HBV准种研究。对于治疗1年组,我们根据患者治疗1年以后病毒应答的时间情况,分为A组（1年<HBV应答时间<3年）和B组（3年<HBV应答时间<6年）。采用PCR产物克隆测序的方法对逆转录酶（reverse transcriptase,RT）区准种进行分析,比较不同治疗时间点的HBV准种差异,探讨核苷（酸）类似物治疗1年时HBV准种的特征与之后病毒学应答的关系及RT基因的准种进化规律。本研究第三部分对一例乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B surface Antigen,HBsAg）和抗-HBs共存的HBV准种基因组进行克隆、测序、生物信息学比较及荟萃分析。[结 果]第一部分:经过长期NAs抗病毒治疗,HBVDNA的对数值（log10 IU/mL）治疗后降为 1.28（1.28,1.40）IU/mL 低于治疗前的 6.92（5.06,7.89）IU/mL（P<0.05）,恩替卡韦组较非恩替卡韦治疗组下降幅度更大（P<0.05）。随访结束时,病毒学突破人数为28人,突破率为26.17%,恩替卡韦组与非恩替卡韦组无差异（P>0.05）。治疗1年时HBV DNA不可测为病毒学突破的保护因素（HR=0.235（0.103,0.538）,P<0.05）。67.9%患者 HBsAg 定量低于 1500 IU/ml,6.54%（7例）患者HBsAg消失并于治疗24～48周时获得早期病毒学应答。乙肝病毒e抗原（Hepatitis B e Antigen,HBeAg）消失率为 71.21%,血清转换率为 40.91%。患者HBeAg消失与基线HBV DNA、ALT水平、HBV DNA转阴时间无关（P>0.05）。6 例患者（5.61%,6/107）发生恶性肿瘤,其中 3 例（2.80%,3/107）发生肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）、均为恩替卡韦治疗患者。APRI指数治疗后为 0.44（0.31,0.56）,低于治疗前 1.05（0.53,1.75）（P<0.01）,随访结束后患者肝硬度值为4.9（4.0,6.2）KPa。第二部分:我们采用24例慢乙肝患者451条HBV RT克隆序列用于下游分析,研究不同抗病毒效果患者的病毒学机制,结果如下:1.A组40%（2例）患者检测到耐药突变,B组75%（6例）患者检测到耐药突变,治疗10年组50%（3例）患者检测到耐药突变。B组和治疗10年组均有50%的患者积累了插入、缺失或终止密码子突变。2.在RT基因的核苷酸和氨基酸水平,治疗1年组的复杂度均显着高于未治疗组（P<0.05）,而且治疗1年或10年组的平均遗传距离均显着高于未治疗组（P<0.05）。在RT基因的核苷酸水平,A组复杂度（Sn=0.9734）均显着高于 B 组（Sn=0.8875,P=0.0393）和治疗 10 年组（Sn=0.8524,P=0.0141）。A组和B组的平均遗传距离、平均同义替换数目及平均非同义替换数目水平相当,均低于治疗10年组,但无统计学意义（P>0.05）。在RT基因的氨基酸水平,A组复杂度（Sn=0.8874）显着高于治疗10年组（Sn=0.7098,P=0.0473）,但三组间的平均遗传距离无显着差异（P>0.05）。3.与治疗1年组（A组和B组）相比,未治疗组和治疗10年组的系统进化树具有较为简单的拓扑结构。治疗1年组（A和B组）平均枝长（0.0029±0.00029）显着大于未治疗组（0.0012±0.0003,P=0.0137）。A 组平均枝长（0.0028±0.0005）和 B 组的平均枝长（0.003±0.0004）均显着大于治疗10年组（0.002±0.0004）（P<0.001）,但A组和B组的平均枝长差异不显着（P=0.6368）。4.我们对三组患者HBVRT的选择压力（ω=dN/dS）进行分析。结果表明,三组患者HBV均经历了正选择,治疗10年组积累了更多的正选择信号。在基因型B、C及B/C中,三组患者具有相似的ω值分布趋势。在B/C基因型中,A组的选择压力（ω=0.296±0.0332）和B组的选择压力（ω=0.291±0.0469）没有差异,均低于治疗10年组（ω=0.5679±0.1722）。5.治疗1年时RT准种复杂度（核苷酸水平）与相应的HBV DNA载量呈负相关（P=0.0163,R=-0.6493）。RT的准种复杂度（核苷酸和氨基酸水平）与相应的ALT 水平呈负相关（P=0.0437,R=-0.5661;和 P=0.0117,R=-0.673）。平均遗传距离、平均同义替换数和平均非同义替换数与相应的HBV DNA载量、ALT水平无统计学相关性。第三部分:本研究分析1例HBsAg和抗-HBs共存的基因型为Ⅰ型的慢性乙型肝炎患者HBV准种基因组特征,该病毒准种基因组具有高度复杂的准种异质性和高频的HBsAg突变,其中69%的克隆发生PreS缺失和HBsAg氨基酸变异。Meta分析结果表明,PreS缺失与HBsAg和抗-HBs共存具有相关性,总体风险估值为 4.09（95%CI（2.18,7.68））。[结 论]NAs长期抗病毒治疗可以使患者不同程度获益,与HBV准种异质性密切相关。在抗病毒药物压力下,HBVRT准种的异质性与核苷（酸）类似物抗病毒治疗应答早晚有关,该基因的准种的高复杂度可能提示治疗应答佳。在治疗1年时,高复杂度的HBV准种,有利于HBV DNA和ALT水平下降,但低水平的ALT反而不利于HBVDNA清除。抗病毒治疗效果差的患者积累了较多的耐药突变、缺失、或终止密码子突变,提示这些突变不利于病毒学应答,可能与免疫逃逸有关。治疗10年组具有较为简单的进化模式与更多的正选择信号,提示这些变化可能与病毒学突破有关。个案HBV基因组准种分析与Meta分析表明,高频的preS1缺失,与HBsAg与抗-HBs共存相关。
滕旭,林乐勋,陈丽玲,梁爽,徐晖,谷鸿喜[2]（2015）在《乙型肝炎病毒核苷类似物交叉耐药株RT区变异分析》文中研究说明目的研究多种核苷类似物（NAs）序贯治疗产生交叉耐药的患者体内乙型肝炎病毒（HBV）RT区变异位点和变异类型。方法筛选6例临床上对两种或两种以上NAs产生交叉耐药的患者,并从患者血清中获取HBV交叉耐药株DNA,进行全基因克隆和测序,从而分析其变异特点和规律。结果经测序鉴定,6位患者体内HBV基因型均为C型,产生交叉耐药的相关性变异以rtM204V/I（YMDD）变异为主（50%）,部分YMDD变异株伴有rtL180M变异（16.7%）、其他伴随变异包括rtV173L（16.7%）,rtL80I（16.7%）。此外,还发现RT区次要变异伴随位点rtL269I（40%）、rtQ333K（56.7%）、rtH337N（56.7%）。结论RT区次要变异伴随位点rtL269I、rtQ333K、rtH337N的出现可能增强了HBV YMDD变异株在体内的复制能力,并对交叉耐药准种所占比例起到了放大的效果,从而导致本研究中6例患者出现对拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦和替比夫定产生多重耐药。
朱瑞[3]（2014）在《使用核苷（酸）类似物治疗的慢性乙型肝炎患者HBV耐药变异分析》文中指出目的：分析当前本地区使用核苷（酸）类似物（NA）治疗的慢性乙肝患者（CHB）体内HBV RT区基因耐药特点。方法：收集2010年12月至2012年8月天津市某医院肝炎门诊就诊的经NA治疗的208例CHB患者血清标本,应用nPCR法扩增HBV全长RT区,纯化nPCR产物直接测序后分析11个经典耐药位点（rtL80、rtI169、rtV173、rtL180、rtA181、 rtT184、rtA194、rtS202、rtM204、rtN236和rtM250）的氨基酸变异情况。对本地区使用NAs抗病毒治疗的CHB患者体内病毒RT区11个经典耐药变异位点进行细致研究,分析其流行特点及变异模式,为深入认识本地区当前HBV耐药株流行趋势与规律及临床合理用药提供基础数据。结果：208例标本中有203例巢式PCR扩增阳性并测序成功,经分析显示有75例有耐药变异,其中B基因型14例（18.67%）,C基因型61例（81.33%）,总体耐药变异率为36.94%；在11个经典的耐药变异中共检测到6种耐药变异位点,分别是rtL80、rtV173、rtL180、rtA181、rtM204和rtN236,其中rtM204检出率最高65.33%（49/75）,其余位点检出率分别为rtL80（23/75）,rtV173（6/75）, rtL180（28/75）,rtA181（19/75）,rtN236（5/75）。结论：本研究对象中有36.94%的患者体内HBV毒株发生耐药变异,并呈现出复杂的变异类型,监测HBV基因耐药变异位点及其模式,有利于优化治疗方案从而避免病情恶化。
