王艳[1]2008年在《鸡核因子-κB受体激活物配基（chRANKL）基因的克隆、表达及生物学活性研究》文中提出核因子-KB受体激活物配基RANKL(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)最早发现于哺乳动物,属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的一员,它参与破骨细胞形成的全过程：分化、融合、生存、激活,被认为是介导各种刺激因子诱导破骨细胞生成及功能信号传导的最终因子。鉴于RANKL在骨代谢中的重要调节作用,本文旨在克隆表达蛋鸡RANKL蛋白,并对其生物学活性进行研究,为进一步研究笼养蛋鸡骨质疏松发生机制提供新的思路。试验Ⅰ、chRANKL编码区基因的克隆与序列分析应用RT-PCR方法从体外培养鸡胚成骨细胞中扩增得到鸡RANKL编码基因(Genbank登录号EF379383),然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定及DNA序列测定。结果表明,扩增得到1203 bp的RANKL序列,扩增序列与GenBank上报道的预测序列具有很高的相似性,达到99.3%,与人、小鼠、犬的一致性分别为55.4%、52%和55.7%,进化树分析结果表明RANKL作为机体内调节骨代谢一种重要细胞因子,在进化中高度保守。RANKL基因的成功扩增为深入研究骨质疏松等代谢性骨病的发病机制及防治开辟广阔的领域。试验Ⅱ、chRANKL的原核表达和纯化设计一对引物用于克隆鸡RANKL成熟蛋白编码基因,然后构建鸡RANKL原核表达载体pET-32a(+)-chRANKL,通过IPTG诱导表达重组鸡RANKL成熟蛋白,经SDS-PAGE电泳分析,原核表达产物为64 kD的重组蛋白,并主要以包涵体形式存在,western blot分析结果显示,表达得到的重组蛋白具有良好的抗原结合活性。试验Ⅲ、chRANKL诱导鸡骨髓细胞形成破骨样细胞的研究建立简便有效的鸡胚骨髓破骨样细胞的诱导培养体系,获得高密度高纯度的破骨细胞,为进一步研究笼养蛋鸡骨质疏松症的发病机理奠定基础。剔取18日龄鸡胚胫骨和肱骨,用注射器抽取α-MEM培养液冲洗骨髓腔,获取的细胞悬液接种于培养板。2h后吸取未贴壁细胞,离心重悬,使细胞密度为2×106/mL,接种于培养板,加入诱导剂RANKL和M-CSF,成功获得具有破骨细胞特征的细胞：细胞大,多核；TRAP染色阳性,在骨片表面形成吸收陷窝；这表明chRANKL能诱导鸡破骨细胞前体细胞形成OLC,说明chRANKL在鸡OC分化、成熟过程中起重要作用。但加入chOPG后,则大大降低了OLC的形成以及OLC的骨吸收作用,表明chOPG阻断了RANKL介导的OC分化和骨吸收作用。试验Ⅳ、chRANKL在毕赤酵母中的表达和生物学活性研究设计另一对引物用于克隆鸡RANKL成熟蛋白编码基因,然后构建鸡RANKL真核表达载体pPICZa-A-chRANKL,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物,表达产物相对分子量为54kDa,表达量约为220mg/L,经Western印迹验证,表达得到的蛋白能够与抗人RANKLIgG反应,表明通过酵母表达得到的蛋白具有较好的免疫原性。试验V、chRANKL酵母冻干产物体内、体外对成熟破骨细胞的影响50羽青年ISA蛋鸡分为5组,A组为对照组,只注射生理盐水,B、C、D、E组分别注射剂量为0.01 mg/kg,0.05 mg/kg,0.1 mg/kg,0.5 mg/kg的RANKL酵母表达冻干产物水溶物。2h后静脉采血,测定血浆钙离子浓度。同时将浓度为2 ng/mL,6ng/mL,10 ng/mL分别加入体外培养的成熟破骨细胞中,培养第3d观察骨吸收陷窝的变化,并测定培养液中钙离子浓度。结果表明,体内注射RANKL后,血浆钙离子浓度升高,且呈剂量依赖性增加。不同浓度的RANKL加入到体外培养的成熟破骨细胞能使骨吸收指数和骨吸收陷窝面积均呈剂量依赖性增加,同时钙离子浓度也有显着差异。结论：RANKL除了能诱导形成破骨样细胞外,也能刺激成熟破骨细胞,使之骨吸收功能增强。
