稳定生产高甘露糖基化重组蛋白细胞株的构建

论文摘要

生物医药是一类20世纪80年代开始出现的新型药物,与化学法合成的传统小分子药物相比,其具有更高的特异性,更低的毒副作用和更长的体内半衰期。生物医药为许多传统药物难以治愈的疾病（如癌症,自身免疫疾病等）提供了新的疗法,是现代医药工业的一个极其重要的分支。表达系统在医药蛋白的生产过程中起着至关重要的作用,不同表达系统所具有的不同蛋白翻译后修饰过程使得具有相同氨基酸序列的蛋白可能呈现不完全相同的药代动力学和药理学性质。人胚胎肾细胞293（HEK293）是一种科学研究和工业生产中均较为常用的重组蛋白表达系统,与目前工业上应用最为广泛的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞相比,它不产生能引起人体免疫排斥的糖链结构（如半乳糖-α1,3-半乳糖或N-羟乙酰神经氨酸）,具有更加优异的人体亲和性,但HEK293细胞株仍具有极为复杂的蛋白N糖基化修饰途径,这一途径使得其表达的医药蛋白具有不均一性,进而影响药物质量的稳定性。为生产具有稳定性质的高甘露糖基化的医药蛋白,本实验室已在野生型HEK293细胞株中敲除α1,2-甘露糖苷酶编码基因MAN1A1,MAN1B1得到了一株T-KO细胞株,此细胞株能够生产主要含高甘露糖型N糖的糖基化蛋白,但仍有少量复杂型N糖在此细胞株中合成,为除去此部分复杂型糖链,本研究在T-KO细胞株中敲除了另一α1,2-甘露糖苷酶编码基因MANIC1和β1,2-N乙酰葡糖胺转移酶编码基因MGAT1得到了 QD-KO和QT-KO两株细胞株。为鉴定这两株细胞株所合成N糖糖型,作者进行了凝集素染色,外切糖苷酶处理以及质谱分析,结果均表明QD-KO和QT-KO细胞株中只合成高甘露糖型N糖。为增强QD-KO和QT-KO细胞株的增殖能力,研究中向这两株细胞株中引入了原癌基因MYC和MYCN,对转入MYC/MYCN后的细胞株进行生长曲线测定表明其生长能力的确得到回补,并且对此细胞株中所表达重组蛋白的N糖进行的鉴定表明,MYC和MYCN的引入不影响细胞株表达重组蛋白的糖链结构。所有实验结果均表明,本研究成功在HEK293细胞株的基础上构建了适于生产均一性高甘露糖基化医药蛋白的细胞株。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 任伟伟

导师: 藤田盛久

关键词: 甘露糖苷酶,基因编辑,均一化糖,医药蛋白

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,有机化工

单位: 江南大学

分类号: Q78;TQ464

总页数: 54

文件大小: 2899K

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标签：甘露糖苷酶论文;  基因编辑论文;  均一化糖论文;  医药蛋白论文;