卢丹,吕铁锋,章松平,郭晓凤,武静,吴菲,刘斐[4]（2013）在《拉米夫定耐药株感染者基因型、HBV DNA及多聚酶P区基因变异的关系》文中研究说明目的分析拉米夫定耐药株感染者的基因型、HBV DNA及多聚酶P区基因变异的关系。方法应用PCR扩增和直接测序法检测83例拉米夫定耐药患者HBV基因型、HBV DNA及多聚酶P区的基因变异。结果 83例拉米夫定耐药患者B基因型26例,C基因型57例,B型YIDD变异率69.2%（18/26）、YVDD变异率30.8%（8/26）,C型YIDD变异率63.2%（36/57）、YVDD变异率33.3%（19/57）,B、C基因型发生YMDD变异模式无统计学差异（P>0.05）;B型rtM204I突变率53.8%（14/26）,综合变异率46.2%（12/26）,C型rtM204I变异率26.7%（15/57）,综合变异率73.7%（42/57）,B、C基因型变异位点类型有统计学差异（P<0.05）;耐药变异时C型HBV DNA水平（6.60±1.42）lg拷贝/毫升高于B型（5.88±1.46）lg拷贝/毫升,YIDD变异时C型（6.40±1.48）lg拷贝/毫升、B型（5.68±1.32）lg拷贝/毫升,YVDD变异时C型（6.18±1.87）lg拷贝/毫升、B型（6.82±1.45）lg拷贝/毫升;rtM204I变异时B型（6.12±1.45）lg拷贝/毫升、C型（5.57±1.45）lg拷贝/毫升（P>0.05）;综合变异时C型（6.68±1.51）lg拷贝/毫升,B型（5.76±1.57）lg拷贝/毫升（P<0.05）。结论 C基因型拉米夫定耐药发生率高于B型;基因型与变异位点类型有关,与YMDD变异模式无关;耐药变异时HBV DNA水平C型高于B型,与综合变异有关,与YMDD变异模式无关。
邓孝林[5]（2013）在《乙型肝炎病毒准种在恩替卡韦补救治疗中的动态演变》文中研究说明目的：研究拉米夫定耐药后乙型肝炎病毒准种在恩替卡韦补救治疗中的动态演变及其临床意义。方法：1、提取21例拉米夫定耐药患者在恩替卡韦补救治疗过程中的8个时间点（0、24、48、72、96、120、144、168周）血清中的HBV DNA。2、用巢式聚合酶链反应（PCR）法在5个时间点（0、24、48、96、144周）扩增HBV DNA聚合酶基因RT区。3、用克隆测序法在5个时间点（0、24、48、96、144周）对RT区准种存在形式及分布进行分析。结果：21例患者在恩替卡韦补救治疗中均检测到拉米夫定耐药株L180M±M204V/I，且出现了3种不同的HBV准种演变。1、4例患者（A-D）野生株恢复为优势株，且比例达100%，其中3例患者A、B、D最终实现完全病毒学应答，HBV DNA水平低于（PCR）检测下限。2、5例患者（E-I）出现恩替卡韦耐药，检测到恩替卡韦基因型耐药株，且均发生在拉米夫定耐药基因L180M±M204V/I的基础上，治疗结束时，比例达到100%。3、12例患者（J-U）拉米夫定耐药株保持为优势株，全程未发生恩替卡韦耐药，其中5例患者最终实现完全病毒学应答，HBV DNA水平低于（PCR）检测下限。4、4例野生株恢复为优势株的患者（A-D）的HBV DNA水平在治疗结束时显着低于其余17例未发生野生株恢复的患者，差异具有统计学意义（P<0.05）。5例发生恩替卡韦基因型耐药的患者（E-I）的HBV DNA水平在治疗结束时显着高于其余16例未发生恩替卡韦基因型耐药的患者，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：1、野生株恢复为优势株是拉米夫定耐药患者在恩替卡韦补救治疗中治疗反应良好的一项预测指标。2、在恩替卡韦补救治疗中，未发生恩替卡韦基因型耐药的患者最终仍可获得较好的疗效。3、对拉米夫定耐药基因的持续选择与随后出现的恩替卡韦基因型耐药有关。
张迎迎[6]（2013）在《利用PNA-PCR法早期检测乙型病毒性肝炎YMDD耐药变异》文中研究表明研究背景抗病毒治疗是慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B, CHB）治疗的关键。目前应用于抗病毒治疗的药物主要分为两大类：核苷（酸）类似物和干扰素。拉米夫定（LAM, lamivudine）是第一个被批准用于慢性乙型病毒性肝炎治疗的药物,它能够有效的抑制乙型肝炎病毒的复制,可以显着的降低血清中HBV DNA （hepatitis B virus DNA）的水平,促进HBeAg （hepatitis B e antigen）的血清学转换,改善肝脏的炎症活动,延缓或阻止肝脏疾病的进展,降低肝癌（HCC, Hepatocellular carcinoma）的发生率。由于其相对较低的价格,拉米夫定仍然是很多病人进行抗病毒治疗的首选药物,特别是在发展中国家。但是长期治疗过程中产生耐药是抗病毒治疗的一个难题。拉米夫定治疗一年的基因耐药率是14-32%,治疗2年、3年和4年后分别上升到38%、49%和66%。有些病人在出现病毒学突破后发生肝炎的急性恶化,导致肝脏失代偿,甚至是死亡。耐药后继续拉米夫定的治疗将不能获得临床益处。拉米夫定耐药性的产生主要与HBV P基因逆转录（RT）酶区突变有关,这些突变位点大部分位于204位点即YMDD（酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸）基因序列,YMDD基因序列位于DNA聚合酶中心部位,是酶的催化区,与核苷酸的亲和力高,主要的改变是YMDD中M（蛋氨酸）被V（缬氨酸）成为YVDD（rtM204V）或是YMDD中的M（蛋氨酸）被I（异亮氨酸）取代,成为YIDD（rtM204I）也有少部分位于180位点L（亮氨酸）变为M（蛋氨酸）。另外还有相关研究表明,YMDD变异还会影响其他核苷（酸）类似物的药效,因为有共同的耐药位点的缘故,还有可能会引起其他抗病毒药物（如恩替卡韦）的耐药,对于已经发生了rtM204V/I变异的患者,我们应该谨慎的选择治疗方案。YMDD变异的产生使得HBV DNA聚合酶的活性降低,所以新产生的突变的准种的复制能力低于野生株,属于非优势株,但是随着抗病毒药物的应用,在抗病毒药物及机体免疫力的作用下野生株即优势株的的复制能力逐渐被抗病毒药物抑制,复制能力降低,野生株的数量逐渐减少甚至消失,剩余的变异的突变株转为优势株,但是因为这种变异株的聚合酶区发生突变,拉米夫定对这种变异株的复制没有抑制作用,变异的病毒开始继续复制,随着复制的进行,逐渐占主导地位,使患者体内的病毒数量激增,导致患者HBV-DNA和ALT的水平出现反弹。因此YMDD变异的快速检测对于及早发现耐药变异、避免耐药的发生、对患者实施个体化治疗方案具有重要意义。目前用于临床耐药检测的方法有很多种,PCR产物直接测序法（direct PCR sequencing）, PCR产物克隆测序法,聚合酶-限制性片段长度多态性,反向杂交法（reverse hybridization assay）,基因芯片（gene chip）,限制片段质谱多态性技术（restriction fragment mass polymorphism,RFMP）等,目前被大家公认的耐药检测的是PCR产物直接测序法,Keefffe等认为PCR产物直接测序法应作为基因型耐药检测的金标准。但是该方法的灵敏度低,最低检测限为20%,即突变株数量需达到整个病毒群的20%时,才能检测到。因为存在这种缺陷,所以不能尽早发现病人的耐药突变,所以需要一种灵敏性及特异性高的方法来及早发现突变来治疗病人的临床用药。PNA（peptide nucleic acid,PNA）即肽核酸是于1991年由哥本哈根大学的Riso实验室的丹麦科学家Nielsen等首先设计合成。