刘洋[2]2003年在《人破骨细胞分化因子（ODF）重组表达载体的构建及其表达的初步研究》文中研究指明破骨细胞分化因子(osteoclast differentiation factor，ODF)是近年来新发现的重要的骨代谢调节因子，它已经成为代谢性骨病领域的研究热点。ODF作用复杂，无论在正常的生理状态下，还是在异常的病理状态下，其效应实现的途径，效应的调节等机制尚未完全阐明。用基因工程制备大量的ODF，可以为进一步的研究提供物质基础。 本研究选择了具有功能活性的人ODF可溶片段(aa 145-317)cDNA，分别在大肠杆菌和哺乳动物细胞中进行了克隆表达。大肠杆菌表达系统操作简便，能够快速获得蛋白，可制备相应的抗体。哺乳动物细胞表达的蛋白有优良活性，可以满足功能研究的需要。 在大肠杆菌表达系统中，PCR扩增人ODF可溶片段cDNA，然后将扩增片段插入到原核表达载体pET42a的多克隆位点——PshA Ⅰ酶切位点处，构建为重组融合表达载体pET42a／ODF。经酶切和测序鉴定后，重组融合表达载体转化E．Coli BL21(DE3)进行表达。超声裂解细菌，SDS-PAGE鉴定裂解物中是否含有重组融合ODF蛋白。Western Blot鉴定融合蛋白是否具有免疫原性。 在哺乳动物细胞表达系统中，为提高蛋白表达量，避免外源蛋白对细胞的毒性，构建了分泌型表达载体pcDNA／asODF-GFP。PCR扩增人ODF可溶片段cDNA时，在上游引物5’端引入了一段翻译增强序列和一段分泌信号序列。经修饰扩增后的ODF cDNA片段与真核表达载体pcDNA3.1／CT-GFP-TOPO连接，构建为重组分泌表达载体。 为利用二氢叶酸还原酶基因(dhfr)作为筛选、扩增标记来提高目的基因的表达量，本研究还构建了dhfr重组表达载体pcDNA／DHFR-GFP。PCR分别扩增弱化的SV40早期基因启动子序列、小鼠二氢叶酸还原酶cDNA序列、SV40polyA信号序列，然后利用引物中设计的互补碱基配对，经PCR重迭延伸扩增，将叁硕士研究生学位论文不开履运履属.兰不夏颧礁潺l录功能丽-丽下翁醉玩开面又乘蔽海丽peDNA3.l/CT一GFP的Sspl酶切位点。 将ODF重组表达载体和DHFR重组表达载体共转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(c HO一dhfr一)，观察报告基因(GFP)的绿色荧光确定转染是否成功。以不含次黄嗓吟(H)、胸腺啥睫脱氧核昔(T)的培养液培养筛选，氨甲蝶吟(MTX)梯度加压扩增，有限稀释法克隆，得到稳定转染的阳性细胞。提取细胞总RNA和基因组DNA进行RT一PcR和PCR鉴定目的基因的整合及转录。 本试验在大肠杆菌中成功克隆表达了人ODF可溶片段cDNA，表达蛋白具免疫原性，为制备人ODF抗体奠定了基础。成功构建了人ODF的哺乳动物细胞分泌表达载体和含有扩增标记基因的表达载体，并成功转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞。实验目前正在进行高表达细胞株的筛选及表达蛋白的检测等工作。
肖海龙[3]2005年在《破骨细胞形成抑制因子（OPG）的表达纯化及功能研究》文中提出破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF或称osteoprotrgerin,OPG)是最近发现的具有降血钙作用和防止骨流失的一种新的可以调节骨密度的分泌型糖蛋白。OPG作为一种新发现的蛋白质,具有很高的研究意义和开发价值。目前,OPG主要是通过CHO细胞表达体系来表达的,但这种方法表达量低,且成本高。所以我们的目标是利用基因工程技术,探索一种或几种理想的表达系统用以大量制备具有生物活性的重组蛋白。 破骨细胞形成抑制因子(OPG)对骨的重建与再吸收有重要调节作用,其TNF结构区行使抑制破骨细胞形成与活性的功能。通过PCR将该区基因片段扩增出来,命名为OPG-T。为了探讨利用大肠杆菌大规模生产重组OPG蛋白的可能性,将OPG、OPG-T及突变体基因OPG-372插入表达载体PET-28a质粒多克隆位点,重组质粒转入大肠杆菌BL21中分别进行表达研究。结果表明OPG和OPG-372存大肠杆菌中表达量较低。而OPG-T能得到高效表达。表达产物以包涵体形式存在,包涵体经变性复性后,亲合层析获得重组蛋白。纯化的产物作为抗原免疫兔,得到较高特异性的兔源多克隆抗体。利用小鼠降血钙实验检测所表达的重组蛋白OPG-T的活性,结果表明该蛋白有一定的生物活性。 由于大肠杆菌体系表达OPG不是太理想,我们将破骨细胞形成抑制因子OPG及变体OPG-372基因克隆于昆虫病毒转移载体pBacPAK8中,获得重组转移载体pBacPAK8-OPG、pBacPAK8-OPG-372,将它们与线性化的Bm-BacPAK6病毒DNA共转染家蚕细胞,经体内重组,挑斑筛选,获得Bm-OPG和Bm-OPG-372重组病毒。经Southern Blot分析,表明两种重组病毒基因组中分别含OPG和OPG-372基因。将Bm-OPG和Bm-OPG-372重组病毒分别在家蚕细胞和幼虫表达,SDS-PAGE和Western blot分析结果表明OPG、OPG-372基因被表达,并发现家蚕细胞表达的rh-OPG、rh-OPG-372分子量分别约为43kD和42kD,而在家蚕幼虫的表达产物分别约为55kD和46kD,rh-OPG在家蚕幼虫的表达产物还有二聚体的形式。 为了对OPG在家蚕表达体系中的表达情况进行进一步的研究,我们利用