PNA的骨架由重复排列的N-（2-氨乙基）甘氨酸单位通过酰胺键连接而成,嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基连接于骨架的氨基N上,由于不含有磷酸基团,故不带电,为中性,与靶序列杂交时排斥力很小,形成的复合物非常稳定。PNA的特性主要包括一下几方面：1、PNA与DNA单链或RNA杂交体（PNA/DNA）的稳定性较高：与相应DNA双链相比,每增加一个碱基对,PNA/DNA解链的Tm值将增加1℃（O.lmol/l的NaCl中）。例如,一15碱基对DNA双链的解链温度为54℃,相应PNA/DNA的解链温度就达到69℃。2、复合物的稳定性不受盐浓度的影响：PNA/DNA杂交形成的双螺旋结构的稳定性与介质的盐浓度无关。在盐离子强度较低时,PNA能与靶序列的单链DNA分子杂交,形成稳定的复合物并且复合物的Tm值较高。PNA/DNA、PNA/RNA的结合比相应DNA/DNA、DNA/RNA的结合更稳定,这是由PNA和DNA链之间缺乏静电排斥所致。在低离子强度环境下,特别是在无Mg2+环境中,PNA也能与DNA杂交。利用这一特性,可通过适当调整介质的离子浓度设计PNA探针,与标本中的DNA或PNA杂交,这一应用主要是用于靶序列中点突变的检测。3、PNA与互补DNA杂交结合时有很高的专一性,PNA/DNA碱基错配杂交分子的不稳定性比DNA/DNA碱基错配杂交分子的不稳定性更高。例如：在混合的PNA/DNA杂交分子中,如果15个碱基对中有一对错配,则其解链温度（Tm）下降8-20℃（平均降低15℃）,两对碱基错配则完全不能杂交,而相应的DNA/DNA杂交分子中,一个碱基对配错,解链温度只降低4-16℃,（平均降度11℃）。因此,与DNA探针相比,较短的PNA探针可以进一步提高探针杂交的专一性。本研究正是利用PNA的这些特性,设计出针对HBV YMDD野生株的PNA探针。PNA探针与靶DNA单链结合后稳定性高,且解链温度高。如果在PCR反应中加入PNA探针,YMDD野生株DNA/PNA杂交体由于完全配对而具有较高的解链温度；而变异株的DNA/PNA杂交体由于存在一个碱基的不配对而具有较低解链温度。设计PCR的复性温度高于变异株DNA/PNA杂交体的解链温度,而高于野生株DNA/PNA杂交体的解链温度；就能抑制YMDD野生株的扩增,从而选择性的扩增变异株。实验目的1.本研究拟建立一种更加灵敏的检测HBV YMDD突变的方法-PNA-PCR法,通过该方法检测已知病毒含量的不同比例混合的质粒的突变,与直接测序法相比较,验证新方法的灵敏性及特异性。2.通过对临床核苷类药物治疗的病人耐药检测以及未治疗的慢性乙型病毒性肝炎患者预存耐药的检测,验证新方法在抗病毒治疗过程中耐药检测的优势。材料与方法1.样本来源：选用100例南方医院2011年3-5月门诊测序病人的标本,上述患者均接受拉米夫定治疗且临床怀疑或检测耐药,另外收集100例南方医院感染内科门诊2012年7月-11月未使用核苷（酸）类药物治疗的患者血清,及20例健康献血者的血清,上述患者HBeAg阳性或阴性,无HIV,HCV,HDV等感染史,收集所有患者血清,储存于-30℃。2. HBV DNA提取：收集患者血清,使用凯杰公司的QIAamp DNA Blood MiniKit,根据操作说明从200μl血清中提取HBV DNA用于下一步操作。3. HBV DNA逆转录酶区（Reverse Transcriptase region, RT）扩增：分别使用直接测序法及PNA-PCR法对HBV RT区进行扩增,直接测序法的产物送测序,PNA-PCR法的结果直接是用琼脂糖凝胶电泳法来观察。4,。统计学分析：所有的数据均使用SPSS13.0统计软件进行分析,率的比较用χ2检验,P<0.05时认为差异具有统计学意义。结果1.新的耐药检测的方法PNA-PCR法的灵敏性及特异性与临床常规测序方法的比较评价：在病毒含量较低的情况下,直接测序法只能检测到10%的突变,而PNA-PCR法则可以检测到0.01%的突变,检测的灵敏性提高1000倍；在病毒含量较高的情况下,直接测序法可以检测到0.01%的突变,PNA-PCR法可以检测到0.001%的突变,检测的灵敏性提高10倍。总之,直接测序法相比PNA-PCR法可以将耐药突变检测的灵敏性提高10～1000倍。2. PNA-PCR法在临床耐药检测中的应用：.（1）.使用核苷（酸）类似物治疗的患者HBV YMDD耐药的检测：在100例患者中有15例患者结果为PCR阴性,剩余85例患者用直接测序法检测突变的结果为34例（YIDD为21例,YVDD为11例,YIDD+YVDD为2例）,阳性率为40.0%。PNA-PCR法检测突变结果为73例（YIDD为40例,YVDD为23例,YIDD+YVDD为10例）,阳性率为85.9%,较直接测序法检测的灵敏度大幅度提高。（2）未使用核苷（酸）类似物治疗的患者HBV YMDD耐药检测：在100例未经核苷（酸）类似物治疗的患者中有21例患者使用PNA-PCR法检测出存在YMDD自然突变阳性率为21%,20例健康献血者的血清分别使用PNA-PCR法及PCR产物直接测序法检验,均未检测到乙肝病毒,两种方法的特异性好,未出现假阳性。结论1、PNA-PCR法在检测乙肝病毒YMDD耐药突变种具有较高的灵敏性及特异性,尤其是在血清低病毒拷贝是,与直接测序法相比,PNA-PCR法具有更高的灵敏性,检测差异明显；2、PNA-PCR PNA-PCR法可以检测出万分之一的rtM204I或rtM204V耐药突变株,从而可以提前监测到耐药准种的发生,为临床抗病毒治疗中耐药准种的发生提供重要指标。3、未经治疗的HBV感染的患者体内存在YMDD的自然变异株,但是耐药突变株的存在对于以后患者以后能否使用拉米夫定治疗,还需要进一步研究。
刘妍[7]（2012）在《乙型肝炎病毒基本核心启动子/前核心区和逆转录酶区变异的临床特点与意义研究》文中指出研究背景：乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染可引起多种临床表现，包括无症状HBV携带状态、急性乙型肝炎、轻中度或重度慢性乙型肝炎，并可进一步发展为肝硬化、肝细胞癌和慢加急性肝衰竭。我国有9300万慢性HBV感染者，其中慢性乙型肝炎患者约2000万人，乙肝肝硬化患者约400万人，每年约28万人死于肝细胞癌。而慢加急性肝衰竭患者每年可造成2万多人死亡，其发生与机体对感染病毒产生过强的免疫应答相关，而病毒基因变异可能是引起机体免疫应答异常的一个重要因素。HBV具有高变异特性，虽是DNA病毒，其复制却与逆转录病毒类似存在一个RNA中间体的逆转录过程，而参与此过程的HBV DNA多聚酶/逆转录酶（reverse transcriptase,RT）缺乏严格的校对功能，使病毒复制过程中的碱基错配率明显高于其他DNA病毒。HBV也是高复制率病毒，每天病毒基因组中每个碱基都有发生所有碱基替换的可能。此外，HBV的复制模板共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）半衰期长，稳定存在于感染的肝细胞核中，是HBV持续感染的根本原因。在自然感染状态下HBV是以野生株为优势株的准种群形式存在，根据HBV基因组序列差异分为8种不同的基因型（≥8%）和若干基因亚型（≥4%）。各种基因型HBV的病毒学特点不同，也可影响肝病的临床转归。HBV基因组最常见的热点变异是基本核心启动子（basal core promoter, BCP）区和前核心（precore, PC）区变异。HBV PC区编码的e抗原（hepatitis B e antigen, HBeAg）是一种免疫耐受抗原，而BCP区转录调节HBeAg表达，发生在这两个区的变异可终止或减低HBeAg表达，增强病毒复制力或逃避宿主免疫应答。另一方面，由于HBeAg与HBV核心抗原（HBcAg）共有相同的免疫表位，该区变异也增加了免疫系统对HBcAg的攻击，可能与乙肝进展及重症化相关。研究表明HBV BCP/PC区变异可能与急性重型肝炎的发生相关，但也有不同的研究结果。基因型又可以影响BCP/PC区变异的发生率，增加结果分析的复杂性。关于HBV BCP/PC变异和基因型与慢加急性肝衰竭发生的相关性分析少见报道。本研究的第一部分系统分析了我国临床大样本急性乙肝、轻中度慢乙肝、重度慢乙肝和慢加急性肝衰竭患者的BCP/PC区变异和基因型特点以及临床意义，结果有助于理解HBV病毒学特点在乙型肝炎慢性化、重症化机制中的作用。当前，核苷（酸）类似物是临床最常用的抗HBV感染治疗药物，包括三种核苷类，即拉米夫定（lamivudine, LAM）、恩替卡韦（entecavir, ETV）和替比夫定（tebivudine, LdT），两种核苷酸类，即阿德福韦酯（adefovir dipivoxil, ADV）和富马酸替诺福韦酯（tenofovirdisoproxil fumarate, TDF），前四种已在我国临床批准使用。这些药物通过直接靶向HBV RT区而发挥抗病毒作用，但均不能从根本上清除感染肝细胞核中持续存在的HBV cccDNA，一旦停药反跳率高，因此需要长期抗病毒治疗。然而长期抗病毒治疗会使病毒在药物压力下获得适应性变异或使预存于准种群中的极少量变异株获得选择性扩增，产生耐药病毒导致治疗失败，成为临床面临的棘手问题。发生在HBV逆转录酶区的耐药变异分为直接降低药物敏感性的原发耐药变异和增强病毒复制力的补偿变异，还有一些与ADV耐药相关的有争议的变异。随着临床上可选择的药物增多，耐药及交叉耐药的风险增加，变异形式也更加多样化。此外，不适当的核苷（酸）类药物序贯使用促进了多重耐药病毒株的产生。已有的关于耐药变异病毒的研究大多来源于一些临床试验研究，用药方式相对固定，研究的样本量有限，但实际上临床用药方式复杂，引起的HBV耐药变异谱有其特有规律，以往尚缺少大样本分析数据。本研究的第二部分系统分析了我国大样本经核苷（酸）类药物治疗的慢性HBV感染者HBV基因耐药谱，并对1例我们新鉴定的针对LAM、ADV和ETV的新型多重耐药HBV变异株的临床演变特点和感染的临床治疗进行动态分析。结果为全面了解我国临床实际治疗中的HBV耐药谱提供新的信息，对于帮助我国HBV耐药管理的规范化具有重要意义。目的：（1）分析临床较大样本急性乙肝、轻中度慢乙肝、重度慢乙肝和慢加急性肝衰竭患者HBV基因型和BCP/PC区变异特点，揭示HBV基因型和BCP/PC区变异在不同病程HBV感染患者的表现特点和与疾病进展的相关性。（2）分析临床较大样本慢性HBV感染者RT区多位点核苷（酸）类似物耐药相关变异及其临床意义，揭示我国临床HBV耐药发生频率、四种核苷（酸）类似物基因型耐药变异特点及多重耐药HBV变异株的演变特点和感染的临床治疗策略。方法：（1）收集182例急性乙肝、325例轻中度慢乙肝、170例重度慢乙肝和298例慢加急性肝衰竭患者血清。提取HBV DNA，应用单管巢式聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR），扩增HBV RT（含S）基因和BCP/PC区基因，对PCR产物进行双向测序。根据RT/S区序列用MEGA4软件进行分子进化树分析确定HBV基因型，用Vector NTI软件比对分析文献报道的具有（潜在）临床意义的10个位点的核苷酸变异，包括BCP区1753、1754、1758、1762、1764、1766和1768位点变异和PC区的1862、1896和1899位点变异。（2）收集1803例经核苷（酸）类似物长期治疗的慢性HBV感染患者血清，扩增HBVRT区全长基因，对PCR产物进行双向测序，分析rt80、rt84、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt214、rt215、rt217、rt233、rt236和rt250共15个位点的耐药相关变异特点。并进一步对1例新型多重耐药HBV感染患者系列血清样本的耐药变异及HBVDNA载量、转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）等指标进行检测，结合克隆测序（>20个克隆/样本/时间点）结果，分析多重耐药HBV株的动态演变规律、表型耐药特点和感染的临床治疗策略。结果：（1）急性乙肝患者HBV B基因型与C基因型比例和BCP/PC区野生株比例显着高于慢性乙肝患者。急性乙肝患者HBV BCP区A1762T、G1764A和前C区G1896A、G1899A的检出率显着低于慢性乙肝患者，但BCP区T1758C的检出率却显着高于慢性乙肝患者，且T1758C变异与A1762T/G1764A变异有相互排斥倾向。与C基因型HBV相比，B基因型HBV BCP区变异频率更低，PC区变异频率相似。在含四种基本BCP/PC变异模式的急性乙肝患者间ALT水平相似，而含PC区变异的慢性乙肝患者ALT水平更高；含有BCP/PC区双变异的急性乙肝患者HBV DNA载量更高，而相应的慢性乙肝患者HBV DNA载量更低；急性乙肝患者的HBeAg阴性率高于慢性乙肝患者，且BCP/PC区双变异的急性乙肝患者HBeAg阴性率更高，而慢性乙肝患者随着BCP/PC区变异的累积HBeAg阴性率呈逐级增高趋势。（2）与慢性乙肝患者相比，慢加急性肝衰竭患者HBV BCP区T1753C/A/G、A1762T、G1764A、C1766T变异频率和前C区G1862T、G1896A、G1899A变异频率显着增高。而且，A1762T/G1764A双联变异和G1896A热点变异频率以及10个分析位点的平均碱基替代数目随着疾病进展（轻中度慢乙肝＜重度慢乙肝＜慢加急性肝衰竭）逐级增高。与C基因型HBV相比，B基因型HBV的BCP区变异频率明显降低，而PC区变异频率明显增高。与HBV BCP区变异不同的是，在上述三种疾病类型中HBV PC区变异均显着影响HBeAg向抗HBe的血清学转换。此外，感染了PC变异株的慢加急性肝衰竭患者比感染了PC野生株的患者病死率明显增高。（3）1803例患者中有560例检出耐药相关变异，其中214例来自490例接受LAM单一治疗的患者，35例来自428例接受ADV单一治疗的患者，5例来自18例接受LdT单一治疗的患者以及306例来自794例接受序贯或联合抗病毒治疗的患者，而在73例接受ETV单一治疗的患者中未检出耐药变异。381例接受LAM耐药后换成ADV继续治疗患者中有36例（9.4%）检出ADV耐药变异，而LAM耐药后加用ADV继续治疗的82例患者中仅1例（1.2%）检出ADV耐药变异。ETV耐药变异不仅在LAM和ETV经治的患者中检出，而且在LAM单一治疗的患者中也检出。tL180M+rtM204I双变异株检出频率在C基因型HBV较B基因型HBV更常见，并且感染了此种双变异株的患者ALT水平明显高于感染了rtM204I单一变异HBV株的患者。值得注意的是，在8例患者中检出多重耐药HBV变异株。（4）我们对1例新型多重耐药HBV变异株感染的慢乙肝患者进行随访，该患者自2002年6月起先后序贯接受了长达116个月的抗病毒治疗，即10个月的LAM与干扰素-α2b联合治疗、23个月的LAM单一治疗、13个月的ADV单一治疗、12个月的ETV单一治疗、12个月的ADV与干扰素-α2b联合治疗、6个月的ADV单一治疗、40个月的ADV加用LAM联合治疗。目前HBV DNA维持检测不到水平，ALT水平正常。克隆测序显示病毒准种池中多重耐药HBV株的动态演变过程，即由最初的野生株，LAM耐药株rtM204I，ADV耐药株rtA181V和rtA181T， LAM耐药株rtL180M+rtM204V， ETV耐药株rtL180M+rtS202G+rtM204V， ADV耐药株rtN236T±rtA181T，多重耐药株rtL180M+rtA181V+rtS202G+rtM204V+rtN236T和rtL180M+rtS202G+rtM204V+rtN236T，到ETV耐药株rtL180M+rtS202G+rtM204V。结论:（1）感染了B基因型HBV、BCP/PC区野生型HBV、BCP区T1758C变异型HBV更易发展为急性乙肝，而慢性乙肝的发生与BCP/PC区变异的累积密切相关。（2） HBV BCP/PC区变异与慢性乙肝的疾病进展呈正相关，BCP/PC区变异HBV感染的慢乙肝患者更易发生重症肝炎以及慢加急性肝衰竭，具有PC变异株的慢加急性肝衰竭患者具有更高死亡风险。（3）虽然仅四种核苷（酸）类药物在我国临床使用，临床上实际抗病毒治疗组合方案多达40余种，HBV耐药变异形式也复杂多样，长期不规范用药促进了耐药及多重耐药HBV变异株的产生，为治疗带来更大的挑战。HBV基因型耐药谱的数据分析对于我国乙肝耐药管理具有重要临床意义。（4）多重耐药病毒是在病毒准种池中复杂的单药和双药耐药病毒基础上产生的。该病例中鉴定的三种新型多重耐药HBV株为国际上首次报道，并且在我国目前TDF未上市的情况下应用LAM与ADV联合治疗可抑制多重耐药HBV株的复制。结果为我国治疗多重耐药HBV感染提供了借鉴。