张弛[4]2004年在《人破骨细胞形成抑制因子/骨保护素基因克隆、重组表达和初步的生物学活性研究》文中指出从培养的人肝细胞抽提总RNA，用RT-PCR方法扩增得到人破骨细胞形成抑制因子(Osteoclastogenesis Inhibitory factor，OCIF)，或称骨保护素(osteoprotegerin，OPG)成熟肽编码基因序列。RT-PCR所得产物与pMD18-T连接，转化大肠杆菌K802，筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-OCIFm，对所获得的含OCIF／OPG活性结构域编码的重组质粒进行DNA序列分析，结果与GenBank报道序列完全一致。双酶切重组克隆质粒pMD18-OCIFm，得到OCIF／OPG成熟肽基因，将其定向插入同样双酶切的pProEX-HTa载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)。筛选得到阳性重组表达子后，用IPTG诱导表达。所表达的产物经SDS-PAGE分析可见在相对分子量80kD处出现一条新条带，与预期OCIF／OPG融合蛋白的分子量一致。用OCIF／OPG特异性—抗行Western Blot，证实重组表达产物能与其特异性结合。以Ni~(2+)亲和层析柱初步纯化的表达产物，能诱导体外培养的小鼠破骨细胞凋亡，并呈剂量依赖性。 应用Stratagene BacterioMatch two hybrid system，以pTRG构建编码TRAIL细胞外可溶性区域序列融合表达表达质粒；以pBT构建编码DR4，DR5，OCIF／OPG等的细胞外区域序列融合表达质粒。重组质粒分别相应共转化报告菌株XL1-Blue MRF，报道基因产物以抗羧苄青霉素和β-半乳糖苷酶活性作为转录激活的指标。所构建的pTRG-TRAIL与pBT-DR4，pTRG-TRAIL与pBT-DR5及对照组分别共转化后在高浓度羧苄青霉素(500 μg／ml)筛选下宿主菌呈转录激活状态，pTRG-TRAIL与pBT-OPG组共转化后在低浓度羧苄青霉素(250 μg／ml)筛选下宿主菌呈转录激活状态，用X-Gal-PETG平皿可以进一步验证阳性克隆。对照组pTRG-TRAIL与pBT-LGF2，pBT-DR4与pTRG-Gal11，pBT-DR5与pTRG-Gal11或pBT-OPG与pTRG-Gal11四组共转化后呈阴性。由此直接证实了OCIF／OPG与TRAIL能直接结合，但亲和力较TRAIL与DR4、DR5要小。另外，由于所用的双杂交序列皆为编码这些蛋白质的细胞外区域，而这些蛋白质本身的相互作用已有其他报道验证，所以证实了细菌双杂交系统可以用于细胞外蛋白质的相互作用研究。OCIF／OPG与张弛:OCIF/OPG基因的克隆、表达和活性TRAIL的相互作用，在用OCIF/OPG重组表达产物中和TRAIL诱导人胰腺癌SW199O细胞凋亡的活性中也被证实。 本课题成功获得了人OCIF/o PG成熟肤基因，并实现了在大肠杆菌中的重组融合表达;OC正/o PG可与TRAIL直接相互作用，但亲和力较TRAIL与DR4、DRS要低;重组表达的OCIF/OPG可诱导成骨细胞凋亡，并能抑制TRAIL对肿瘤细胞的细胞毒效应，由此建立了初步的OCIF/OPG蛋白的生物学活性测定方法，为进一步的研究奠定了基础。
参考文献：
[1]. 鸡核因子-κB受体激活物配基（chRANKL）基因的克隆、表达及生物学活性研究[D]. 王艳. 南京农业大学. 2008
[2]. 人破骨细胞分化因子（ODF）重组表达载体的构建及其表达的初步研究[D]. 刘洋. 天津医科大学. 2003
[3]. 破骨细胞形成抑制因子（OPG）的表达纯化及功能研究[D]. 肖海龙. 浙江大学. 2005
[4]. 人破骨细胞形成抑制因子/骨保护素基因克隆、重组表达和初步的生物学活性研究[D]. 张弛. 第二军医大学. 2004