郑慧珂[8]（2012）在《拉米夫定耐药的慢乙肝患者救援治疗过程中YMDD变异的演化及其对治疗疗效的影响》文中指出研究背景：抗病毒治疗是慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B, CHB）治疗的关键。拉米夫定（LAM, lamivudine）是第一个被批准用于慢乙肝抗病毒治疗的药物,它能有效的抑制乙肝病毒的复制。从而显着的降低血清中HBV DNA （hepatitis B virus DNA）的水平,促进HBeAg （hepatitis B e antigen）的血清学转换,改善肝脏的炎症活动,延缓或阻止肝脏疾病的进展,降低肝癌（HCC, Hepatocellular carcinoma）的发生率。由于其相对较低的价格,拉米夫定仍然是很多病人进行抗病毒治疗的首选药物,特别是在发展中国家。但是长期治疗过程中产生耐药是抗病毒治疗的一个难题。拉米夫定治疗一年的基因耐药率是14-32%,治疗2年、3年和4年后分别上升到38%、49%和66%。有些病人在出现病毒学突破后发生肝炎的急性恶化,导致肝脏失代偿,甚至是死亡。耐药后继续拉米夫定的治疗将不能获得临床益处。所以及时进行救援治疗是至关重要的。阿德福韦（ADV, adefovir）是核苷类似物抗病毒药物的一种,无论体内研究还是体外研究都证实：阿德福韦除了能有效抑制HBV野生株复制外,对拉米夫定耐药的YMDD （tyrosine-methionine-aspartate-aspartate）变异株的复制也有较强的抑制作用,而且对变异株复制的抑制作用可能优于野生株。由于以上的特性,阿德福韦被广泛应用于拉米夫定耐药患者的救援治疗。聚乙二醇干扰素α-2a（派罗欣,Pegasys）是一种长效干扰素,其半衰期长,给药方便,优于传统干扰素。欧洲肝病指南建议聚乙二醇干扰素作为慢乙肝（不论E抗原阴性还是阳性）的一线用药,虽然聚乙二醇干扰素α-2a作为万能治疗方法仍然有一些未解决的疑问,但有研究显示聚乙二醇干扰素α-2a可能为拉米夫定耐药的患者提供了一种新的抗病毒治疗的选择。阿德福韦和聚乙二醇干扰素α-2a均可用做为拉米夫定耐药的救援治疗。但不论是哪种方法,其治疗疗效均不理想,总的来说表现为HBV DNA下降缓慢、耐药率升高、停药后快速反弹等。只有一小部分患者对救援治疗有良好的应答反应。对于应答不佳的这部分患者,不少研究曾从病毒学方面探索其应答不佳的原因。有研究报道拉米夫定耐药的慢乙肝患者在阿德福韦单药救援治疗过程中,大部分YMDD变异株在治疗48周内逆转为野生株。也有研究表明拉米夫定耐药突变的演化可能是影响救援治疗疗效的一个重要因素。但目前还没有系统的研究来阐明拉米夫定耐药突变的逆转在临床抗病毒治疗中的意义。而且,拉米夫定耐药患者在聚乙二醇干扰素治疗过程中YMDD变异的演化尚无报道。所以我们的研究目的是探讨YMDD变异的逆转对救援治疗疗效的影响；并观测在干扰素治疗过程中YMDD变异是否也会发生快速逆转。研究目的：1.研究阿德福韦单药治疗或聚乙二醇干扰素治疗过程中YMDD变异的演化；2.探讨影响YMDD变异逆转的因素；3.探讨YMDD变异的逆转对救援治疗疗效的影响。研究方法：1.样本来源样本来自一项随机对照临床试验（www.controlled-trials.com, ISRCTN79659320）。该临床试验的设计如下：入组的患者均经过INNO-LiPA耐药检测,证实为YMDD变异的拉米夫定耐药患者。所有患者均为HBeAg阳性,以2：1的比例随机分配到A（聚乙二醇干扰素α-2a组）、B（阿德福韦组）两组。A组患者给予聚乙二醇干扰素α-2a180μg/次/周治疗48周,停药后继续随防24周；B组患者给予阿德福韦10mg/次/天治疗72周；所有患者在前12周均联合使用拉米夫定100mg/次/天的治疗。由于部分患者血清样本不足或缺失,本实验最终纳入了124例患者。其中聚乙二醇干扰素a-2a组45例,阿德福韦组79例。2.HBV DNA抽提取基线、12周、24周、48周、72周等时间点的系列血清,使用DNA抽提试剂盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit）严格按照说明从血清（每个血清样本使用量为200μl）中提取HBV DNA以备下一步实验使用。3.HBV聚合酶基因的扩增和测序巢式PCR（Sugauchi et al）扩增HBV RT区,使用第二轮PCR纯化产物进行直接测序（Invitrogen Ltd.ShangHai China）4.测序结果的分析从Gen-Bank中下载所有基因型的HBV DNA全序作为参考序列,使用CLUSTAL-W的方法将测序的结果与A-G基因型的参考序列进行同源性比对。用HBV S基因做进化树来进行基因分型。所有序列的比对均使用MEGA5.0软件分析包进行,序列峰图检验采用Chromas软件进行,RtM204V/I变异的判断采用Mutation surveyor3.0软件识读并进行人工确认。5.统计分析所有数据均使用SPSS17.0统计软件（version17.0,SPSS Inc.,Chicago,IL）进行分析,率的比较用χ2检验或者Fisher确切概率检验分析。定量资料用两独立样本的t检验进行分析。累积YMDD变异逆转率计算采用Kaplan-Meier法,累计YMDD变异逆转率的比较采用log-rank（Mantel-Cox）检验进行分析。所有结果均采用双侧检验,P<0.05时认为差异具有统计学意义。结果：1.救援治疗过程中YMDD变异的演化1.1救援治疗过程中YMDD变异的逆转率YMDD变异的逆转定义为在某个时间点,用直接测序法检测到病毒准种以HBV野生株为优势株。如果检测到野生株和变异株混合感染,则按照优势株的结果进行分析。聚乙二醇干扰素α-2a组患者12、24、48和72周的YMDD变异逆转率分别为：7%（3/45）、53%（24/45）、73%（33/45）、91%（41/45）。阿德福韦组患者12、24、48和72周的YMDD变异逆转率分别为：6%（5/79）、38%（30/79）、52%（41/79）、57%（45/79）。1.2YMDD变异的逆转和adefovir耐药突变的发生在救援治疗过程中,阿德福韦组患者有4例发生了A181T/V耐药突变,其中3例为A181T变异,1例为A181V变异,救援治疗1年的耐药发生率大概为5.1%。值得注意的是4例A181T/V耐药变异均发生在YMDD变异逆转后。1.3YMDD变异与补偿变异的同步逆转现象救援治疗过程中,rtL80V/I、rtL180M等补偿变异位点会随着YMDD变异株的逆转而消失。提示补偿变异与YMDD变异存在于同一条序列上。2.基线期影响YMDD变异演化的因素2.1rtL80V/I对YMDD变异逆转的影响按照基线期rt80位点的补偿变异情况将所有患者分为两组：rt80L组（66例）和rt80V/I组（58例）。12周、24周、48周和72周rt80L组的累积YMDD变异逆转发生率为6.1%（4/66）、45.5%（30/66）、65.2%（43/66）、75.8%（50/66）；rt80V/I组的累积逆转发生率分别为6.9%（4/58）、41.4%（24/58）、53.4%（31/58）、62.1%（36/58）。两组比较无显着性差异（χ2=0.694,P=0.405）。2.2rtL180M对YMDD变异逆转的影响按照基线期rt180位点的补偿变异情况将所有患者分为两组：rt180L组（40例）和rt180M组（84例）。12周、24周、48周和72周rt180L组的累积YMDD变异逆转发生率为7.5%（3/40）、50.0%（20/40）、67.5%（27/40）、75.0%（30/40）；rt180M组的累积逆转发生率分别为6.0%（5/84）、40.5%（34/84）、60.0%（47/84）、66.7%（56/84）。两组比较无显着性差异（χ2=3.098,P=0.078）。2.3治疗方法对YMDD变异逆转的影响聚乙二醇干扰素α-2a组（45例）在12周、24周、48周和72周的累积YMDD逆转率分别为7%（3/45）、53%（24/45）、73%（33/45）和91%（41/45）；阿德福韦组（79例）分别为6%（5/79）、38%（30/79）、52%（41/79）和57%（45/79）。两组比较有显着性差异（χ2=3.876,P=0.049）。2.4不同的YMDD变异（YIDD、YVDD）对逆转的影响测序结果显示46例为YVDD变异,60例为YIDD变异,其余17例为YV/IDD混合变异。为了分析不同YMDD类型逆转率的差异,将这17例按照测序峰图主峰处理,其中7例以YVDD为主,按照YVDD处理；10例以YIDD为主,按照YIDD处理。最终YVDD共53例,YIDD共71例。YVDD组（53例）在12周、24周、48周和72周的累积YMDD逆转率分别为7.5%（4/53）、50.9%（27/53）、71.7%（38/53）、79.2%（42/53）,YIDD组（71例）分别为5.6%（4/71）、38.0%（27/71）、50.7%（36/71）、62.0%（44/71）。两组比较无显着性差异（χ2=2.509,P=0.113）。2.5常见补偿变异（rtL80V/I、rtL180M）的数目对YMDD变异逆转的影响按照基线期补偿变异位点个数将所有病例分为三组：A组13例：无补偿变异位点,B组81例：有一个补偿变异位点,C组30例：有2个补偿变异位点。A组（13例）在12周、24周、48周和72周的累积YMDD逆转率分别为15.4%（2/13）、38.5%（5/13）、61.5%（8/13）、69.2%（9/13）；B组（81例）分别为3.7%（3/81）、49.4%（40/81）、66.7%（54/81）、76.5%（62/81）；C组（30例）分别为10.0%（3/30）、30.0%（9/30）、40.0%（12/30）、50.0%（15/30）。三组比较有显着性差异（χ2=4.214,P=0.04）。2.6不同基因型对YMDD变异逆转的影响本研究患者均为B基因型和C基因型,其中B基因型32例,C基因型92例。B基因型患者（32例）12周、24周、48周和72周的累积YMDD逆转率分别为9.4%（3/32）、56.3%（18/32）、75.0%（24/32）、84.3%（27/32）；C基因型患者（92例）分别为5.4%（5/92）、39.1%（36/92）、54.3%（50/92）、64.1%（59/92）。两组比较有显着性差异（χ2=5.194,P=0.023）。2.7基线HBV DNA水平对YMDD变异逆转的影响根据基线HBV DNA水平将患者分为三组：A组39例：HBV DNA<7.0log10IU/mL；B组54例：7.0log1o IU/mL≤HBV DNA<8.0log1o IU/mL；C组31例：HBVDNA≥8.0log10IU/mL。A组（39例）在12周、24周、48周和72周的累积YMDD逆转率分别为7.7%（3/39）、48.7%（19/39）、66.7%（26/39）、74.4%（29/39）；B组（54例）分别为9.3%（5/54）、44.4%（24/54）、57.4%（31/54）、68.5%（37/54）;C组（31例）分别为0.0%（0/31）、35.5%（11/31）、54.8%（17/31）、64.5%（20/31）。三组比较有显着性差异（χ2=6.295,P=0.043）。2.8YIDD与YVDD在选择补偿变异位点上的差异71例YIDD变异的患者有70%（50/71）伴有rtL80V/I变异,而53例（?）YVDD变异的患者有15%（8/53）伴有rtL80V/I变异,两组比较具有显着性差异（χ2=37.314,P<0.001）。71例YIDD变异的患者有44%（31/71）伴有rtL180M变异,而53例YVDD变异的患者100%（53/53）伴有rtLl80M变异,两组比较具有显着性差异（χ2=40.078,P<0.001）。3.YMDD变异的逆转对病毒学和生化学应答的影响为了分析逆转对应答的影响,将患者分为早期逆转组和非早期逆转组。早期逆转定义为：在救援治疗24周内患者体内的HBV准种从以YMDD变异株为主逆转为以野生株为主。而在24周内尚未发生逆转的患者归为非早期逆转组。最终,124例患者有110例可以纳入到此项分析,其中70例为阿德福韦治疗的患者,40例是聚乙二醇干扰素α-2a治疗的患者。剩余14例由于24周PCR阴性而不能纳入分析。3.1.阿德福韦治疗组YMDD变异的逆转对病毒学和生化学应答的影响基于上述定义,阿德福韦治疗的患者有30例为早期逆转组,40例为非早期逆转组。两组患者在性别、年龄、基因型、YMDD变异类型、补偿变异个数和基线期HBV DNA及ALT水平上均无显着性差异。治疗结束时早期逆转组和非早期逆转组患者HBV DNA下降水平有显着性差异（t=-3.255,P=0.002）。非早期逆转组的ALT复常率高于早期逆转组,虽然在统计学上没有显着性差异（χ2=3.717,P=0.054）。另外,非早期逆转组治疗结束HBV DNA检测不到率显着高于早期逆转组（χ2=4.057,P=0.044）。3.2.聚乙二醇干扰素α-2a组YMDD变异的逆转对病毒学和生化学应答的影响基于上述定义,聚乙二醇干扰素α-2a治疗的患者有24例为早期逆转组,16例为非早期逆转组。两组患者在性别、年龄、基因型、YMDD变异类型、补偿变异个数和基线期HBV DNA及ALT水平上均无显着性差异。治疗结束时早期逆转组和非早期逆转组患者HBV DNA下降水平有显着性差异（t=-0.883,P=0.383）。两组患者的ALT复常率无显着性差异（χ2=1.778,P=0.182）。两组患者的HBV DNA检测不到率亦无显着性差异（χ2=0.462,P=0.681）结论：1.在阿德福韦治疗48周内,大部分拉米夫定耐药患者会发生YMDD变异株向野生株的逆转；在聚乙二醇干扰素α-2a治疗过程中也有同样的现象,证明干扰素与阿德福韦一样对拉米夫定耐药的HBV变异株亦无选择压力。2.与初治患者相比,拉米夫定耐药的患者阿德福韦治疗一年的耐药率明显升高,而且阿德福韦耐药突变都发生在YMDD变异逆转之后。3.补偿变异和YMDD变异在同一病毒株上,随着YMDD变异的逆转补偿变异也会发生逆转。4.影响YMDD变异逆转的因素有救援治疗方法、补偿变异的个数、基因型和基线期HBV DNA水平。总得来说,聚乙二醇干扰素α-2a治疗的患者YMDD逆转率更高；合并的补偿变异个数越多YMDD变异越不容易逆转,故补偿变异可以延缓YMDD变异的逆转；C基因型的患者YMDD变异不易逆转；基线期HBVDNA水平较高的患者YMDD变异不易逆转。5. YMDD逆转对病毒学和生化学应答的影响取决于救援治疗方法的不同。阿德福韦治疗过程中,YMDD的早期逆转不利于应答,提示发生早期逆转的患者要及时更改救援治疗方案。而在聚乙二醇干扰素α-2a治疗过程中,逆转对应答似乎没有明显的影响。另外,本研究结果提示聚乙二醇干扰素α-2a不适合用于拉米夫定耐药的救援治疗。6. YIDD和YVDD在补偿变异的选择上有明显差异。YVDD变异的病毒株均合并有rtL180M变异,少部分也合并有rtL80V/I变异；而YIDD变异的病毒株常合并rtLS0V/I变异,少部分合并rtL180M变异,亦有一部分为rtM204I单点变异。
朱明添[9]（2012）在《叶下珠复方联用ADV治疗LRHB的疗效及抗病毒免疫机制的研究》文中提出经过多年实验研究、临床研究、反复筛选、不断优化,本研究采用叶下珠、黄芪、三七、甘草等数种中药组成了叶下珠复方,并拟将其开发为新一代的抗乙肝病毒的新药。在进行叶下珠复方的临床研究前,我们完成体外抗乙肝病毒（HBV）,对HBV转基因小鼠免疫病理模型的干预作用的实验研究,验证了其实验治疗的有效性。在体外抗HBV的研究中,我们选择了2.2.15细胞作为体外模型,HBsAg、HBeAg作为药物效果的筛选靶标,通过MTT法测定药物的细胞毒性浓度,并相应计算出治疗指数来评价药物疗效。结果显示,叶下珠复方在2.2.15细胞中对HBsAg分泌抑制的治疗指数为8.4.因此,叶下珠复方在体外能高效、低毒的抑制HBV的分泌HbsAg和HBeAg。叶下珠复方中、大剂量及ADV在Tg鼠血清HBsAg阴转率分别在给药后第10天、第21天、停药后3天进行比较,差异均无显着性意义,ADV具有减少HBV Tg鼠血清HBV-DNA载量的作用。但停药3天有反跳。叶下珠复方大、中剂量组均有降低HBV Tg鼠血清HBV-DNA载量的作用,尤其以大剂量组效果明显,虽然没有减少到ADV组水平,但治疗前后差异有显着性意义,且在停药后无明显反跳现象,说明叶下珠复方作用持久、平稳。模型组Tg鼠肝脏病理改变类似于临床轻度肝炎表现,随着叶下珠复方剂量的增大,炎症得以缓解。大剂量组的肝板排列整齐,无纤维组织增生,但中央静脉周围轻度围管浸润。叶下珠复方中、大剂量和ADV均能减少肝组织中HbcAg表达,尤其大剂量组明显。叶下珠复方能够上调CD3+、CD4+、CD4+/CD8+,下调CD8+T细胞比值水平,具有正向T淋巴细胞免疫调节作用,尤其以大剂量组效果明显。ADV也具有提高HBV转基因小鼠细胞免疫功能（如CD3+百分比）,但作用相对叶下珠复方弱。运用大、中、小剂量叶下珠复方和ADV均能提高HBV转基因小鼠血清IL-2、TNF-γ含量,与模型组相比有显着的差异。且运用大、中剂量叶下珠复方治疗后IL-2、TNF-Y水平已高于正常对照组。叶下珠中剂量组CD3+、TNF-γ与给药前后HBV-DNA载量的减少呈显着正相关,叶下珠复方大剂量组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的变化与给药前后HBV-DNA减少呈显着正相关。叶下珠复方联合阿德福韦酯（ADV）治疗拉米夫定耐药肝炎（LRHB）52周,ALT复常率、HBV-DNA阴转率、HBeAg阴转率均显着优于单纯使用ADV组,且差异显着（P<0.05或P<0.01）。治疗52周,叶下珠复方联用ADV完全应答率（CR）为25%,显着高于ADV组（10%）,X2=9.07,P<0.01。叶下珠复方联合ADV组治疗52周,患者CD4+百分比和NK细胞均增加,CD3+百分比增加,而两组CD8+百分比减少,并与HBV-DNA载量的减少呈显着正相关。HBV特异型CD8+T细胞用于破坏感染肝细胞,能清除肝内HBV、从而减少细胞内HBV数目,说明叶下珠复方联合ADV能更好改善LRHB患者T淋巴细胞亚群的异常及提高NK细胞的活性,提高抗病毒的疗效。同时能调节免疫功能,使免疫低下或免疫紊乱的调整到正常,显示出较好的抗HBV效果。
苏英,高广甫,李广明,凌宇,高鹏[10]（2011）在《乙肝病毒突变与核苷类药物耐药的研究进展》文中进行了进一步梳理乙型病毒性肝炎是一类严重危害人类身体健康的感染性疾病,全球慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者多达3.6亿,我国占1.2亿,其中近10%的患者可因持续HBV感染而导致肝硬化或肝细胞癌。以拉米夫定为代表的核苷类似物开创了HBV抗病毒治疗的新时代。然而,随着其在国内外广泛临床应用,HBV耐药突变因发生率高、后果严重而成为令临床医师棘手的问题,
二、HBV拉米夫定耐药株多聚酶墓因变异的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HBV拉米夫定耐药株多聚酶墓因变异的研究（论文提纲范文）
（1）慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 核苷(酸)类似物长期抗病毒治疗疗效分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 HBV RT区准种进化模式与核苷类药物抗病毒治疗应答关系的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HBsAg和抗-HBs共存乙肝病毒基因型Ⅰ感染者HBV准种特征及相关文献回顾Meta分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 综述 慢性乙型肝炎患者病毒准种的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）乙型肝炎病毒核苷类似物交叉耐药株RT区变异分析（论文提纲范文）
| 1资料与方法 |
| 2结果 |
| 3讨论 |
（3）使用核苷（酸）类似物治疗的慢性乙型肝炎患者HBV耐药变异分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状 |
| 研究成果 |
| 对象和方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 其他材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 血清生化学指标、HBV血清学标志物和HBV DNA测定 |
| 1.2.2 血清HBV全长RT区nPCR扩增及测序 |
| 1.2.3 序列的生物信息学分析 |
| 1.3 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 临床结果分析 |
| 2.2 HBV耐药变异检测结果分析 |
| 讨论 |
| 3.1 结果讨论 |
| 3.2 核苷类似物耐药的分子机制讨论 |
| 3.2.1 L-核苷类耐药相关的分子通路 |
| 3.2.2 烷基烷络磷酸酯类耐药相关的分子通路 |
| 3.2.3 D-环戊烷类耐药相关的分子通路 |
| 3.2.4 HBV耐药变异的检测 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（4）拉米夫定耐药株感染者基因型、HBV DNA及多聚酶P区基因变异的关系（论文提纲范文）
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
（5）乙型肝炎病毒准种在恩替卡韦补救治疗中的动态演变（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间完成的论文 |
（6）利用PNA-PCR法早期检测乙型病毒性肝炎YMDD耐药变异（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 PNA-PCR法在HBV YMDD耐药基因检测中的敏感性与特异性的评估 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二章 PNA-PCR法在临床耐药检测中的应用：分别用两种方法来检测临床病人YMDD的耐药变异 |
| 1. 病例来源 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 PNA-PCR法检测未经治疗的慢性乙型肝炎患者YMDD自然变异株 |
| 1. 病例来源 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）乙型肝炎病毒基本核心启动子/前核心区和逆转录酶区变异的临床特点与意义研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 HBV BCP/PC 区基因变异特点和基因型特点与疾病进展的相关性分析 |
| 第一节 急性乙肝和慢性乙肝患者 HBV BCP/PC 区基因变异和基因型特点及临床意义分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二节 慢性乙肝轻中度、重度和慢加急性肝衰竭患者 HBV BCP/PC 区基因变异和基因型特点及临床意义分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 HBV 逆转录酶区耐药基因变异特点及临床意义分析 |
| 第一节 1803 例经核苷（酸）类药物治疗的慢性 HBV 感染患者 RT 区耐药相关变异特点及临床意义分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二节 新型多重耐药 HBV 变异株的演变特点及其感染的临床治疗分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 全文总结及创新点 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的代表性论文全文 1 篇 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）拉米夫定耐药的慢乙肝患者救援治疗过程中YMDD变异的演化及其对治疗疗效的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 研究背景 |
| 1. 概述 |
| 2. 慢乙肝患者抗病毒治疗的现状 |
| 3. 耐药的救援治疗 |
| 4. 救援治疗过程中YMDD变异的演化 |
| 5. 研究目的 |
| 第二章 YMDD变异的演化及其对救援治疗疗效的影响 |
| 1. 病例来源 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（9）叶下珠复方联用ADV治疗LRHB的疗效及抗病毒免疫机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 中医药治疗慢乙肝进展 |
| 1.1 对慢乙肝的传统病因、病机和证治的认识 |
| 1.2 中医药抗病毒研究的进展 |
| 1.3 对核苷类药物耐药后中医研究进展 |
| 1.4 对慢性HBV携带者的中医抗病毒认识 |
| 2 叶下珠治疗慢性乙型肝炎研究进展 |
| 2.1 叶下珠属植物资源的初步调查 |
| 2.2 苦味叶下珠的生物学特征 |
| 2.3 苦味叶下珠化学分析及药理作用 |
| 2.4 基础抗病毒实验研究 |
| 2.5 临床研究 |
| 2.6 争议及其原因分析 |
| 2.7 结语与展望 |
| 3 核苷类药物治疗 |
| 3.1 核苷类药物 |
| 3.1.1 拉米夫定 |
| 3.1.2 阿德福韦酯 |
| 3.1.3 恩替卡韦 |
| 3.1.4 替比夫定 |
| 3.1.5 替诺福韦酯 |
| 3.2 核苷（酸）类药物治疗的相关问题 |
| 4 免疫调节治疗 |
| 4.1 病毒清除要靠机体免疫 |
| 4.2 病毒性肝炎的Th1/Th2免疫应答 |
| 4.3 乙型肝炎病毒感染的免疫学分类及对策 |
| 4.4 免疫治疗原则 |
| 4.5 免疫治疗展望 |
| 5 中药抗病毒免疫治疗进展 |
| 5.1 CBV免疫功能和中医辨证分型关系的研究 |
| 5.2 中医药对CHB的免疫调控作用 |
| 5.3 疏肝健脾补肾方药调节CHB免疫功能的研究进展 |
| 6 乙肝病毒感染的诊断及YMDD变异检测方法研究进展 |
| 6.1 乙肝病毒感染的诊断研究进展 |
| 6.2 HBV的基因分析技术 |
| 6.3 HBV YMDD变异检测方法的研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 下珠复方抗乙肝病毒的作用 |
| 1.1 体外抗病毒作用 |
| 1.1.1 材料和方法 |
| 1.1.5 HBsAg. HBeAg的检测 |
| 1.2 结果 |
| 2 叶下珠复方对HBV转基因小鼠的抗病毒和免疫调节作用 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验动物及分组 |
| 2.1.2 药物组成及制备 |
| 2.1.3 给药方法 |
| 2.1.4 实验步骤 |
| 2.1.5 实验内容 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 叶下珠复方对HBV Tg鼠血清HBsAg阴转率的影响 |
| 2.2.2 叶下珠复方对HBV Tg鼠血清HBV-DNA的影响 |
| 2.2.3 叶下珠复方对HBV Tg鼠肝组织病理学的影响 |
| 2.2.4 叶下珠复方对HBV Tg小鼠肝组织HBcAg免疫组化实验结果 |
| 2.2.5 叶下珠复方对HBV Tg小鼠脾淋巴细胞亚群实验的结果 |
| 2.2.6 叶下珠复方对HBV Tg小鼠脾组织上清液细胞因子的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 叶下珠复方对HBV Tg鼠的抗病毒作用 |
| 2.3.2 叶下珠复方对HBV转基因Tg鼠细胞免疫功能的调节作用 |
| 2.3.3 叶下珠复方对HBV Tg鼠血清HBV DNA与脾T淋巴细胞亚群、细胞因子相关性的实验结果 |
| 3 叶下珠复方治疗CBV的疗效 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 病例选择 |
| 3.1.2 治疗措施和疗程 |
| 3.1.3 观察指标 |
| 3.1.4 疗效诊断 |
| 3.1.5 统计学处理 |
| 3.1.6 随机分配方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 入组患者基线情况 |
| 3.2.2 治疗前后血清HBV标志的变化 |
| 3.2.3 治疗前后肝功能(ALT、AST、A/G、SB)复常情况 |
| 3.2.4 疗效 |
| 3.2.5 YMDD基因变异情况 |
| 3.2.6 讨论 |
| 4 叶下珠复方联合阿德福韦酯治疗拉米夫定耐药性肝炎(LRHB)的疗效 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 病例选择 |
| 4.1.2 治疗措施和疗程 |
| 4.1.3 观察指标 |
| 4.1.4 疗效判断 |
| 4.1.5 统计学处理 |
| 4.1.6 随机分配方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 入院患者基线情况 |
| 4.2.2 治疗前后血清HBV标志的变化 |
| 4.2.3 治疗前后肝功能复常情况 |
| 4.2.4 疗效 |
| 4.2.5 3组疗前后T细胞亚群均值变化 |
| 4.2.6 3组治疗前后NK细胞、IL-2均值比较 |
| 4.2.7 3组治疗前后HBV-DNA与免疫功能相关性研究 |
| 4.2.8 3各实验组治疗前后血清HBV-DNA与免疫功能指标的相关性研究结果 |
| 4.5 讨论 |
| 全文结论 |
| 主要创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 附录1 药物对HBV Tg鼠脾T淋巴细胞亚群的影响变化图 |
| 附录2 药物对HBV Tg鼠肝组织病理学的影响病理图片 |
| 附录3 叶下珠复方联合ADV治疗拉米夫定耐药性肝炎前后T细胞亚群变化图 |
| 致谢 |
四、HBV拉米夫定耐药株多聚酶墓因变异的研究（论文参考文献）
- [1]慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究[D]. 范晶华. 昆明医科大学, 2019(02)
- [2]乙型肝炎病毒核苷类似物交叉耐药株RT区变异分析[J]. 滕旭,林乐勋,陈丽玲,梁爽,徐晖,谷鸿喜. 国际检验医学杂志, 2015(09)
- [3]使用核苷（酸）类似物治疗的慢性乙型肝炎患者HBV耐药变异分析[D]. 朱瑞. 天津医科大学, 2014(01)
- [4]拉米夫定耐药株感染者基因型、HBV DNA及多聚酶P区基因变异的关系[J]. 卢丹,吕铁锋,章松平,郭晓凤,武静,吴菲,刘斐. 医学研究杂志, 2013(12)
- [5]乙型肝炎病毒准种在恩替卡韦补救治疗中的动态演变[D]. 邓孝林. 重庆医科大学, 2013(03)
- [6]利用PNA-PCR法早期检测乙型病毒性肝炎YMDD耐药变异[D]. 张迎迎. 南方医科大学, 2013(03)
- [7]乙型肝炎病毒基本核心启动子/前核心区和逆转录酶区变异的临床特点与意义研究[D]. 刘妍. 中国人民解放军军事医学科学院, 2012(10)
- [8]拉米夫定耐药的慢乙肝患者救援治疗过程中YMDD变异的演化及其对治疗疗效的影响[D]. 郑慧珂. 南方医科大学, 2012(04)
- [9]叶下珠复方联用ADV治疗LRHB的疗效及抗病毒免疫机制的研究[D]. 朱明添. 广州中医药大学, 2012(09)
- [10]乙肝病毒突变与核苷类药物耐药的研究进展[A]. 苏英,高广甫,李广明,凌宇,高鹏. 第6届全国疑难及重症肝病大会论文集, 2011